一種疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種疫苗組合物，該疫苗組合物包括：免疫量的豬瘟病毒抗原、免疫量的豬偽狂犬病病毒抗原和免疫量的副豬嗜血桿菌抗原。該疫苗組合物使用安全、質(zhì)量可控，免疫效果良好，攻毒保護(hù)率達(dá)到80～100%。使用時(shí)滴鼻免疫0～3日齡仔豬、肌肉注射免疫50日齡仔豬可以取得令人滿意的免疫效果。CCTCC No：M201117320110518
【專利說明】一種疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗組合物及其制備方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬瘟是豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要特征是高溫、微血管變性而 引起全身出血、壞死、梗塞。早年又稱豬霍亂，對豬危害極為嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大損失。
[0003] 副豬嗜血桿菌病是副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis, Hps)引起的豬的多發(fā) 性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，該病又稱為豬革拉澤氏?。℅lasser's Disease)。副豬嗜血桿菌可以 影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見于5?8周齡的 豬，發(fā)病率可達(dá)40%，死亡率可達(dá)50%。主要臨床癥狀表現(xiàn)為咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和 被毛粗亂；主要剖檢病變表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等。根 據(jù)我國血清流行病學(xué)調(diào)查和分離菌株的鑒定，以4、5型最為流行。近年來，由于我國目前飼 養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整進(jìn)行不當(dāng)，以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴(yán) 重。
[0004] 豬偽狂犬病是由皰疹病毒I型引起的一種急性傳染病。可導(dǎo)致：懷孕母豬發(fā)生流 產(chǎn)、死亡、產(chǎn)木乃伊胎及弱仔；新生仔豬發(fā)生大批急性死亡，伴有嘔吐、腹瀉及發(fā)抖，震顫和 運(yùn)動失調(diào)等神經(jīng)癥狀，并產(chǎn)生免疫抑制，免疫抑制豬對其它疫病易感性增加，影響仔豬生長 發(fā)育。除豬外，其他動物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、奇癢，腦脊髓炎的致死性感染，但對仔豬的危害最 嚴(yán)重，15日齡內(nèi)的仔豬死亡率達(dá)100%，因此本病給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的損失。
[0005] 根據(jù)近幾年豬場流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，臨床上表現(xiàn)為母豬相繼出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、 產(chǎn)木乃伊胎的情況，且產(chǎn)出的仔豬于產(chǎn)后不久相續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、震顫、間歇性腹瀉，糞便 后期成黃色，有的發(fā)生嘔吐和運(yùn)動失調(diào)，部分仔豬在發(fā)病后期皮膚出現(xiàn)出血點(diǎn)及皮下水腫 等癥狀。并于不久死亡，病程1-7天，病死率100%。死亡豬剖檢呈現(xiàn)眼瞼腫脹，粘膜充血，肺 有出血斑，肺間質(zhì)增寬，肺組織呈肉樣變化，淋巴結(jié)腫大，脾臟邊緣有壞死小病灶，腸淋巴結(jié) 呈大理石樣變，胃底有大面積出血，腎表面有大小不一的出血點(diǎn)，心包炎、胸膜炎、腹膜炎和 關(guān)節(jié)炎。從發(fā)病豬中分離出最常見的病原體是豬瘟、豬偽狂犬和副豬嗜血桿菌。
