專利名稱：草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及預(yù)防草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓病、敗血病、赤皮病的疫苗，本 發(fā)明還涉及該疫苗的制備方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)本項(xiàng)目委托廣東省科技情報(bào)研究所查新檢索國(guó)外文獻(xiàn)、專利結(jié)果未見(jiàn)有草魚(yú)病疫 苗或有關(guān)魚(yú)蝦爛鰓、敗血、赤皮等病疫苗的研發(fā)應(yīng)用報(bào)導(dǎo)。國(guó)內(nèi)從70年代開(kāi)始，珠江水產(chǎn)研 究所首先利用病魚(yú)肝、胰、腎等組織制備組織疫苗，免疫草魚(yú)能有效預(yù)防草魚(yú)出血、爛鰓、 赤皮、腸炎等病發(fā)生，但是該法存在一定缺點(diǎn)1、必須取材于發(fā)病魚(yú)，原材料受限；2、質(zhì) 量不穩(wěn)定。80年代后在全國(guó)范圍開(kāi)始草魚(yú)出血病滅活疫苗、活疫苗研發(fā)，并獲得成功。四川 大學(xué)、廣東省藥物研究所與廣東省水產(chǎn)養(yǎng)技術(shù)推廣總站、武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所、湖南草魚(yú) 免疫技術(shù)協(xié)作組等單位研發(fā)過(guò)草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓病、赤皮病、腸炎病疫苗；并投入過(guò)中試，試 用后養(yǎng)殖成活率提高至70%以上。但是，涉及本項(xiàng)草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活 疫苗的研究與應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗純正抗原培育，"三病"抗原及佐劑 的合理配制；克服全菌滅活疫苗免疫力低的不足。本發(fā)明提供一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、 赤皮三聯(lián)滅活疫苗，包括抗原和佐劑，其特征在于所述抗原為如下抗原組合物柱狀屈橈桿 菌培養(yǎng)物、嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、螢光極毛桿菌培養(yǎng)物，所述佐劑為MONTANIDE ISA 763A VG和白油，其中柱狀屈撓桿菌培養(yǎng)物20 30億CFU/ml， 30 39%，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物 80億CFU/ml ， 8%，螢光極毛桿菌培養(yǎng)物80億CFU/ml ， 10%，佐劑MONTANIDE ISA 763A VG 14%和白油10%。
本發(fā)明還提供該種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于 該方法包括
(1)柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物的制備 a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)；
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取培養(yǎng)菌種，劃線接種于胰蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，28"C培養(yǎng) 48h，挑取至少5個(gè)假樹(shù)根狀菌落，接種于胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，置28'C擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；C制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的菌種按胰蛋白胨培養(yǎng)基量2%接種到培養(yǎng)罐，以恒溫28°C、 6M2/h的通氣量培養(yǎng)20 24h收獲20 30億CFU/ml培養(yǎng)物；
d純粹檢驗(yàn)、活菌計(jì)數(shù)在培養(yǎng)菌液中，取樣，分別接種適宜生長(zhǎng)培養(yǎng)基斜面和硫乙醇 酸鹽培養(yǎng)基小管各二支，每種培養(yǎng)基其中一支置37。C,另一支置25t:培養(yǎng)，觀察3 5天， 菌種生長(zhǎng)應(yīng)純粹，采用IO倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度接種適宜生長(zhǎng)瓊脂平板，每個(gè)稀釋度 接種3個(gè)，每個(gè)接種0.2ml，使菌液均勻分布，晾干后翻轉(zhuǎn)平板，28'C培養(yǎng)48h;選擇菌落在 40 200個(gè)之間計(jì)數(shù)，然后將平板平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)除以2，作為配苗參考；
