本發(fā)明涉及mg快速檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法。

背景技術(shù)：

目前，用于檢測雞毒支原體(mg)的方法主要包括分離培養(yǎng)法、免疫熒光法、核酸探針法和pcr法。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法費時，操作復(fù)雜，對技術(shù)要求高，無法快速鑒別mg強、弱毒株，毒力的測定要通過雞胚接種和spf雞感染等致病性試驗，費時、成本比較高，無法滿足生產(chǎn)實際的需要，除非在條件具備的實驗室作特殊的檢測外，一般不將分離培養(yǎng)作為mg檢測方法；免疫熒光法適用于mg急性感染期檢測，此時患病禽體內(nèi)存在大量的病原。但患病禽在受到抗生素治療后或轉(zhuǎn)為慢性感染時，血清陽性禽支原體數(shù)量不足以用免疫熒光技術(shù)檢出而易出現(xiàn)假陰性；核酸探針法雖然簡單、靈敏，但各種類型支原體之間常有交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽性，影響試驗的準(zhǔn)確性。pcr技術(shù)不但可以克服支原體培養(yǎng)難、易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的缺點，還具有敏感性高、特異性強的特點，而且不需要樣品中必須含有活著的mg。但普通pcr方法雖然操作簡便但由于其檢測的靈敏度有限，極易出現(xiàn)假陰性，影響對樣品感染mg情況的客觀判斷。近年來發(fā)展迅速的實時熒光定量pcr方法，雖然其敏感性非常好且能有效避免污染，但由于需要昂貴的試驗器材及試劑，且對實驗室環(huán)境要求高以及在檢測時易出現(xiàn)假陽性等缺點而難以推廣應(yīng)用。套式pcr方法與其他pcr方法相比，具有靈敏度高、特異性好且經(jīng)濟易于推廣等諸多優(yōu)點。

在種雞各種防控支原體措施中，免疫尤其活疫苗免疫依然是綜合控制的核心和重點。國內(nèi)用于預(yù)防禽支原體的疫苗主要是f株、ts-11株和6/85株。雞群中使用弱毒疫苗會導(dǎo)致雞群長期受到弱毒疫苗株的污染，從而干擾mg感染的檢測，不利于群中mg的控制和凈化，因此，建立一種特異、敏感、快速的鑒別mg強毒株和弱毒疫苗株的檢測方法是非常必要的。在鑒別雞毒支原體強毒株和弱毒疫苗株的pcr檢測方面，目前只有鑒別mg強毒株和弱毒疫苗f株pcr檢測方法，但無鑒別mg強毒株和弱毒疫苗6/85株pcr檢測方法。

綜上可知，現(xiàn)有技術(shù)在實際使用上顯然存在不便與缺陷，所以有必要加以改進(jìn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，主要用于mg6/85株疫苗免疫的父母代種雞及其雞胚和后代商品肉雞的檢測，該方法即可鑒別出mg6/85株，又可以檢測到樣品中極微量的mg感染，最低檢測0.18fg/μl，并且具有良好的特異性，可直接應(yīng)用于家禽mg檢測及防治工作中。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，包括以下步驟：

a、引物設(shè)計；

對mg的mgc2基因序列進(jìn)行同源性分析，參考mgs6株和mg6/85株的mgc2基因序列設(shè)計合成特異性引物，包括外套引物和內(nèi)套引物，引物序列如下：

外套引物：上游引物mgc201-f：5，-ttttatccagtagtgggtgc-3，；

下游引物mgc201-r：5，-ttatctaggtccattttgtg-3，；

內(nèi)套引物：上游引物mgc202-f：5，-cgcaatttggtcctaatccccaaca-3，；

下游引物mgc202-r：5，-taaacccacctccagctttatttcc-3，；

b、樣品dna提取；

c、設(shè)置pcr反應(yīng)條件；

外套引物反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2.5μl、2.5mmol/ldntp2.0μl、5u/μltaq酶0.25μl、10pmol/μl上下游引物各1.0μl、樣品dna1.0μl，加水補齊至25.0μl；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)，72℃延伸10min；

內(nèi)套引物反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2.5μl、2.5mmol/ldntp2.0μl、5u/μltaq酶0.25μl、10pmol/μl上下游引物各1.0μl、第1輪pcr擴增產(chǎn)物1.0μl、加水補齊至25.0μl；

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)，72℃延伸10min；

d、套式pcr擴增；

以樣品dna作為模板，利用外套引物mgc201-f和mgc201-r進(jìn)行第一輪pcr擴增，再以第一輪pcr擴增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪內(nèi)套引物mgc202-f和mgc202-r的pcr擴增；

e、將兩輪擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳檢測。

根據(jù)本發(fā)明的鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，所述外套引物與內(nèi)套引物對mg6/85株的擴增片段分別為675bp、149bp；所述外套引物與內(nèi)套引物對mgs6株的擴增片段分別為738bp、212bp。

