專利名稱：：鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法及其疫苗的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及疫苗
技術領域：
，具體涉及鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法及其疫苗。
背景技術：
：鱘魚為軟骨硬鱗魚，具有很高的經(jīng)濟價值，有"黑色黃金"之稱。隨著其野生資源的減少，人工增養(yǎng)殖相繼出現(xiàn)，與之相關的商品規(guī)?；B(yǎng)殖相繼開展。由于鱘魚骨板堅硬，鰓部分裸露，在人工環(huán)境下進行高密度養(yǎng)殖，相互磨傷而容易受到感染，病害也逐漸增加，但有關其病害病原的分離、鑒定以及防治的研究資料極少。因此，疾病防治的研究是當務之急，這是保證鱘魚養(yǎng)殖持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展的關鍵之一。鱘魚細菌性疾病的發(fā)生目前已成為鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的瓶頸，鱘魚的細菌性疾病主要有細菌性腸炎、細菌性敗血癥和細菌性出血病(腫嘴病)，病原主要是氣單胞菌，具有極強的傳染性，患病鱘魚死亡率高，給生產(chǎn)造成了很大的損失。在鱘魚疾病防治時多采用藥物防治，但藥物防治容易污染水質(zhì)，造成藥物殘留現(xiàn)象，藥量過大還會對鱘魚的生長產(chǎn)生負面影響。此外，大多數(shù)藥物的長期使用還造成了病原性細菌耐藥性的產(chǎn)生，最終給疾病的防治造成了困難。近年來，免疫防治在水產(chǎn)病害防治中的應用已日益廣泛。利用疫苗等，活化或加強動物自身的特異性免疫和非特異性免疫功能，提高抗病能力，被公認為是目前防治病害最為有效的方法之一。國內(nèi)外已應用的漁用疫苗有20余種。水產(chǎn)病害的疫苗防治是今后的發(fā)展方向，疫苗防治既可克服治療困難影響療效的弊病，又可避免藥物殘留現(xiàn)象。目前關于鱘魚細菌病的疫苗防治尚未見報道，我國對鱘魚病的預防治療主要還是依靠藥物手段，因此開發(fā)病原菌疫苗將是鱘魚細菌病有效的防治方法之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術問題提供了一種鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法。為此，本發(fā)明公開了一種鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法，包括下列步驟a)培養(yǎng)和收集以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為出發(fā)菌株，擴大培養(yǎng)，收集；b)滅活福爾馬林對嗜水氣單胞菌菌株滅活，獲得滅活疫苗；c)無活菌檢驗將步驟b制備的滅活疫苗進行細菌培養(yǎng)，結(jié)果為無菌生長，即可判定滅活菌液合格；d)安全性檢測將步驟C判定合格的滅活疫苗接種于鱘魚，設實驗組和對照組，飼養(yǎng)觀察15d，如發(fā)現(xiàn)實驗組魚患細菌性敗血征，而對照組魚為陰性，則該批滅活疫苗為不合格產(chǎn)品，反之則該批滅活疫苗合格；e)效力檢驗將步驟d判定合格的滅活疫苗接種于鱘魚，設實驗組和對照組，飼養(yǎng)30d，在用嗜水氣單胞菌活菌液接種攻毒，飼養(yǎng)觀察15d，記錄各組的死亡魚數(shù)，計算免疫保護率，免疫保護率在65%以上的滅活疫苗為合格品；f)分裝與保存；g)留樣待檢。在一些實施方式里，所述嗜水氣單胞菌菌株可為XI(登錄號EU669667)或嗜水氣單胞菌ATCC35654(登錄號X74676.1)。在一些實施方式里，所述滅活步驟中，福爾馬林的重量百分比濃度為0.1%0.8%，處理條件為4°C3°C，312h;其中優(yōu)選O.1%福爾馬林，3°C，3h。在一些實施方式里，所述無活菌檢驗為在無菌條件下，取10ml滅活疫苗，用生理鹽水將待檢疫苗稀釋10倍，吸取0.2ml分別接種到肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基上各一管，在3t:條件下培養(yǎng)48h，均應無菌生長。如有菌體生長，則為滅活不徹底，為不合格產(chǎn)品；在一些實施方式里，所述安全性檢測步驟中，滅活疫苗接種量5.OX108CFU;在一些實施方式里，所述效力檢驗中，滅活疫苗接種量3.0X1()8CFU，活菌液接種量3.0X108CFU;在一些實施方式里，所述保存條件為4t:環(huán)境下冷藏備用，有效期為90d。