e滅活按細(xì)菌培養(yǎng)物體積比(V/V)加入終濃度為0.02%的硫柳汞溶液，30'C滅活2天。
f滅活檢驗(yàn)取經(jīng)滅活的細(xì)菌培養(yǎng)物樣品，每個(gè)樣品lml，接種于50ml胰蛋白胨培養(yǎng)基 中，28°C ，培養(yǎng)2天，再?gòu)呐囵B(yǎng)物中取樣，接種胰蛋白胨培養(yǎng)基瓊脂斜面2支，每支接種0.2ml， 28'C下培養(yǎng)3 5天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)；
(2) 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物的制備
A菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干的嗜水氣單胞菌稀釋后，接種于蛋白胨 悟養(yǎng)基培養(yǎng)；
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取復(fù)壯種子劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，置28'C培養(yǎng) 48h，挑取單個(gè)形成圓整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黃色，并有特殊氣味，不產(chǎn) 色素的菌落至小5個(gè)，接種于蛋白胨培養(yǎng)基，28'C下擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；
c制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的種子按培養(yǎng)基量2%接種量接種置種子罐，以恒溫28'C、 40L/min的通氣量，攪拌培養(yǎng)20h，再接種置發(fā)酵罐,10M3/h通氣量，攪拌培養(yǎng)20h，收獲 80億CFU/ml以上培養(yǎng)物；
d純粹檢驗(yàn)、活菌計(jì)數(shù)與"柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物純粹、活菌計(jì)數(shù)"方法相同；
e滅活按嗜水氣單胞菌菌液體積比(V/V)加入終濃度為0.2%的甲醛溶液，37t滅活2天。
f滅活檢驗(yàn)取經(jīng)滅活的嗜水氣單胞菌菌液，每個(gè)樣品lml，接種于50ml蛋白胨培養(yǎng)基 中，28'C下培養(yǎng)3天，再?gòu)牡鞍纂伺囵B(yǎng)物中取樣，接種蛋白胨瓊脂斜面2支，每支接種0.2ml 在28'C下培養(yǎng)3 5天，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
(3) 螢光極毛桿菌培養(yǎng)物的制備
A菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干螢光極毛桿菌種稀釋后，接種于蛋白胨
5培養(yǎng)基培養(yǎng)；
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取復(fù)壯的種子，劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)培養(yǎng)，挑取
置28'C培養(yǎng)48h，挑取單個(gè)圓形微凸，表面光滑，邊緣整齊，灰白色或黃白色菌落至少5個(gè)， 接種于蛋白胨液體培養(yǎng)基，28'C，擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；
c制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的種子按蛋白胨培養(yǎng)基量2%接種量接種置種子罐，以恒溫 28°C、 40L/min通氣量，攪拌培養(yǎng)后20h，再接種置發(fā)酵罐，10M3/h通氣量，拌攪培養(yǎng)20h 收獲80億CFU/ml以上培養(yǎng)物；
d純粹檢驗(yàn)、活菌計(jì)數(shù)與"柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物純粹、活菌計(jì)數(shù)"方法相同； e滅活按菌液體積比(V/V)加入甲醛溶液，使甲醛溶液最終濃度為0.24%， 37°C，滅 活3天；
f滅活檢驗(yàn)與"嗜水氣單胞菌滅活檢驗(yàn)"方法和結(jié)果相同；
(4)配苗、乳化在水相罐中配備生理鹽水28% 19%,加入檢驗(yàn)合格的30 39%柱 狀屈橈桿菌培養(yǎng)物，8%嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、10%螢光極毛桿菌培養(yǎng)物，攪拌均勻后；加入 滅菌的14。/。MONTANIDEISA763AVG和10%白油混合佐劑，充分混勻后用管線式剪切機(jī)乳 化成爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗。