根據(jù)本發(fā)明的鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，所述樣品dna提取可使用細(xì)菌基因組dna提取試劑盒、水煮法或堿裂解法。

根據(jù)本發(fā)明的鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，所述水煮法具體為：取mg培養(yǎng)液1.0～1.3ml于1.5ml離心管中，4℃、10000r/min離心30min，棄上清液，沉淀中加入75μl滅菌超純水，煮沸10min，4℃、10000r/min離心30min，取上清液于試管中。

根據(jù)本發(fā)明的鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法，所述堿裂解法具體為：取mg培養(yǎng)液1.0～1.3ml于1.5ml離心管中，4℃、10000r/min離心30min，棄上清液，沉淀中加入567μl的te緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸??；加入30μl10％sds和15μl的蛋白酶k，混勻，于37℃溫育1h；加入100μl5mol/lnacl，充分混勻，再加入80μlctab/nacl溶液，混勻后再65℃溫育10min；加入與離心管內(nèi)液體等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到dna沉淀下來，沉淀可稍加離心；沉淀用1ml的70％乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，重溶于20μl、含rnasea-25ng/ml的te緩沖液中。

本發(fā)明通過參考mgs6株和mg6/85株的mgc2基因序列設(shè)計合成兩對套式pcr特異性引物mgc201-f/mgc201-r和mgc202-f/mgc202-r，然后提取樣品dna并以其為模板，利用外套引物mgc201-f/mgc201-r進(jìn)行第一輪pcr擴增，再以第一輪pcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪內(nèi)套引物mgc202-f/mgc202-r的pcr擴增，并將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若外套引物檢測到738bp或內(nèi)套引物檢測到212bp條帶存在時，表明待檢樣品感染了mgs6株；若外套引物檢測到675bp或內(nèi)套引物檢測到149bp條帶存在時，表明待檢樣品感染了mg6/85株。該方法即可鑒別使用mg6/85株疫苗免疫的父母代種雞及其雞胚和后代商品肉雞中mg野毒株與mg6/85株，又可以檢測到家禽樣品中極微量的mg感染，并且具有良好的特異性，可直接應(yīng)用于家禽mg檢測及防治工作中。

附圖說明

圖1是外套引物pcr擴增產(chǎn)物電泳圖；

圖2是內(nèi)套引物pcr擴增產(chǎn)物電泳圖；

圖3是部分臨床樣品pcr擴增產(chǎn)物電泳圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種鑒別mg6/85株的套式pcr檢測方法。該套式pcr檢測方法包括以下步驟：

步驟一、引物設(shè)計。

利用dnastar軟件對genbank中登錄的mg的mgc2基因序列進(jìn)行同源性分析后，參考mgs6株(登錄號：cp006916.2)和mg6/85株(登錄號：jq770178.1)的mgc2基因序列設(shè)計合成兩對套式pcr特異性引物，見表1。

表1套式pcr引物列表

從表1中可看出，外套引物mgc201-f/mgc201-r對mgs6株預(yù)期擴增片段大小為738bp，對mg6/85株預(yù)期擴增片段大小為675bp；內(nèi)套引物mgc202-f/mgc202-r對mgs6株的預(yù)期擴增片段大小為212bp，對mg6/85株的預(yù)期擴增片段大小為149bp。

步驟二、樣品dna提取。

樣品dna的提取可通過細(xì)菌基因組dna提取試劑盒、水煮法或堿裂解法來實現(xiàn)。

其中水煮法具體為：取mg培養(yǎng)液1.0～1.3ml于1.5ml離心管中，4℃、10000r/min離心30min，棄上清液，沉淀中加入75μl滅菌超純水，煮沸10min，4℃、10000r/min離心30min，取上清液于試管中。

堿裂解法具體為：

(1)取mg培養(yǎng)液1.0～1.3ml于1.5ml離心管中，4℃、10000r/min離心30min，棄上清液，沉淀中加入567μl的te緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮。

(2)加入30μl10％sds和15μl的蛋白酶k，混勻，于37℃溫育1h。

(3)加入100μl5mol/lnacl，充分混勻，再加入80μlctab/nacl溶液，混勻后再65℃溫育10min。

(4)加入與離心管內(nèi)液體等體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4-5min，將上清液轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到dna沉淀下來，沉淀可稍加離心。

(5)沉淀用1ml的70％乙醇洗滌后，離心棄乙醇，在潔凈工作臺中稍加干燥，重溶于20μl、含rnasea-25ng/ml的te緩沖液中。

步驟三、設(shè)置套式pcr反應(yīng)條件。

外套引物反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2.5μl、2.5mmol/ldntp2.0μl、5u/μltaq酶0.25μl、10pmol/μl上下游引物各1.0μl、樣品dna1.0μl，加水補齊至25.0μl。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)，72℃延伸10min。