[0006] 隨著病原流行株和混合感染已經(jīng)使現(xiàn)有疫苗及免疫程序很難達(dá)到預(yù)期的免疫效 果，現(xiàn)在存在的問題是同時(shí)免疫兩種活疫苗，豬偽狂犬病會干擾豬瘟前期抗體的產(chǎn)生：豬 瘟抗體3周后才達(dá)到陽性，而豬偽狂犬病抗體在7d時(shí)就達(dá)到陽性(賀衛(wèi)潔，河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2010碩士論文)。而且，劉明亞(畜牧與獸醫(yī)，2010,42卷2期：68-70)等研究發(fā)現(xiàn)，仔豬具 有較高的母源抗體水平時(shí)，在一定時(shí)間接種豬瘟疫苗和偽狂犬疫苗后，仔豬體內(nèi)的抗體水 平迅速下降至較低水平并持續(xù)很長時(shí)間，而且下降后的抗體水平上升非常緩慢，使免疫豬 產(chǎn)生一個(gè)免疫間隙期，因此在實(shí)際生產(chǎn)中各豬場不斷調(diào)整免疫程序，單還是避免不了野毒 感染的情況。
[0007] 另外，豬瘟和偽狂犬病毒感染豬并發(fā)豬副豬嗜血桿菌后，發(fā)病呈急性，且死亡率很 商。
[0008]目前市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應(yīng)激較大；而同時(shí)針對控制豬 瘟、豬偽狂犬和副豬嗜血桿菌疫苗，國內(nèi)外也還是空白。因此，需要發(fā)明豬瘟、豬偽狂犬和副 豬嗜血桿菌疫苗以解決上述問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果用豬瘟、豬偽狂犬和副豬嗜血桿菌疫苗組合物進(jìn)行滴鼻免疫，可 以解決母源抗體干擾問題，產(chǎn)生對豬瘟、豬偽狂犬和副豬嗜血桿菌產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)；應(yīng) 用時(shí)豬瘟、豬偽狂犬活疫苗和副豬嗜血桿菌滅活疫苗可以以滅活疫苗稀釋活苗的方式使 用，還可以按一定比例混合后加入凍干保護(hù)劑凍干使用，運(yùn)輸方便且不降低免疫效果；此 夕卜，還發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌滅活疫苗對豬瘟和豬偽狂犬疫苗有免疫增強(qiáng)作用，后者抗原減半 也能達(dá)到和單苗使用一樣的效果。
[0010] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括：免疫量的豬 瘟病毒抗原、免疫量的豬偽狂犬病病毒抗原和免疫量的副豬嗜血桿菌抗原。
[0011] 優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原為活的形式的全病毒抗原、滅活的全病毒抗原、亞單位 抗原、重組活載體抗原或合成肽抗原；所述豬偽狂犬病病毒抗原為減毒全病毒抗原、滅活的 全病毒抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原或合成肽抗原；所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活全 菌抗原、減毒全菌抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原或合成肽抗原。
[0012] 優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原是豬瘟全病毒抗原，優(yōu)選滅活形式、改良的活的形式或 減毒形式的豬瘟病毒抗原，含有至少豬瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，任何其 它含至少豬瘟病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬瘟 病毒為減毒形式的全病毒抗原，可以是選自細(xì)胞源豬瘟病毒、兔源豬瘟病毒、脾淋源豬瘟病 毒中的一種或幾種。
[0013] 優(yōu)選地，所述豬偽狂犬病病毒抗原是豬偽狂犬病全病毒抗原，優(yōu)選滅活形式、改良 的活的形式或減毒形式的豬偽狂犬病病毒抗原，含有至少豬偽狂犬病病毒的免疫原性氨基 酸序列的嵌合病毒，任何其它含至少豬偽狂犬病病毒的免疫原性氨基酸序列的多肽。優(yōu)選 地，本發(fā)明疫苗組合物中，所述豬偽狂犬病病毒為減毒形式的全病毒抗原，可以是選自天然 基因缺失豬偽狂犬病病毒、人工傳代致弱豬偽狂犬病病毒和使用基因工程技術(shù)去除特定的 和毒力有關(guān)的基因或基因片段而獲得的缺失豬偽狂犬病病毒中的一種或幾種。
