Prx I重組蛋白在制備抗細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組蛋白及應(yīng)用，特別涉及一種過氧化物氧化還原酶Prx I重組 蛋白在制備抗細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 過氧化物氧化還原酶（Peroxiredoxins, Prx, EC 1. 11. 1. 15)是一類過氧化物酶 家族蛋白，廣泛存在于動物和植物等細(xì)胞中。在包括哺乳動物在內(nèi)的脊椎動物中，存在六種 Prxs蛋白（Prx I?VI)，它們具有保守的氨基酸序列、功能活性位點以及相似的催化機(jī)制， 分別定位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體、溶酶體和高爾基體等細(xì)胞器中，構(gòu)成細(xì) 胞內(nèi)重要的抗氧化網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。在Prxs蛋白家族中，Prx I是含量最高且分布廣泛的成員。 目前認(rèn)為Prxs蛋白家族的主要功能是通過分解H2O2而發(fā)揮抗氧化作用。Prxs分解H 2O2的 分子機(jī)制是通過其氨基酸序列中半胱氨酸（Cys)殘基的氧化還原作用實現(xiàn)的，即Prxs蛋白 中保守的還原性Cys-SH被H 2O2氧化，生成氧化態(tài)Cys-SOH，從而將H 202還原成H 20 ;而氧化 態(tài)Cys-SOH殘基可與另一 Prx蛋白中的還原性Cys-SH發(fā)生反應(yīng)，形成分子間或分子內(nèi)二硫 鍵，構(gòu)成同型或異型二聚體；然后該二聚體可進(jìn)一步在硫氧還蛋白（Trx)、硫氧還蛋白還原 酶（TrxR)和NADPH組成的Trx還原系統(tǒng)或還原型谷胱甘肽GSH的作用下，被重新還原成單 體還原態(tài)蛋白，如是循環(huán)，使H 2O2不斷地被分解。由于H2O2是生物有機(jī)體生理代謝的重要生 化產(chǎn)物之一，高濃度的H 2O2積累將破壞機(jī)體的氧化一還原平衡，對細(xì)胞內(nèi)脂類、核酸、糖類 以及蛋白質(zhì)等分子造成氧化損傷，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，誘發(fā)機(jī)體衰老和眾多代謝性 疾病的發(fā)生。因此，Prxs蛋白可能在維持機(jī)體氧化一還原平衡方面發(fā)揮重要作用。
[0003] 除了酶促分解H2O2的生化功能外，對于Prxs是否具有其他生物學(xué)功能尚不清楚。 本發(fā)明以Prx I為研宄對象，首次發(fā)現(xiàn)Prxs蛋白具有抗細(xì)菌感染的免疫學(xué)新功能，并針對 Prx I是一種分布于細(xì)胞內(nèi)的活性蛋白，需要在胞內(nèi)發(fā)揮作用，而體外重組表達(dá)的Prx I蛋 白因不能有效進(jìn)入細(xì)胞而難以發(fā)揮作用這一應(yīng)用性難題，設(shè)計出一種具有回輸進(jìn)入細(xì)胞能 力的多肽序列（簡稱回輸肽），通過將該回輸肽與Prx I分子重組，構(gòu)建出一種具有回輸細(xì) 胞功能的新型Prx I重組蛋白，使Prx I蛋白的抗菌免疫功能得到顯著提高。 (三）

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目是提供一種過氧化物氧化還原酶Prx I重組蛋白具有抗細(xì)菌性敗血癥的 新功能；通過將Prx I蛋白進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造，在其氨基或羧基末端重組了一種具有回輸 細(xì)胞能力的多肽序列（回輸肽），使Prx I蛋白的抗敗血癥功能得到顯著提高。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種過氧化物氧化還原酶Prx I重組蛋白在制備抗細(xì)菌性敗血癥藥物 中的應(yīng)用，所述的重組蛋白是在過氧化物氧化還原酶Prx I氨基酸序列的N端或C端連接 回輸肽蛋白構(gòu)建而成；所述回輸肽的氨基酸序列為5' -AAVLLPVLLAAP-3'，編碼該信號肽氨 基酸序列的核苷酸序列為 GCAGCCGTTCTTCTCCCTGTTCTTCTT GCCGCACCC。
