專利名稱：淡水魚細菌性爛鰓病滅活疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種淡水魚疫苗。
背景技術(shù)：
根據(jù)本項目委托廣東省科技情報研究所査新檢索的國外文獻、專利結(jié)果未見有草魚病 疫苗或有關(guān)魚蝦爛鰓、敗血、赤皮等病疫苗的研發(fā)應(yīng)用報導(dǎo)。國內(nèi)從70年代開始，珠江水產(chǎn) 研究所首先利用病魚肝、胰、腎等組織制備組織疫苗，免疫草魚有效預(yù)防草魚出血、爛鰓、
赤皮、腸炎等病發(fā)生。80年代后在全國范圍開始草魚出血病滅活疫苗、活疫苗研發(fā)，并獲得
成功。四川大學(xué)、廣東省藥物研究所與廣東省水產(chǎn)養(yǎng)技術(shù)推廣總站、武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所、
湖南草魚免疫技術(shù)協(xié)作組等單位研發(fā)過草魚細菌爛鰓病、赤皮病、腸炎病疫苗；并投入過中
試，試用后養(yǎng)殖成活率提高至70%以上。但是，爛鰓病疫苗從實驗室產(chǎn)品，至中試品，免疫
保護率一直都比較低，實用性差；因此一直未能在生產(chǎn)中應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決淡水魚爛鰓病滅活疫苗純正抗原培育，克服全菌滅活疫苗免疫力低的不足；本 發(fā)明提供一種爛鰓病抗原的生產(chǎn)方法，具體技術(shù)方案為
將柱狀屈橈桿菌菌種復(fù)蘇后接種于胰蛋白胨培養(yǎng)基復(fù)壯，挑取至少5個單一，黃色，中 央較厚、顯色較深，向四周擴散成較淺假樹根狀菌落，擴大培養(yǎng)后按培養(yǎng)基總量的2%接種到 培養(yǎng)罐，以28'C， 6MS/h的通氣量，培養(yǎng)20 24h，加入終濃度為0.02%的硫柳汞溶液，30' C，經(jīng)2天滅活得淡水魚細菌性爛鰓病抗原。
所述菌種復(fù)蘇是將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基，2『C下培養(yǎng)24h，再置 搖床振動培養(yǎng)24h。
所述菌種擴大培養(yǎng)是將挑取菌落接種于胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，置28'C,培養(yǎng)48h成一級 種子；再將一級菌種接種于胰蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C，經(jīng)24h培養(yǎng)。
本發(fā)明還提供一種含有該抗原的疫苗并提供該疫苗的制備方法，該疫苗不僅能量產(chǎn)，而 且能有效地提高爛鰓病的免疫保護力，具體技術(shù)方案為
一種淡水魚細菌性爛鰓病疫苗，其特征在于包含上述方法制備的淡水魚細菌性爛鰓病抗 原抗原和常用佐劑。所述佐劑為MONTANIDE ISA763A VG和白油。
淡水魚細菌性爛鰓病疫苗的制備方法，其特征在于它是將體積百分比26 30%淡水魚細 菌性爛鰓病抗原，體積百分比14。/。MONTANIDEISA763AVG和體積百分比10%白油混合佐
3劑，體積百分比46% 50%生理鹽水乳化而成得爛鰓病滅活疫苗。
本發(fā)明的有益效果是能批量提供安全、有效、質(zhì)量可控的爛鰓病滅活疫苗。該疫苗為 白色油乳劑，注射免疫魚能延長抗原在組織內(nèi)的貯存時間，緩慢抗原的吸收和剌激單核細胞 產(chǎn)生抗體；該疫苗還有促進免疫細胞的協(xié)同作用，從而增強魚體對爛鰓病低下的免疫功能， 使免疫草魚的免疫保護率達80%以上。