[0014] 優(yōu)選地，所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌全菌，改良的副豬嗜 血桿菌活菌或減毒的副豬嗜血桿菌，含有至少副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的嵌合 菌株，任何其它含至少副豬嗜血桿菌的免疫原性氨基酸序列的多肽。優(yōu)選地，本發(fā)明疫苗組 合物中，所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活形式的副豬嗜血桿菌全菌，可以是選自包括本領(lǐng)域 技術(shù)人員熟知的臨床分離的野毒株，包含目前已鑒定的1?15個(gè)血清型或無法確定血清型 的副豬嗜血桿菌的一種或幾種。
[0015] 本發(fā)明提供的豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物，滅活疫苗部分包含副豬 嗜血桿菌抗原和佐劑，作為優(yōu)選實(shí)施方案，抗原包含已滅活的副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株 抗原，所述佐劑為進(jìn)口的新型水佐劑Montanide GEL ST聚合物(包括同系列佐劑）佐劑，包 括氫氧化錯(cuò)膠、卡波姆（Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、愛菲金（Amphigen)、細(xì)胞因子 等；活疫苗部分包含豬瘟、豬偽狂犬弱毒和耐熱保護(hù)劑。
[0016] 疫苗組合物滅活疫苗部分還可替換為副豬嗜血桿菌其它血清型菌株、副豬嗜血桿 菌基因工程抗原或進(jìn)一步包括豬大腸桿菌抗原、豬巴氏桿菌抗原、豬傳染性胸膜肺炎放線 桿菌抗原、豬鏈球菌抗原、豬霍亂沙門氏菌抗原、豬波氏桿菌抗原、豬紅斑丹毒絲菌抗原、豬 肺炎支原體其它野毒株的抗原、或者豬藍(lán)耳病毒抗原、豬流行性腹瀉病毒抗原、傳染性胃腸 炎病毒抗原等。
[0017] 活疫苗部分病毒還可能加入或者替換為豬瘟、偽狂犬其它毒株、豬圓環(huán)病毒、豬乙 腦病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬流感病毒、豬流行性腹瀉、傳染性胃腸炎病毒及它們的核酸、基因 工程修飾病毒或編碼所述抗原的遺傳信息。
[0018] 更優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟兔化弱毒株；所述豬偽狂犬病病毒抗原為豬 偽狂犬病病毒SA215 (TK7gE7gO株；所述副豬嗜血桿菌抗原為血清5型副豬嗜血桿菌ZJ 株滅活全菌抗原。
[0019] 所選用的豬瘟兔化弱毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保藏號為AV1412。
[0020] 所選用的血清5型副豬嗜血桿菌菌株為副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株 (Haemophilus Parasuis，Serotype5, Strain ZJ)，保藏號為 CCTCCNo. M2011173,保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為：中國武漢?武漢大學(xué)，保藏日期為：2011年5月18 曰。
[0021] 所選用的豬偽狂犬SA215 (TK_/gE_/gr)株，保藏號為V200002,保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)公開于中國專利CNlOl 186902A。
[0022] 優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原含量為104_°?IO6 tlTCID5ci/頭份，所述偽狂犬病 病毒的含量為1〇4_°?IO6tlTCID 5c/頭份，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為LOXlO9? 4. OXlO9CFU / mL。
[0023] 更優(yōu)選地，所述豬瘟病毒抗原含量為IO5 tlTCID5ci/頭份，所述偽狂犬病病毒的含量 為IO5 tlTCID5c/頭份，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為2X IO9CFU / mL。