[0007] 本發(fā)明所述的細(xì)菌性敗血癥為嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophil，A. h)感染引 起的急性敗血癥。
[0008] 本發(fā)明所述的過氧化物氧化還原酶Prx I蛋白由脊椎動物河豚的Prx I基因所編 碼，利用大腸桿菌體外重組表達(dá)而成，編碼Prx I蛋白的基因序列（gb DQ003333. 1)為SEQ ID NO. 1 所示。
[0009] 本發(fā)明所述的Prx I重組蛋白特別用于嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophil， A. h)引起的急性敗血癥的抗感染免疫藥物的制備，它能顯著增強(qiáng)實驗動物對急性細(xì)菌性敗 血癥的抵抗力，大幅度提尚存活率。
[0010] 本發(fā)明所述攜帶回輸肽序列的Prx I重組蛋白，成功解決了其作為一種胞內(nèi)活性 蛋白，經(jīng)體外表達(dá)生產(chǎn)后，如何高效無損傷地進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮功能這一應(yīng)用性難題。分別在體 外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)組織水平檢測Prx I重組蛋白的回輸細(xì)胞能力，同時利用嗜水氣單胞菌 感染的實驗動物（斑馬魚）急性敗血癥模型，比較改造前后的Prx I蛋白（未連接回輸肽的 正常Prx I蛋白和連接回輸肽的重組Prx I蛋白）對急性細(xì)菌性敗血癥抵抗能力的差異， 從而證明經(jīng)改造的Prx I蛋白的功能得到顯著提高。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1)本發(fā)明首次提供了過氧化 物氧化還原酶Prx I除了具有分解H2O2的經(jīng)典生化功能外，還具有新的抵抗細(xì)菌性急性敗 血癥的免疫學(xué)功能；（2)通過對該蛋白分子進(jìn)行重組改造，使其攜帶一種具有回輸細(xì)胞功 能的多肽序列，成功建立了一種無損傷的給予細(xì)胞活性蛋白的途徑，該途徑能顯著增強(qiáng)活 性蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率，通過提高利用效率而賦予其具有更高的生物學(xué)活性，從而降低生 產(chǎn)成本，具有良好的應(yīng)用前景。 (四）
【附圖說明】
[0012] 圖 1 為 Prx I 重組蛋白的 cDNA 擴(kuò)增結(jié)果；M :DNA Marker ;1 :Prx I-NS 的 cDNA 片 段；2 :Prx I-CS 的 cDNA 片段；3 :Prx I 的 cDNA 片段。
[0013] 圖2為Prx I重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；M :蛋白Marker ;1，3, 5:轉(zhuǎn)化了 Prx I-NS、 Prx I-CS和Prx I重組表達(dá)質(zhì)粒但未經(jīng)誘導(dǎo)的對照組；2 :Prx I-NS重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié) 果；4 :Prx I-CS重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；6:正常Prx I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
[0014] 圖3為Prx I重組蛋白的回輸細(xì)胞功能鑒定結(jié)果（200X);第一行：普通光學(xué)顯微 鏡下的細(xì)胞圖像；第二行：熒光顯微鏡下的細(xì)胞圖像，分別表示FITC、FITC-Prx I、FITC-Prx I-NS和FITC-Prx I-CS重組蛋白回輸細(xì)胞后發(fā)出熒光信號的結(jié)果。
[0015] 圖4為Prx I重組蛋白的體內(nèi)回輸組織細(xì)胞的熒光顯微鏡圖（200X);分別表示 FITC-Prx I-NS重組蛋白、FITC-Prx I和FITC回輸肝、脾、腎、腸等不同組織細(xì)胞后發(fā)出熒 光信號的結(jié)果。
[0016] 圖5為Prx I重組蛋白抗敗血癥感染的免疫學(xué)功能鑒定結(jié)果。η為實驗魚的數(shù)目。 (五）
【具體實施方式】