具體實施例方式
爛鰓病滅活疫苗制造前的準(zhǔn)備將制造疫苗所要用的用具、器皿、培養(yǎng)基等在滅菌器用 蒸氣高壓滅菌或用電熱烘箱高溫滅菌，以保證培育抗原的純正性。
菌種復(fù)蘇將凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基，28'C下培養(yǎng)24h，再置搖床 振動培養(yǎng)24h。
種子鑒定與擴大培養(yǎng)取搖床振動培養(yǎng)的菌種，劃線接種于胰蛋白胨瓊脂平板若干個， 置28'C培養(yǎng)48h，挑取致少5個單獨，黃色、假樹根狀擴散型的菌落，接種于胰蛋白胨液體 培養(yǎng)基，置28'C，培養(yǎng)48h成一級種子；再將一級菌種接種于胰蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C，經(jīng) 24h培養(yǎng)。
制苗菌液培養(yǎng)將檢驗合格的菌種按培養(yǎng)基量的2%接種到培養(yǎng)罐，以恒溫28"C， 6M3/h 的通氣量，培養(yǎng)20 24h，收獲25億CFU/ml的培養(yǎng)物。
制苗菌液純粹與活菌數(shù)檢驗菌液培養(yǎng)完成后，取樣，分別接種胰胨培養(yǎng)基斜面二支， 硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基小管二支，胰胨培養(yǎng)基斜面、硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基各一支置37T:，另一支置 25'C培養(yǎng)，觀察3 5天，菌種生長應(yīng)純粹；采用10倍系列稀釋，選擇適宜稀釋度接種胰蛋 白胨瓊脂平板，每個稀釋度接種3個，每個接種0.2ml，使菌液均勻分布，晾干后翻轉(zhuǎn)平板， 28'C培養(yǎng)48h。選擇菌落在40 200個之間計數(shù)，然后將平板平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)除以2。作 為配苗參考。
細菌培養(yǎng)物滅活加入硫柳汞溶液，使其最終濃度為0.02%，在30'C滅活2天。 細菌培養(yǎng)物的滅活檢驗取經(jīng)滅活的細菌培養(yǎng)物樣品，每個樣品lml，接種于50ml胰蛋
白胨培養(yǎng)基中，28°C，培養(yǎng)2天，再從胰胨培養(yǎng)物中取樣，接種胰胨瓊脂斜面2支，每支接
種0.2ml， 28。C下培養(yǎng)3 5天，應(yīng)無菌生長。
佐劑滅菌將MONTANIDE ISA763A VG和白油混合佐劑置油相罐中121'C滅菌30min，
冷卻至20'C以下。
生理鹽水滅菌將設(shè)定配苗的生理鹽水置水相罐中121'C滅菌30min，冷卻至15'C。 爛鰓病滅活疫苗配苗在滅菌后冷卻的水相罐加入檢驗合格的柱狀屈橈桿菌培養(yǎng)物26
·30%,與罐中的生理鹽水?dāng)嚢杈鶆蚝?；加入到乳化罐中與MONTANIDEISA763AVG和白油 混合佐劑，充分混勻；然后開動管線式剪切機乳化60min。
疫苗包裝材料的滅菌將裝載疫苗的塑料瓶、膠塞等用滅菌器12rC滅菌50min，冷卻
至常溫。
疫苗的分裝將已乳化的疫苗定量分裝，加蓋密封，4'C保存。
疫苗成品檢驗
物理性狀為白色均勻乳劑，靜置一段時間后，上層白色乳劑、底部為水沁出層。振搖后 呈均勻乳狀液。
無菌檢驗按(《中華人民共和國獸藥典》2005年版、第三部)附錄15頁進行，結(jié)果無菌 生長。
汞類殘留量測定按(《中華人民共和國獸藥典》2005年版、第三部)附錄24頁進行，檢 驗結(jié)果汞類殘留量0.0083%。