在一些實施方式里，本發(fā)明所述鱘魚細菌性疾病可為鱘魚細菌性腸炎、鱘魚細菌性敗血癥或鱘魚細菌性出血病，最優(yōu)為鱘魚細菌性敗血癥。另一方面，本發(fā)明還公開了上面任一項所述制備方法所制備的鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗。本發(fā)明首次公開了鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的制備方法，所制得疫苗安全有效，為鱘魚細菌性病害的有效防治提供可靠的基礎。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。實施例1:1.致病菌的分離與鑒定1.1致病菌的分離選取具有典型自然發(fā)病癥狀的瀕死西伯利亞鱘，用75%的酒精棉反復擦拭病魚體表后，無菌操作取病魚的肝、腎等病灶組織以及少量腹水，分別于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基平板上劃線分離，于2『C下培養(yǎng)24h后，挑取優(yōu)勢單菌落劃線純化，并接種于TSA培養(yǎng)基斜面上，于4t:冰箱保存。1.2致病菌的人工回歸感染試驗用無菌生理鹽水分別刮下斜面保藏的各分離菌株的菌苔，并將其菌懸液濃度稀釋為2.2Xl(fcfu/mL，然后分別對健康的西伯利亞鱘進行胸鰭基部注射感染，每尾注射劑量為0.2mL。以注射等量無菌生理鹽水的健康西伯利亞鱘作為對照。每注射組實驗魚各8尾，水溫為19°C22°C。連續(xù)7d觀察并記錄實驗魚的病癥及死亡數(shù)目，同時對人工回歸感染發(fā)病瀕死的實驗魚進行病原菌再分離，觀察再分離的菌株與原分離菌株在形態(tài)與理化特性等方面是否一致。1.3致病菌株毒力測定將分離的致病菌株菌懸液分別稀釋成2.2X104cfu/mL、2.2X105cfu/mL、2.2X106cfu/mL、2.2X107cfu/mL，然后分別對健康的西伯利亞鱘進行胸鰭基部注射感染，每尾注射劑量為0.2mL。以注射等量無菌生理鹽水的健康的西伯利亞鱘作為對照。每注射組實驗魚各8尾，水溫為19°C22°C。連續(xù)7d觀察并記錄實驗魚的死亡數(shù)目，并用概率單位圖解法計算半數(shù)致死濃度(LC5。)。1.4病原菌的鑒定方法將分離的致病菌株接種在兔血瓊脂平板上，于2『C下培養(yǎng)24h，觀察有無溶血圈產(chǎn)生；同時將新鮮培養(yǎng)的致病菌株進行革蘭氏染色，并用透射電鏡對其形態(tài)進行觀察。此外，用ATB細菌鑒定儀對分離的致病菌株進行生理生化鑒定，并測定其16SrDNA序列，在NCBI中利用BLASTN軟件與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB基因庫中已知的16SrDNA序列進行同源性比較，選取同源性較高的序列并利用BioEdit7.0和Mega4.0軟件進行多重比較后構建系統(tǒng)發(fā)育樹。2.致病菌的分離與結(jié)果2.1致病菌的分離從自然發(fā)病的西伯利亞鱘體內(nèi)分離到4株優(yōu)勢菌株，分別暫命名為XI、X2、X3、X4，經(jīng)過人工回歸感染試驗，僅菌株XI對西伯利亞鱘具有致病性，人工注射感染西伯利亞鱘后7天，西伯利亞鱘的死亡率高達100%(表l)，實驗病魚也表現(xiàn)出肛門紅腫，腹部充滿血水，腸道充血、出血等病癥，而且從人工回歸感染瀕死的病魚體內(nèi)又可分離到與菌株X1形態(tài)特征及理化特性一致的菌株。根據(jù)建立的實驗魚死亡率(％)與菌液濃度對數(shù)(log(rfu/mU)的關系曲線y=36.25x-158.58，菌株X1對西伯利亞鱘的半數(shù)致死濃度(LC5。)為5.62X105cfu/mL，根據(jù)Devesa對魚類致病菌毒力的劃分標準，可判定菌株XI對西伯利亞鱘具有較強的毒力。表1人工回歸感染結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.2病原菌的鑒定結(jié)果菌株X1為革蘭氏陰性桿菌，大小約為1.0iim1.2iimX2.1iim2.4iim，周生側(cè)鞭毛，在兔血瓊脂平板上可產(chǎn)生明顯的P-溶血圈。ATB細菌鑒定儀對菌株X1的生理生化鑒定結(jié)果表明(表2)，菌株X1為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，鑒定結(jié)果的可信度為99%。通過NCBI網(wǎng)站搜索與菌株X1的16SrDNA序列同源性高的各種菌的16SrDNA序列，結(jié)果表明(表3)，菌株X1的16SrDNA序列與GenBank基因庫中細菌菌株的同源性比較最為接近的菌株均為氣單胞菌屬(Aeromonas)，構建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果進一步表明，菌株X1(登錄號EU669667)與嗜水氣單胞菌ATCC35654(登錄號X74676.1)的親緣關系最近，其同源性為99%。