[0024] 作為本發(fā)明豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，所述滅活 疫苗副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株抗原為所述疫苗總體積的75%?90%，疫苗中含量為滅活 前副豬嗜血桿菌血清5型活菌數(shù)I. 0 X IO9?4. 0 X IO9CFU / mL，更優(yōu)選地2 X IO9CFU / mL。
[0025] 作為本發(fā)明豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，所述豬瘟 病毒的含量為1〇 4_°?IO6 tlTCID5c/頭份，更優(yōu)選地IO5 tlTCID5ci/頭份；所述偽狂犬病毒的含 量為10"?Kf tlTCID5tl/頭份，更優(yōu)選地105 °TCID50/頭份；加入耐熱保護(hù)劑為2%明膠、15% 乳糖、2%聚乙烯吡咯烷酮（PVP )。
[0026] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括：1) 分別增殖培養(yǎng)所述豬瘟病毒，偽狂犬病病毒，加入凍干保護(hù)劑，凍干；2)增殖培養(yǎng)所述副豬 嗜血桿菌,滅活,加入佐劑。
[0027] 副豬嗜血桿菌病滅活疫苗的制備方法，按照滅活疫苗通用方法制備。豬瘟、豬偽狂 犬活疫苗制備方法，用傳代細(xì)胞制備，所述傳代細(xì)胞選自ST (豬睪丸細(xì)胞)、STK (豬睪丸細(xì) 胞克隆細(xì)胞)、PK15 (豬腎細(xì)胞）、BHK21 (幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞）、IBRS-2 (豬腎細(xì)胞克隆 細(xì)胞）和Vero (非洲綠猴腎細(xì)胞)。所述細(xì)胞、病毒培養(yǎng)方式為潮汐式微載體懸浮培養(yǎng)生物 反應(yīng)器。
[0028] 作為本發(fā)明豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，所述組合 物要進(jìn)行相容性檢驗(yàn)，各取2瓶活疫苗部分，分別用副豬嗜血桿菌病滅活疫苗部分(待檢稀 釋液)和參考稀釋液(無菌注射用水)，按照使用說明（活疫苗部分1頭份/瓶，滅活疫苗部分 1頭份（2ml)/瓶）復(fù)原。20±3°C放置2h，依照豬癌、豬偽狂犬活疫苗滴定方法檢驗(yàn)。通過 與參考稀釋液的比較，評估待檢稀釋液對病毒活性組分的影響，病毒組分的滴定結(jié)果的差 值應(yīng)不超過〇· 71ogl0。
[0029] 本發(fā)明的再一目的在于提供一種免疫試劑盒，所述試劑盒包括：凍干的豬瘟兔化 弱毒株和豬偽狂犬病病毒弱毒株；副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原，其中，所述豬瘟兔化弱毒 株、豬偽狂犬病病毒弱毒株與所述副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原分開保藏。
[0030] 本發(fā)明的又一目的在于提供一種免疫試劑盒，所述試劑盒包括：凍干的豬瘟兔化 弱毒株、豬偽狂犬病病毒弱毒株以及副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原，其中，所述豬瘟兔化弱毒 株、豬偽狂犬病病毒弱毒株與所述副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原共同凍干保藏。
[0031] 作為本發(fā)明豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物的優(yōu)選實(shí)施方案，所述組合 物還可以是豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌滅活疫苗按I : 1 : 2比例混合，加入凍干保護(hù) 齊U，使用時(shí)用生理鹽水稀釋使用。
[0032] 本發(fā)明的還一目的在于提供所述的疫苗組合物在制備治療和預(yù)防豬瘟、豬偽狂犬 病和副豬嗜血桿菌感染的藥物中的應(yīng)用。
[0033] 優(yōu)選地，乳豬在1?3日齡時(shí)滴鼻免疫所述疫苗組合物，在50日齡時(shí)仔豬肌注免 疫所述疫苗組合物。
[0034] 本發(fā)明還涉及到豬瘟、豬偽狂犬、副豬嗜血桿菌疫苗組合物的使用，對出生乳豬采 用滴鼻免疫，免后28日用豬瘟、豬偽狂犬和副豬嗜血桿菌感染，可以保護(hù)80%以上的豬，抗 體不受母源抗體干擾，取得令人滿意的免疫效果。