內(nèi)套引物反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系：10×pcrbuffer2.5μl、2.5mmol/ldntp2.0μl、5u/μltaq酶0.25μl、10pmol/μl上下游引物各1.0μl、第1輪pcr擴增產(chǎn)物1.0μl、加水補齊至25.0μl。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共32個循環(huán)，72℃延伸10min。

步驟四、套式pcr擴增。

使用建立的套式pcr進(jìn)行擴增，以樣品dna作為模板，利用外套引物mgc201-f和mgc201-r進(jìn)行第一輪pcr擴增，再以第一輪pcr擴增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪內(nèi)套引物mgc202-f和mgc202-r的pcr擴增。

步驟五、將兩輪擴增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳檢測。

將第一輪與第二輪的pcr擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，通過擴出條帶鑒別是否感染mg病毒，并通過條帶大小鑒別是否感染mg6/85株。

參見圖1與圖2，分別對dl1000dnamarker、mgs6株、mg6/85株和臨床分離株進(jìn)行套式pcr擴增，并將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，電泳結(jié)果如圖所示，圖中，m為dl1000dnamarker；1為mgs6株；2為mg6/85株；3～6為臨床分離株；7為陰性對照，mgs6株外套引物擴增產(chǎn)物檢測到738bp條帶，內(nèi)套引物擴增產(chǎn)物檢測到212bp條帶；mg6/85株外套引物檢測到675bp，內(nèi)套引物檢測到149bp條帶；臨床分離株的兩輪擴增產(chǎn)物均檢測到擴出條帶。

為了更好的體現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)越性和技術(shù)效果，對套式pcr檢測方法的特異性和敏感性進(jìn)行試驗分析。

特異性分析：運用建立的套式pcr檢測方法，分別對雞毒支原體、大腸桿菌、沙門氏菌、雞滑液囊支原體分別進(jìn)行擴增。結(jié)果表明僅雞毒支原體擴出了與預(yù)期相符的目的條帶，而大腸桿菌、沙門氏菌和雞滑液囊支原體均未擴出條帶，表明該套式pcr檢測方法具有較好的特異性。

敏感性分析：經(jīng)微量核酸檢測儀測得提取的樣品dna含量為180ng/μl，按照套式pcr最佳反應(yīng)程序和體系，將提取的樣品dna作10倍梯度的倍比稀釋后進(jìn)行pcr擴增。結(jié)果表明，樣品dna含量稀釋到0.18fg/μl，還能擴增到清晰的目的條帶。

本發(fā)明一具體應(yīng)用實例如下：用建立的套式pcr檢測方法對某種雞場2場6批次孵化后期死胚(主要是啄殼不全的死胚)各30份進(jìn)行mg檢測，檢測結(jié)果如表2、圖3(圖中m為dl2000dnamarker；1～23為部分病例檢測結(jié)果；24為陰性對照)所示，2場6批次孵化后期死胚mg感染率在0％～73.3％，陽性率差異較大；將pcr產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，陽性樣品均得到212bp條帶，而無149bp條帶。對檢測結(jié)果分析，使用本發(fā)明設(shè)計的套式pcr即可檢測到雞胚樣品中極微量的mg，從而評估批次種雞防控mg情況，也可鑒別是否感染mg6/85株，這是普通pcr難以做到的。

表2雞胚樣品套式pcr檢測結(jié)果

綜上所述，本發(fā)明通過參考mgs6株和mg6/85株的mgc2基因序列設(shè)計合成兩對套式pcr特異性引物mgc201-f/mgc201-r和mgc202-f/mgc202-r，然后提取樣品dna并以其為模板，利用外套引物mgc201-f/mgc201-r進(jìn)行第一輪pcr擴增，再以第一輪pcr產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪內(nèi)套引物mgc202-f/mgc202-r的pcr擴增，并將擴增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，若外套引物檢測到738bp或內(nèi)套引物檢測到212bp條帶存在時，表明待檢樣品感染了mgs6株；若外套引物檢測到675bp或內(nèi)套引物檢測到149bp條帶存在時，表明待檢樣品感染了mg6/85株。該方法即可鑒別使用mg6/85株疫苗免疫的父母代種雞及其雞胚和后代商品肉雞中mg野毒株與mg6/85株，又可以檢測到家禽樣品中極微量的mg感染，并且具有良好的特異性，可直接應(yīng)用于家禽mg檢測及防治工作中。

當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實施例，在不背離本發(fā)明精神及其實質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員當(dāng)可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。