綜合形態(tài)與生理生化特性鑒定以及16SrDNA序列分析結(jié)果，菌株X1可鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)。表2ATB細菌鑒定儀對菌株XI的鑒定結(jié)果測定項目結(jié)果測定項目結(jié)果測定項目結(jié)果氧化酶OX+檸檬酸鹽CIT一蔗糖SAC+D-葡萄糖+組氨酸HIS+麥芽糖MAL+水楊素SAL+2-酮葡萄糖酸鹽2KG—衣康酸ITA一D-蜜二糖—3-羥基-丁酸鹽30BU_辛二酸鹽—L-巖藻糖一5-酮基-葡萄糖酸鹽_丙二酸鹽—D-山梨醇一3-羥基-苯甲酸鹽—乙酸鹽ACE一L-阿拉伯糖+鼠李糖RHA+DL-乳酸鹽+丙酸鹽PROP_N-乙酰葡萄糖胺+L-丙氨酸+癸酸鹽CAP—L-脯氨酸PRO+糖原GLYG+戊酸鹽+肌醇INO—甘露醇MAN+L-絲氨酸SER+注"+"表示陽性，"_"表示陰性Note:"+，，denotespositivity，"_，，denotesnegativity表3菌株XI的16SrDNA序列同基因庫中細菌菌株同源性的比較6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:致病菌株全菌滅活疫苗制備——滅活條件的研究不同濃度福爾馬林在不同溫度下對菌株X1的滅活效果結(jié)果表明(表4)，在4。C和3(TC條件下，0.1%福爾馬林在3h即可滅活菌株XI的菌細胞。表4不同濃度福爾馬林在不同溫度下對菌株XI的滅活效果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"_"表示無菌生長；"+"表示有菌生長，下同實施例3:無活菌檢驗在無菌條件下，取10ml滅活后的疫苗，用生理鹽水將待檢疫苗稀釋IO倍，吸取0.2ml分別接種到肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基上各一管，在37t:條件下培養(yǎng)48h，均應無菌生長。如有菌體生長，則為滅活不徹底，為不合格產(chǎn)品。實施例4:安全性檢測4.1試驗容器4.1.1選用容積為(12)m3的水泥池或水簇箱等容器。容器需配有控溫和通氣增氧裝置。4.1.2容器在使用前用萬分之一的漂白粉水溶液消毒24h，消毒后用自來水沖洗干凈，并放入適量經(jīng)活性碳處理的自來水曝氣24h后待用。4.2試驗魚種選用體重為100g左右，體質(zhì)健壯，游動活潑，無任何損傷和疾病的鱘魚，在試驗前用2%的食鹽水浸浴(510)min，將魚種放入符合5.l條規(guī)定的容器中，于(2830)t:水溫下飼養(yǎng)，觀察15d，所有魚均應活動正常。如發(fā)現(xiàn)有魚種出現(xiàn)有細菌性敗血征癥狀，則該批魚種不得使用。4.3安全性試驗取符合5.2條規(guī)定的鱘魚60尾，設實驗組和對照組，各30尾魚。將疫苗用無菌注射器對實驗組魚種作胸腔注射，注射劑量為0.5ml/尾(疫苗濃度1.OX109CFU/ml)。對照組注射等量生理鹽水。將魚種在(2528)t:水體中飼養(yǎng)，觀察15d，如發(fā)現(xiàn)實驗組魚患細菌性敗血征，而對照組魚為陰性，則該批疫苗為不合格產(chǎn)品。實施例5:效力檢驗5.1魚種免疫5.1.1按5.1條規(guī)定準備試驗容器，按4.2條規(guī)定選擇試驗魚種。5.1.2將符合安全試驗的待檢樣品用無菌生理鹽水稀釋成含菌量為1.OX109CFU/ml，用無菌注射器對魚種進行免疫注射，每尾腹腔注射劑量為0.3ml，試驗魚種不少于30尾。第三天再用同劑量疫苗強化免疫，注射后的魚種在(2528)t:的水溫下飼養(yǎng)30d，該批魚種即為免疫魚種。5.2免疫魚攻毒在無菌條件下將試管斜面嗜水氣單胞菌苔刮下制成菌懸浮液，含菌量為1.0X108CFU/ml。以0.3mL/尾的劑量，分別注射經(jīng)免疫的試驗組魚種和未經(jīng)免疫的對照組魚種(試驗組和對照組的魚種數(shù)量相同，每組數(shù)量不少于30尾)。攻毒后的魚種在(2528)°C的水體中觀察15d，記錄各組的死亡魚數(shù)，計算死亡率。5.3免疫保護率的計算根據(jù)5.2條的試驗結(jié)果，計算其免疫保護率。注免疫保護率在65%以上的制品為合格品實施例6:產(chǎn)品分裝與保存將滅活、安全性和效力檢測合格的疫苗在無菌條件下，分裝于50ml或100ml經(jīng)消毒處理的玻璃瓶或塑料瓶中，加貼標簽，包裝產(chǎn)品。產(chǎn)品包裝按GB6388的要求執(zhí)行。疫苗產(chǎn)品置于4t:環(huán)境下冷藏備用，有效期為90d。在疫苗保存期間，應不定期進行無活菌檢驗，以保障疫苗的安全性。