[0017] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0018] 實施例1、Prx I及其重組分子的cDNA克隆與構(gòu)建
[0019] 按照Trizol試劑盒（TaKaRa)的說明從河豚脾臟提取RNA，利用3' -Full RACE Core Set試劑盒（TaKaRa)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA作為模板，用含編碼回輸肽核 苷酸序列的引物Fl和Rl擴(kuò)增具有N端回輸肽的Prx I (Prx I-NS);用引物F2和含編碼回 輸肽核苷酸序列的引物R2擴(kuò)增具有C端回輸肽的Prx I (Prx I-CS);用引物R)和RO擴(kuò)增 無回輸肽的正常Prx I。
[0020] Fl ：5' -CCATGGCAGCCGTTCTTCTCCCTGTTCTTCTTGCCGCACCCGCTGCAGGCAAAGCTC-3,
[0021] Rl:5'-CTCGAGGTGCTTGGAGAAGAACTC-3'
[0022] F2 :5'-CCATGGGCCACCACCACCACCACCACGCTGCAGGCAAAGCTC-3'
[0023] R2 :5'-CTCGAGTT AGGGTGCGGCAAGAAGAACAGGGAGAAGAACGGCTGCGTGCTTG GAGAAGAACTC-3，
[0024] FO :5'-CCATGGCTGCAGGCAAAGCTC-3'
[0025] RO :5'-CTCGAGGTGCTTGGAGAAGAACTC-3'
[0026] PCR擴(kuò)增體系組成見表I ;PCR條件為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，56°C退火 30s，72°C延伸30s，72°C延伸lOmin，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠電泳和測 序鑒定，獲得了與預(yù)期大小和序列相符的Prx I-NS、Prx I-CS和Prx I的cDNA (圖1)。
[0027] 表I. Prx I及其重組分子cDNA制備的PCR擴(kuò)增體系
[0028]
【主權(quán)項】
1. 一種過氧化物氧化還原酶Prx I重組蛋白在制備抗細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用，其 特征在于所述的重組蛋白是在過氧化物氧化還原酶Prx I氨基酸序列的N端或C端連接回 輸肽蛋白構(gòu)建而成；所述回輸肽的氨基酸序列為5' -AAVLLPVLLAAP-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述過氧化物氧化還原酶Prx I的核苷酸序 列為SEQ ID NO. 1所示。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗細(xì)菌性敗血癥為嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophil)引起的急性敗血癥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種過氧化物氧化還原酶Prx？I重組蛋白在制備抵抗急性細(xì)菌性敗血癥藥物中的應(yīng)用，所述的重組蛋白是在過氧化物氧化還原酶Prx？I氨基酸序列的N端或C端連接回輸肽蛋白構(gòu)建而成；所述回輸肽的氨基酸序列為5’-AAVLLPVLLAAP-3’；本發(fā)明首次提供了過氧化物氧化還原酶Prx？I重組蛋白除了具有分解H2O2的經(jīng)典生化功能外，還具有新的抵抗急性細(xì)菌敗血癥的免疫學(xué)功能；通過對該蛋白分子進(jìn)行重組改造，顯著增強(qiáng)活性蛋白進(jìn)入細(xì)胞的效率，通過提高利用效率而賦予其具有更高的生物學(xué)活性，從而降低生產(chǎn)成本，具有良好的應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61K38-44, A61P31-04, C12N9-08
【公開號】CN104548073
【申請?zhí)枴緾N201410766259
【發(fā)明人】邵建忠, 劉廣平, 項黎新, 董偉仁, 潘若浪
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月12日