本發(fā)明的有益效果是，能批量提供安全、有效、質(zhì)量可控的草魚(yú)爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián) 滅活疫苗。該疫苗為白色油乳劑，注射免疫草魚(yú)能延長(zhǎng)抗原在組織內(nèi)的貯存時(shí)間，使抗原緩 慢降解和釋放，增強(qiáng)抗原所激發(fā)的抗體應(yīng)答；同時(shí)促進(jìn)免疫細(xì)胞的協(xié)同作用，從而增強(qiáng)草魚(yú) 對(duì)爛鰓病、敗血病和赤皮病綜合免疫功能，免疫草魚(yú)后爛鰓、敗血、赤皮的免疫保護(hù)率都達(dá) 80%以上。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 :
疫苗批號(hào)2009001 產(chǎn)量400L
1.制造疫苗的菌種
(1) 柱狀屈橈桿菌(Cyo; /2"ga Co/www^)由珠江水產(chǎn)研究所鑒定、保存。1998重新 鑒定檢驗(yàn)，驗(yàn)證該菌種可作草魚(yú)爛鰓病疫苗生產(chǎn)菌種。生產(chǎn)使用菌種代次為B代內(nèi)。保存條 件凍干菌種在4'C保存期為8年。由珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病中心保存，發(fā)放；
(2) 嗜水氣單胞菌"m^omw/^t/ra;7Mfl) 2002年珠江水產(chǎn)研究所從廣東省增城市三， 江鎮(zhèn)患病草魚(yú)中分離、鑒定、保存；生產(chǎn)用菌種代次為25代內(nèi)。保存條件凍干菌種在4'
6C環(huán)境中8年。由珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病中心保存，發(fā)放；
(3)螢光極毛桿菌(Pwwfito附o"ay ^Zwwece附)1998年從江西南昌縣壩上分離到草魚(yú)赤 皮病病原菌螢光極毛桿菌JP802菌株，由珠江水產(chǎn)研究所鑒定和檢驗(yàn)，菌種可作草魚(yú)赤皮疫 苗生產(chǎn)菌種；使用代次為引進(jìn)后第25代內(nèi)。保存條件凍干菌種在4'C，保存期為8年。由 珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病中心保存，發(fā)放。
2. 細(xì)菌培養(yǎng)基
(1) 柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)胰蛋白胨0.5%,酵母粉0.05%，牛肉膏 0.02%,乙酸鈉0.02%，碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH值至7.4。胰蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉；
(2) 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)蛋白胨1%、牛肉膏0。3%、氯化鈉0.25%、 酵母粉0.05%、葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀0.1%， pH7.4，蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基加入2%瓊脂 粉；
(3) 螢光極毛桿菌培養(yǎng)基按重量百分比計(jì)蛋白胨1%、牛肉膏0.4%、氯化鈉0.3%、 葡萄糖0.5%，磷酸氫二鉀0.1%，酵母粉0.05%、 pH7.5，蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基加入2%瓊脂 粉。
3. 疫苗制造及半成品檢驗(yàn) (1)柱狀屈橈桿菌菌液制備
a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基，28t:下培養(yǎng)24h，再 置搖床振動(dòng)培養(yǎng)24h;
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取液狀菌種，劃線接種于胰蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，置28'C培 養(yǎng)48h，挑取至少5個(gè)單獨(dú)，黃色、假樹(shù)根狀擴(kuò)散型的菌落，接種于胰蛋白胨液體培養(yǎng)基， 置28"C,擴(kuò)大培養(yǎng)成3L種菌；
c菌種的純粹檢驗(yàn)菌種取樣后置4'C冰箱暫存，樣品分別接種于胰胨培養(yǎng)基斜面，硫乙 醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)小管各二支，胰蛋白胨培養(yǎng)基斜面、乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管各一支置37。C; 另一支置25'C,培養(yǎng)3 5天，觀察生長(zhǎng)純粹；