[0035] 本發(fā)明采用傳代細(xì)胞培養(yǎng)的豬瘟抗原、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的三基因缺失SA215株偽狂 犬抗原、國內(nèi)流行副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株抗原制備的疫苗組合物，免疫效果良好，能 夠有效預(yù)防由豬瘟病毒引起的豬瘟、偽狂犬病毒引起的偽狂犬病、副豬嗜血桿菌引起的副 豬嗜血桿菌病及其三者的混合感染；本發(fā)明滅活疫苗部分采用了水溶性聚合物類佐劑和適 宜的配苗技術(shù)制備了副豬嗜血桿菌病滅活疫苗，用其作為稀釋劑可以稀釋豬瘟、偽狂犬活 疫苗組合物使用，或者豬瘟、偽狂犬活疫苗和副豬嗜血桿菌滅活疫苗凍干使用安全、質(zhì)量可 控，免疫效果良好，攻毒保護(hù)率達(dá)到80?100%。使用時(shí)滴鼻免疫0?3日齡仔豬、肌肉注射 免疫50日齡仔豬可以取得令人滿意的免疫效果。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述更 為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn) 行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0037] 本發(fā)明的具體實(shí)驗(yàn)方法可參見《中華人民共和國獸藥典(二〇一〇年版)》及附錄。 其他未注明的試劑或原料均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)獲得。
[0038] 本發(fā)明所述"每頭份"或"/頭份"是指每頭豬每次用疫苗量。未作特別說明之處， 本發(fā)明中所述"每頭份"或"/頭份"為2ml。
[0039] 本發(fā)明所述疫苗佐劑優(yōu)選水溶性疫苗佐劑，包括但不限于：Montanide? Gel ST、 蜂膠、愛菲金（Amphigen)、細(xì)胞因子、脂質(zhì)體、免疫刺激復(fù)合物、含CpC脫氧寡核苷酸、納米 化磷酸鋁、皂苷、山梨聚糖、二縮甘露醇、丙二醇、聚氧丙烯、聚氧乙烯嵌段共聚物、丙烯酸或 甲基丙烯酸聚合物、順丁烯二酸酐與烯基衍生物共聚物、糖或多元醇的聚烯基醚交聯(lián)的丙 烯酸或甲基丙烯酸的聚合物的一種或幾種組合物。
[0040] 本發(fā)明所述凍干保護(hù)劑的例子，包括但不限于：明膠水溶液、乳糖水溶液及其混合 物，優(yōu)選2wt%明膠水溶液、2wt%聚乙烯吡咯烷酮與15wt%乳糖水溶液以I: I (v/v)比例混合 所得的混合物。本發(fā)明中所使用的" ％"，如無特別說明，均為質(zhì)量百分比。
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例中用豬瘟兔化弱毒株、豬偽狂犬三基因缺失SA215株、副豬嗜血桿 菌血清5型ZJ株為例說明本發(fā)明。
[0042] 菌株(毒株）的來源
[0043] 所選用的豬瘟兔化弱毒株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，保藏號為AV1412。
[0044] 所選用的血清5型副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis，HPs)菌株為ZJ株，保 藏號為CCTCC No. M2011173,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0045] 所選用的豬偽狂犬SA215 (TK_/gE_/gr)株，保藏號為V200002,保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)公開于中國專利CN101186902A。
[0046] 實(shí)施例1抗豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和副豬嗜血桿菌疫苗組合物的制備
[0047] 1.豬瘟病毒抗原液的制備及檢驗(yàn)