本發(fā)明的范圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發(fā)明各個方面的單個例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發(fā)明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。權利要求一種鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法，包括下列步驟a)培養(yǎng)和收集以嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)菌株(編號BYKAH-X1或簡稱為X1)為原始菌種，擴大培養(yǎng)，收集；b)滅活福爾馬林對嗜水氣單胞菌菌株X1滅活，獲得滅活疫苗；c)無活菌檢驗將步驟b制備的滅活疫苗進行細菌培養(yǎng)，結(jié)果為無菌生長，即可判定滅活菌液合格；d)安全性檢測將步驟c判定合格的滅活疫苗接種于鱘魚，設實驗組和對照組，飼養(yǎng)觀察15d，如發(fā)現(xiàn)實驗組魚患細菌性敗血征，而對照組魚為陰性，則該批滅活疫苗為不合格產(chǎn)品，反之則該批滅活疫苗合格；e)效力檢驗將步驟d判定合格的滅活疫苗接種于鱘魚，設實驗組和對照組，飼養(yǎng)30d，在用嗜水氣單胞菌菌株X1活菌液接種攻毒，飼養(yǎng)觀察15d，記錄各組的死亡魚數(shù)，計算免疫保護率，免疫保護率在65％以上的滅活疫苗為合格品；f)分裝與保存；g)留樣待檢。2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述嗜水氣單胞菌菌株可為上海海洋大學國家水生動植物病原庫編號為XI的嗜水氣單胞菌或編號為ATCC35654的嗜水氣單胞菌。3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在所述滅活步驟中，處理條件為重量百分比濃度為0.1%0.8%福爾馬林，4"3°C，312h。4.如權利要求l所述的制備方法，其特征在于所述滅活步驟中，處理條件為O.1%福爾馬林，3。C，3h。5.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述無活菌檢驗為在無菌條件下，取10ml滅活疫苗，用生理鹽水將待檢疫苗稀釋10倍，吸取0.2ml分別接種到肉湯蛋白胨液體培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯培養(yǎng)基上各一管，在3t:條件下培養(yǎng)48h，均應無菌生長。如有菌體生長，則為滅活不徹底，為不合格產(chǎn)品。6如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述安全性檢測步驟中，滅活疫苗接種量5.0X108CFU。7.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述效力檢驗中，滅活疫苗接種量3.0X108CFU，活菌液接種量3.0X108CFU。8.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述保存條件為4t:環(huán)境下冷藏備用，有效期為90d。19.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述鱘魚細菌性疾病可為鱘魚細菌性腸炎、鱘魚細菌性敗血癥或鱘魚細菌性出血病。10.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述鱘魚細菌性疾病為鱘魚細菌性敗血癥。11.如權利要求i-io任一項所述制備方法所制備的鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗。全文摘要本發(fā)明涉及疫苗
技術領域：
，具體涉及鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明公開了一種鱘魚細菌性敗血綜合征全菌滅活疫苗的制備方法，包括下列步驟嗜水氣單胞菌培養(yǎng)和收集；滅活；無活菌檢驗；安全性檢測；效力檢驗；分裝與保存；留樣待檢。本發(fā)明首次公開了鱘魚細菌性疾病全菌滅活疫苗的制備方法，所制得疫苗安全有效，為鱘魚細菌性病害的有效防治提供可靠的基礎。文檔編號A61P31/04GK101732702SQ20081020281公開日2010年6月16日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權日2008年11月17日發(fā)明者姜有聲,曹海鵬,李圓圓,楊先樂,邱軍強申請人:上海海洋大學