安全檢驗每批疫苗隨機抽樣3瓶，混均勻后，以0.2ml/尾，腹腔注射體重13g/尾草魚20 尾，放水簇箱飼養(yǎng)觀察15天，結(jié)果免疫魚全部存活。
效力檢驗用13g/尾健康草魚20尾，各腹腔注射草魚爛鰓滅活疫苗0.2ml，另取條件相同 草魚20尾，不接種疫苗，作對照，飼養(yǎng)9天后，用柱狀屈橈桿菌強毒株腹腔注射攻毒，每尾 注射0.88億個菌。放回水池，水溫28-C左右，飼養(yǎng)觀察15天，對照魚組草魚死亡12尾以上， 各組計算死亡率后用以下公式計算免疫保護率，免疫組免疫保護率90%。
免疫保護率-對照組魚的死亡率-免疫組的死亡率x腦
對照組魚的死亡率
權(quán)利要求
1.淡水魚細菌性爛鰓病抗原的制備方法，包括以下步驟將屈橈桿菌菌種復(fù)蘇后接種于胰蛋白胨培養(yǎng)基復(fù)壯，挑取至少5個單一，黃色，中央較厚、顯色較深，向四周擴散成較淺假樹根狀菌落，擴大培養(yǎng)后按培養(yǎng)基量2％接種到培養(yǎng)罐，以28℃，6M3/h的通氣量，培養(yǎng)20～24h，加入硫柳汞0.02％，30℃，經(jīng)2天滅活得淡水魚細菌性爛鰓病抗原。
2. 權(quán)利要求1所述淡水魚細菌性爛鰓病抗原的制備方法，其特征在于所述菌種復(fù)蘇是將 凍干菌種啟封后，接入液體胰蛋白胨培養(yǎng)基，28'C下培養(yǎng)24h，再置搖床振動培養(yǎng)24h。
3. 權(quán)利要求1所述淡水魚細菌性爛鰓病抗原的制備方法，其特征在于所述擴大培養(yǎng)是將 挑取菌落接種于胰蛋白胨液體培養(yǎng)基，置28'C，培養(yǎng)48h成一級種子；再將一級菌種接種于 胰蛋白胨培養(yǎng)基中，28°C，經(jīng)24h培養(yǎng)。
4. 淡水魚細菌性爛鰓病疫苗，其特征在于包含權(quán)利要求1所述方法制備的抗原和佐劑。
5. 權(quán)利要求4所述淡水魚細菌性爛鰓病疫苗，其特征在于所述佐劑為MONTANIDE ISA 763A VG和白油。
6. 權(quán)利要求4或5所述疫苗的制備方法，是將體積百分比26 30%淡水魚細菌性爛鰓病 抗原，體積百分比14。/。MONTANIDEISA763AVG和體積百分比10%白油混合佐劑，體積百 分比46% 50%生理鹽水乳化而成得爛鰓病滅活疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及淡水魚細菌性爛鰓病抗原的制備，含有該抗原的疫苗及該疫苗的制備方法。淡水魚細菌性爛鰓病抗原的制備方法，是將屈橈桿菌菌種接種胰蛋白胨培養(yǎng)基復(fù)壯，鑒定，擴大培養(yǎng)后按培養(yǎng)基量2％接種到培養(yǎng)罐，培養(yǎng)20～24h，滅活得爛鰓病抗原。淡水魚細菌性爛鰓病疫苗包含淡水魚細菌性爛鰓病抗原和佐劑，佐劑為MONTANIDE ISA 763A VG和白油，疫苗的制備方法，其特征在于它是將抗原，佐劑，生理鹽水乳化而成。本發(fā)明疫苗能批量提供安全、有效、質(zhì)量可控的爛鰓病滅活疫苗，還有促進免疫細胞的協(xié)同作用，增強魚體對爛鰓病低下的免疫功能，使免疫草魚的免疫保護率達80％以上。
文檔編號A61K39/02GK101575364SQ20091003986
公開日2009年11月11日 申請日期2009年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月31日
發(fā)明者江小燕, 白岳強, 霞 羅, 許淑英, 鄧國成, 黃志斌 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所