d制苗菌液培養(yǎng)配胰蛋白胨培養(yǎng)150L，加入0.1%植物油消泡劑。116'C下滅菌30min, 待罐中培養(yǎng)基溫度下降到29。C，接入3L菌種。然后輸入過(guò)濾除菌空氣，氣量6M2/11， 28±1°C， 培養(yǎng)21h。收獲柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物；
e制苗菌液純粹檢驗(yàn)和活菌計(jì)數(shù)將柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物樣品，接種于T.G小管、胰蛋 白胨斜面各二支，每支0.2ml。 T.G小管、胰蛋白胨斜面各一支置37t:， 一支置25'C培養(yǎng)， 另取樣0.2ml接種酪胨瓊脂培養(yǎng)基(G.P)置25'C，均培養(yǎng)觀察3 — 5天，生長(zhǎng)應(yīng)純粹。取柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物lml,用滅菌蒸餾水作10倍系列稀釋，選擇第6、第7管稀釋管，各接胰 胨瓊脂平板3個(gè)，每個(gè)接種0.2ml，使菌液均勻分布，晾干后翻轉(zhuǎn)平板，28'C培養(yǎng)48h。選擇 第7管，平均50個(gè)菌落，乘以稀釋倍數(shù)除以2得25億CFU/ml;
f柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物滅活按菌液體積比(V/V)加入硫柳汞鈉溶液，使硫柳滎的最 終濃度為0.02%，在3(TC滅活2天。滅活期間滅活罐抖攪；
g柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物滅活檢驗(yàn)抽取lml滅活菌液，接種于50ml， 0.5%胰蛋白胨培 養(yǎng)基小瓶，置28"C下培養(yǎng)3天，然后從50ml小瓶取樣移植接種胰胨培養(yǎng)基斜面二支，每支 接種0.2ml， 28'C下培養(yǎng)5天，觀察無(wú)菌生長(zhǎng)。 (2)嗜水氣單胞菌菌液制備
a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干的嗜水氣單胞菌稀釋后，接種于蛋白胨 培養(yǎng)基的斜面若干支；28'C培養(yǎng)24h;
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取斜面菌種，劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，置28'C培養(yǎng) 24h，挑取至少5個(gè)單獨(dú)，形成圓整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黃色，并有特殊 氣味，不產(chǎn)色素的菌落，接種于蛋白胨培養(yǎng)基，28'C下擴(kuò)大培養(yǎng)成0.7L種子；
c菌種的純粹檢驗(yàn)菌種取樣后置4C冰箱保存，樣品接種蛋白胨瓊脂斜面、接種硫乙酸 鹽培養(yǎng)基小管T.G小管各二支，蛋白胨培養(yǎng)基斜面、乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管各一支置37'C;另 一支置25。C，培養(yǎng)3 5天，觀察生長(zhǎng)純粹；
d制苗用菌液制備配蛋白胨培養(yǎng)基35L，加入1%消泡劑，116'C下滅菌30min，待罐中 培養(yǎng)基溫度下降到29'C，接入0.7L菌種。然后輸入過(guò)濾除菌空氣，40L/min的通氣量，攪拌 培養(yǎng)，28±1°C，培養(yǎng)20h。收獲嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物；
e純粹檢驗(yàn)及活菌計(jì)數(shù)將嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物樣品，接種于T.G小管、蛋白胨斜面各 二支，每支0.2ml。 T.G小管、蛋白胨斜面各一支置37°C， 一支置25'C培養(yǎng)，另取樣0.2ml 接種G,P培養(yǎng)基置25t;，均培養(yǎng)觀察3 — 5天，生長(zhǎng)應(yīng)純粹。取嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物lml，用 滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋,選擇第7管稀釋管，接蛋白胨瓊脂平板3個(gè)，每個(gè)接種0.2ml， 使菌液均勻分布，晾干后翻轉(zhuǎn)平板，28'C培養(yǎng)48h。選擇第7管，平均186個(gè)菌落，乘以稀 釋倍數(shù)除以2得93億CFU/ml;
f嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活接嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物體積比(V/V)加入甲醛溶液，使甲 醛溶液最終濃度為0.2%，在37'C下滅活2天；
g嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物滅活檢驗(yàn)取滅活的嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物樣品lml，接種于50ml 蛋白胨培養(yǎng)基中，28'C下培養(yǎng)3天，再?gòu)牡鞍纂伺囵B(yǎng)物中取樣，接種蛋白胨瓊脂斜面2支，
8每支接種0.2ml在28'C下培養(yǎng)3 5天，無(wú)菌生長(zhǎng)。
(3) 螢光極毛桿菌菌液制備
a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干的螢光極毛桿菌稀釋后，接種于蛋白胨 培養(yǎng)基的斜面若千支；28' C培養(yǎng)24h;
b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取斜面菌種，劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，置28'C培養(yǎng) 24h，挑取至少5個(gè)單獨(dú)，圓形微凸，表面光滑，邊沿整齊灰白色或黃白色菌落，接種于蛋白 胨培養(yǎng)基，28'C下擴(kuò)大培養(yǎng)成0.8L種子；
c菌種的純粹檢驗(yàn)菌種取樣后置4'C冰箱保存，樣品接種蛋白胨瓊脂斜面、接種硫乙酸 鹽培養(yǎng)基小管(T.G)小管各二支，蛋白胨培養(yǎng)基斜面、乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管各一支置37'C; 另一支置25'C，培養(yǎng)3 5天，觀察生長(zhǎng)純粹；
d制苗用菌液制備配蛋白胨培養(yǎng)基40L，加入1%消泡劑，116'C下滅菌30min，待罐中 培養(yǎng)基溫度下降到29'C，接入0。8L菌種。然后輸入過(guò)濾除菌空氣，40L/min的通氣量，攪拌 培養(yǎng)，28±rC，培養(yǎng)20h。收獲嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物；
e純粹檢驗(yàn)及活菌計(jì)數(shù)將螢光極毛桿菌培養(yǎng)物樣品，接種于T.G小管、蛋白胨斜面各 二支，每支0.2ml。 T.G小管、蛋白胨斜面各一支置37°C， 一支置25'C培養(yǎng)，另取樣0.2ml 接種(G.P)置25。C，均培養(yǎng)觀察3 — 5天，生長(zhǎng)應(yīng)純粹。取螢光極毛桿菌培養(yǎng)物lml，用滅 菌生理鹽水作10倍系列稀釋，選擇第7管稀釋管，接蛋白胨瓊脂平板3個(gè)，每個(gè)接種0.2ml， 使菌液均勻分布，晾干后翻轉(zhuǎn)平板，28'C培養(yǎng)48h。選擇第7管，平均178個(gè)菌落，乘以稀 釋倍數(shù)除以2得89億CFU/ml;
f螢光極毛桿菌培養(yǎng)物滅活接螢光極毛桿菌培養(yǎng)物體積比(V/V)加入甲醛溶液，使甲 醛溶液最終濃度為0.24%， 37'C滅活3天；
g螢光極毛桿菌培養(yǎng)物滅活檢驗(yàn)取滅活的螢光極毛桿菌養(yǎng)物樣品lml，接種于50ml蛋 白胨培養(yǎng)基中，28'C下培養(yǎng)3天，再?gòu)牡鞍纂伺囵B(yǎng)物中取樣，接種蛋白胨瓊脂斜面2支，每 支接種0,2ml在28'C下培養(yǎng)3 5天，無(wú)菌生長(zhǎng)。
(4) 配苗、乳化
a油相罐滅菌將56L MONTANIDE ISA 763AVG， 40L白袖，司本1L灌入油相罐中拌 勻后12rC滅菌30min，冷卻至15'C;
b水相罐滅菌配生理鹽水86L，加入吐溫1L拌勻后121'C滅菌30min，冷卻至15'C;
c配苗將144L柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物、32L嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、40L螢光極毛桿菌培 養(yǎng)物加入置水相罐中與生理鹽水充分混勻后，加入至乳化罐中與MONTANIDE ISA763A VG和白油混合佐劑混合；
d乳化分裝開(kāi)動(dòng)管線式剪切機(jī)乳化60min后，定量分裝置疫苗，加蓋密封，4'C保存。
4.疫苗成品檢驗(yàn)
物理性狀白色均勻乳劑，靜置一段時(shí)間后，上層白色乳劑、底部為水沁出層。振搖后 呈均勻乳狀液。
無(wú)菌檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版、第三部附錄15頁(yè)進(jìn)行，檢驗(yàn)結(jié)果無(wú) 菌生長(zhǎng)。
汞類(lèi)殘留量測(cè)定按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版、第三部附錄24頁(yè)進(jìn)行，檢驗(yàn)
結(jié)果汞類(lèi)殘留量0.0074%。
甲醛含量測(cè)定按《中華人民共和國(guó)獸藥典》2005年版、第三部附錄25頁(yè)進(jìn)行，檢驗(yàn)結(jié)