[0048] (1)將長成良好單層的對豬瘟病毒高敏感的ST細(xì)胞(購自ATCC) (American type culture collection，美國模式培養(yǎng)物集存庫）用0· 125wt%膜酶和0· 03wt%EDTA (乙二 胺四乙酸）的消化液進(jìn)行消化分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以合適的密度接種后，加入含有3wt%? 5wt%FBS (胎牛血清）（購自PAA公司，批號A15110-1462)的MEM (購自GIBCO公司，批號 856833)，同時(shí)按照M. 0. I.(感染復(fù)數(shù)）=0. 1?0. 2接毒劑量加入種毒，置于34?37°C溫 箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0049] (2)培養(yǎng)三天后進(jìn)行第一次收毒，收毒后補(bǔ)加 I. 5wt%?3wt%FBS的細(xì)胞維持液，以 后每隔2天收毒一次，連續(xù)收毒5次。收毒后將抗原置于-20°C儲藏。
[0050] (3)將5次收獲的病毒液混合取樣后進(jìn)行TCID50和RID測定，測定結(jié)果為病毒液 混合樣為l〇 6_5TCID50/ml，50萬RID/ml測定結(jié)果同時(shí)按照國家規(guī)定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測， 并將抗原液凍于_20°C保存。
[0051] 2.豬偽狂犬病病毒抗原液的制備及檢驗(yàn)
[0052] 采用潮汐式生物反應(yīng)器制備病毒液，參照中國專利CN101979518A中制備方法， 將Vero細(xì)胞接種到細(xì)胞生長液PH為7. 0-7. 4聚酯纖維的載體罐中，啟動貼附程序4h，使 Vero細(xì)胞與聚酯纖維混合均勻，啟動細(xì)胞培養(yǎng)程序，使pH值控制在7. 2左右，溶氧為50%， 二氧化碳濃度為5% ;當(dāng)Vero細(xì)胞生長至接種濃度5-40倍時(shí)換用維持液，按M. 0. I.為0. 01 接種PRV病毒，啟動病毒吸附程序，使其完全吸附在細(xì)胞上后，運(yùn)行病毒培養(yǎng)程序使pH值 維持在7. 2 ;溶氧為30%，二氧化碳濃度為3%。培養(yǎng)5天后，收獲病毒液；病毒滴度保持在 107_°TCID 5(l/ml以上。同時(shí)按照國家規(guī)定的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，并將抗原液凍于-20°C保存。
[0053] 3.副豬嗜血桿菌抗原液的制備及檢驗(yàn)
[0054] 副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株凍干菌種，劃線接種于TSA/NAD平板上，置37°C培養(yǎng) 18?24h，選取符合要求的菌落，接種于TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16h，作為一 級種子；按1%的量加入TSB/NAD液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16h，經(jīng)檢驗(yàn)純粹后作為二 級種子；在發(fā)酵罐中加入70% (V/V按罐體積）培養(yǎng)基，將副豬嗜血桿菌血清5型ZJ株菌液 按1%的量加進(jìn)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)，混勻后置37°C，轉(zhuǎn)速180rmp，D0為80 - 0，ρΗ值7. 2? 6. 5,培養(yǎng)16?18h，當(dāng)菌液的濃度0D600達(dá)到2. 5以上、DO值降至0后又開始上升、pH值 降低至6. 5以下時(shí)停止培養(yǎng)，收獲菌液。進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和純粹性檢驗(yàn)后，檢驗(yàn)合格的菌液按 總量的0. 2% (V/V)加入甲醛溶液，放置于37°C滅活24h。
[0055] 4.菌(毒）液的處理
[0056] 菌(毒)液通過超濾設(shè)備進(jìn)行濃縮/透析，有效的除去雜蛋白和內(nèi)毒素，使抗原更純 凈，制備的疫苗無副反應(yīng)、更安全。
[0057] 使用美國密理博公司的中試超濾設(shè)備Cogent Ml。該設(shè)備由三部分裝置組成。其 一是病毒液儲存攪拌裝置，此裝置使用圓筒式塑料制造裝量10L，全不銹鋼接口，下端和一 臺秤相連，可以確定病毒液的裝量。其二是病毒液超濾裝置，該裝置使用316L不銹鋼包夾 具及管路，全部采用衛(wèi)生接口，可夾持過濾及除菌過濾膜包數(shù)片。其三，控制系統(tǒng)，由動力裝 置、控制面板、控制系統(tǒng)等組成，動力裝置使用不銹鋼蠕動泵和硅膠蠕動泵管。此超濾膜包 采用低蛋白吸附改良纖維材料，其蛋白吸附量僅為國際通用的聚醚砜材料的1/4?1/5。本 超濾裝置的進(jìn)液口和回流口及透過口均配有隔膜壓力表及隔膜閥，可控制系統(tǒng)的壓力。