果甲醛殘留量0.011%。
安全檢驗(yàn)每批疫苗隨機(jī)抽樣3瓶，混合均勻后，以0,2ml/尾，腹腔注射體重13g/尾
草魚(yú)20尾，放水簇箱飼養(yǎng)觀察15天，免疫魚(yú)應(yīng)全部存活，沒(méi)有不良反應(yīng)。
效力檢驗(yàn)用13g左右的健康草魚(yú)60尾，各肌肉或腹腔注射草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤
皮三聯(lián)滅活疫苗0.2ml，在28'C的水體中飼養(yǎng)9天后，連同條件相同的對(duì)照草魚(yú)60尾，各隨
機(jī)分成三個(gè)攻毒試驗(yàn)組；每個(gè)攻毒試驗(yàn)組，免疫魚(yú)20尾、對(duì)照魚(yú)20尾。
草魚(yú)爛鰓病效力檢驗(yàn)免疫9天后用柱狀屈橈桿菌強(qiáng)毒株腹腔注射攻毒，每尾注射0.88
億個(gè)菌，對(duì)照魚(yú)組草魚(yú)死亡18尾，死亡率90%;免疫魚(yú)組死亡2尾，死亡率10%;用以下
公式計(jì)算免疫魚(yú)組免疫保護(hù)率為88.8%。
免疫保護(hù)率=對(duì)照組魚(yú)的死亡率-免疫組的死亡^ 100% 光僅 對(duì)照組魚(yú)的死亡率
草魚(yú)敗血病效力檢驗(yàn)免疫12天后用嗜水氣單胞菌強(qiáng)毒株腹腔注射攻毒，每尾注射O。
14億個(gè)活菌，對(duì)照組草魚(yú)死亡15尾，死亡率75%;免疫魚(yú)組死亡l尾，死亡率5%;用以上
,入
草魚(yú)赤皮病效力檢驗(yàn)免疫12天后用螢光極毛桿菌強(qiáng)毒株腹腔注射攻毒，每尾注射l億
個(gè)活菌對(duì)照組草魚(yú)死亡13尾，死亡率65%;免疫魚(yú)組死亡l尾，死亡率5%;用以上公式計(jì) 算免疫魚(yú)組免疫保護(hù)率為92.3%。
么、式計(jì)算免疫魚(yú)組免疫保護(hù)率為93.3%
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權(quán)利要求
1.一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗，包括抗原和佐劑，其特征在于所述抗原為如下抗原組合物柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物、嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、螢光極毛桿菌培養(yǎng)物。
2. 權(quán)利要求1所述一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述佐劑為MONTANIDE ISA 763A VG和白油。
3. 權(quán)利要求2所述一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于所述組 分按體積百分比計(jì)如下-柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物20 30億CFU/ml， 30 39%， 嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物80億CFU/ml ， 8%， 螢光極毛桿菌培養(yǎng)物80億CFU/ml ， 10%， MONTANIDE ISA 763A VG 14%, 白油10%。
4. 一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟將柱狀 屈橈桿菌培養(yǎng)物，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、螢光極毛桿菌培養(yǎng)物按比例混合，加入生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝?，加入MONTANIDE ISA 763A VG和白油混合佐齊U，充分混勻后乳化成爛鰓、敗血、 赤皮三聯(lián)滅活疫苗。
5. 權(quán)利要求4所述一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征 在于所述柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物的制備包括以下步驟-a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)；b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取培養(yǎng)菌種，劃線接種于胰蛋白胨瓊脂平板，28"C培養(yǎng)48h，挑 取至少5個(gè)假樹(shù)根狀菌落，接種于胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，置28'C擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；c制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的菌種按胰蛋白胨培養(yǎng)基量2%接種到培養(yǎng)罐，以恒溫28°C、 6M2/h的通氣量培養(yǎng)20 24h收獲20 30億CFU/ml培養(yǎng)物；d滅活按細(xì)菌培養(yǎng)物體積比(V/V)加入終濃度為0.02%的硫柳汞溶液，3(TC滅活2天。
6. 權(quán)利要求4所述一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征 在于所述嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物的制備包括以下步驟a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干的嗜水氣單胞菌稀釋后，接種于蛋白胨 te"養(yǎng)基培養(yǎng)；b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取復(fù)壯種子劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)，置28'C培養(yǎng) 48h，挑取單個(gè)形成圓整、隆起、平滑和透明的菌落，由灰白至淡黃色，并有特殊氣味，不產(chǎn)色素的菌落至小5個(gè)，接種于蛋白胨培養(yǎng)基，28'C下擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；c制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的種子按培養(yǎng)基量2%接種量接種置種子罐，以恒溫28'C、 40L/min的通氣量，攪拌培養(yǎng)20h，再接種置發(fā)酵罐，10M3/h通氣量，攪拌培養(yǎng)20h，收獲 80億CFU/ml以上培養(yǎng)物；d滅活加入甲醛溶液，使其終濃度為0.2%， 37'C滅活2天。
7.權(quán)利要求4所述一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征 在于所述螢光極毛桿菌培養(yǎng)物的制備包括以下步驟a菌種復(fù)蘇、復(fù)壯用少許蛋白胨培養(yǎng)基將凍干螢光極毛桿菌種稀釋后，接種于蛋白胨 悟養(yǎng)基i酋養(yǎng)；b種子鑒定及擴(kuò)大培養(yǎng)取復(fù)壯的種子，劃線接種于蛋白胨瓊脂平板若干個(gè)培養(yǎng)，挑取置28'C培養(yǎng)48h，挑取單個(gè)圓形微凸，表面光滑，邊緣整齊，灰白色或黃白色菌落至少5個(gè)， 接種于蛋白胨液體培養(yǎng)基，28°C，擴(kuò)大培養(yǎng)成菌種；c制苗菌液培養(yǎng)將檢驗(yàn)合格的種子按蛋白胨培養(yǎng)基量2%接種量接種置種子罐，以恒溫 28°C、 40L/min通氣量，攪拌培養(yǎng)后20h，再接種置發(fā)酵罐，10M3/h通氣量，拌攪培養(yǎng)20h 收獲80億CFU/ml以上培養(yǎng)物；d滅活加入甲醛溶液，甲醛溶液最終濃度為0.24%， 37°C，滅活3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮的疫苗及其制備方法。該疫苗包括柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物、嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、螢光極毛桿菌培養(yǎng)物，MONTANIDE ISA 763A VG和白油。一種草魚(yú)細(xì)菌性爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗的制備方法，將柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物，嗜水氣單胞菌培養(yǎng)物、螢光極毛桿菌培養(yǎng)物按比例混合，加入生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝螅患尤隡ONTANIDE ISA 763A VG和白油，充分混勻后乳化成爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗。本發(fā)明的有益效果是，能批量提供安全、有效、質(zhì)量可控的草魚(yú)爛鰓、敗血、赤皮三聯(lián)滅活疫苗；增強(qiáng)抗原所激發(fā)的抗體應(yīng)答，促進(jìn)免疫細(xì)胞的協(xié)同作用，從而增強(qiáng)草魚(yú)對(duì)爛鰓病、敗血病和赤皮病綜合免疫功能，免疫草魚(yú)后爛鰓、敗血、赤皮的免疫保護(hù)率都達(dá)80％以上。
文檔編號(hào)A61K39/02GK101574516SQ20091003986
公開(kāi)日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者江小燕, 白岳強(qiáng), 霞 羅, 許淑英, 鄧國(guó)成, 黃志斌 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所