[0058] 先將超濾裝置用蒸餾水反復(fù)沖洗干凈,然后用IN濃度的氫氧化鈉溶液浸泡過夜 12小時(shí)以上，使用時(shí)先用滅菌的蒸餾水反復(fù)沖洗，將NaOH沖洗干凈，使沖洗后的廢棄液接 近中性。然后將預(yù)過濾的病毒液容器通過消毒管道與超濾裝置鏈接，開啟蠕動泵，轉(zhuǎn)速不大 于30%，控制進(jìn)料、回流、透過液的壓力。
[0059] 步驟：沖洗膜面一加壓清洗膜孔一水通量檢測一菌(毒）液超濾一沖洗膜面一加壓 清洗膜孔一堿洗一水洗膜面一加壓清洗膜孔一水通量檢測一堿液保存。
[0060] 病毒液超濾透析首先用1000?5000KD聚醚砜膜包超濾，然后用300?500KD聚 醚砜膜包超濾，可以達(dá)到要求；菌液超濾透析用1000?5000KD聚醚砜膜包超濾，可以達(dá)到 要求。
[0061] 5.疫苗的配制：具體成分配比(見表1、2)
[0062] 表1組合物疫苗各成分含量

【權(quán)利要求】
1. 一種疫苗組合物，所述疫苗組合物包括：免疫量的豬癌病毒抗原、免疫量的豬偽狂 犬病病毒抗原和免疫量的副豬嗜血桿菌抗原。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原為活的形式的全病毒 抗原、滅活的全病毒抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原或合成肽抗原；所述豬偽狂犬病病 毒抗原為減毒全病毒抗原、滅活的全病毒抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原或合成肽抗 原；所述副豬嗜血桿菌抗原為滅活全菌抗原、減毒全菌抗原、亞單位抗原、重組活載體抗原 或合成肽抗原。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原為豬瘟兔化弱毒株；所 述豬偽狂犬病病毒抗原為豬偽狂犬病病毒SA215 (TK7gE7gO株；所述副豬嗜血桿菌抗原 為血清5型副豬嗜血桿菌ZJ株滅活全菌抗原。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原含量為104_°? 106_°TCID5(I/頭份，所述偽狂犬病病毒的含量為104_°?106_°TCID5(I/頭份，所述副豬嗜血桿菌 抗原含量為 1.OX109 ?4.OX109CFU/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗組合物，其中，所述豬瘟病毒抗原含量為105_°TCID5Q/ 頭份，所述偽狂犬病病毒的含量為l〇5_°TCID5(/頭份，所述副豬嗜血桿菌抗原含量為 2X109CFU/mL。
6. -種制備所述疫苗組合物的方法，所述方法包括： 1) 分別增殖培養(yǎng)所述豬瘟病毒，偽狂犬病病毒，加入凍干保護(hù)劑，凍干； 2) 增殖培養(yǎng)所述副豬嗜血桿菌，滅活，加入佐劑。
7. -種免疫試劑盒，所述試劑盒包括：凍干的豬瘟兔化弱毒株和豬偽狂犬病病毒弱毒 株；副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原，其中，所述豬瘟兔化弱毒株、豬偽狂犬病病毒弱毒株與所 述副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原分開保藏。
8. -種免疫試劑盒，所述試劑盒包括：凍干的豬瘟兔化弱毒株、豬偽狂犬病病毒弱毒 株以及副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原，其中，所述豬瘟兔化弱毒株、豬偽狂犬病病毒弱毒株與 所述副豬嗜血桿菌滅活全菌抗原共同凍干保藏。
9. 權(quán)利要求1?6所述的疫苗組合物在制備治療和預(yù)防豬瘟、豬偽狂犬病和副豬嗜血 桿菌感染的藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，乳豬在1?3日齡時(shí)滴鼻免疫所述疫苗組合物， 在50日齡時(shí)仔豬肌注免疫所述疫苗組合物。
【文檔編號】A61K47/42GK104511015SQ201310462393
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月30日
【發(fā)明者】張?jiān)S科, 孫進(jìn)忠, 田克恭 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司