本發(fā)明屬于體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測用引物對、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

支原體（mycoplasma）又稱霉形體，是一種介于細菌和病毒之間的能獨立生存的最小微生物之一，是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小介于細菌與病毒之間，直徑0.1-0.3μm，可通過濾菌器(0.22μm)，在自然界分布十分廣泛。細胞培養(yǎng)過程中支原體污染初期，細胞常常不引起明顯病變，也不導(dǎo)致培養(yǎng)液渾濁，難以憑肉眼發(fā)現(xiàn)，高倍鏡下觀察細胞無明顯變化。在污染后期支原體吸附在細胞表面，破壞細胞膜的完整性，影響細胞信號傳遞，消耗細胞的核苷庫，引起細胞變形、細胞染色體異常等。由于支原體對多種抗生素耐藥，在細胞長期培養(yǎng)過程中經(jīng)常出現(xiàn)且極難消除，并且污染的傳播十分迅速。尤其在干細胞實驗室，處理的樣本是來自不同醫(yī)院的臍帶和胎盤，這些樣本具有極高的支原體攜帶風(fēng)險。一旦發(fā)生支原體污染，所引起的不良后果將是毀滅性的。因此，進行支原體檢測與防治十分必要。

常見的支原體檢測方法有直接培養(yǎng)法和間接法。直接檢測法是指支原體的直接培養(yǎng)分離法；間接法包括dna熒光染色法、dna雜交法、酶聯(lián)免疫吸附試驗法、免疫熒光試驗、電鏡觀察、生物化學(xué)測定等；目前，最常應(yīng)用的是培養(yǎng)法和熒光染色法。培養(yǎng)法所需時間長，一個檢測周期28d，且靈敏度差；dna熒光染色法因背景熒光的存在，使實驗結(jié)果不準(zhǔn)確。而其他方法由于受價格、實驗條件限制，或因靈敏度低、操作復(fù)雜、費用較高等原因不利于干細胞的培養(yǎng)。因此，建立一種高效、快速、敏感度高的檢測方法十分必要。pcr作為一種簡便快速、特異、靈敏的支原體檢測方法，已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛用于支原體污染的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測用引物對、試劑盒及其檢測方法，應(yīng)用本發(fā)明檢測試劑盒進行檢測，操作作簡便，所需時間短，具有很高的靈敏性，本發(fā)明試劑盒可應(yīng)用于干細胞庫臍帶和胎盤樣本制備前支原體污染的檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測用引物對：

上游引物myco-f：5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’；

下游引物myco-r：5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’。

本發(fā)明還提供一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括上述引物對、pcr試劑、陽性對照、陰性對照和pcr反應(yīng)管。

進一步，優(yōu)選的是，所述pcr試劑為2×powertaqpcrmastermix。

進一步，優(yōu)選的是，所述陽性對照的制備方法是被支原體污染的細胞培養(yǎng)上清，經(jīng)采用權(quán)利要求1所述的引物對pcr擴增后，瓊脂糖凝膠電泳，將在400-500bp處獲得清晰條帶切膠回收，即得陽性對照。

進一步，優(yōu)選的是，所述陽性對照的制備方法是干細胞培養(yǎng)過程中經(jīng)分離培養(yǎng)法檢測確認被支原體污染的細胞，用巴氏吸管或移液器吸取細胞培養(yǎng)上清1ml，取3μl作為待測樣本，之后經(jīng)采用權(quán)利要求1所述的引物對pcr擴增后，再經(jīng)質(zhì)量百分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在400-500bp處會獲得清晰條帶，將在400-500bp處獲得清晰條帶的這一產(chǎn)物切膠回收，即得陽性對照；

所述的pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、待測樣本3μl；

所述pcr擴增程序為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

進一步，優(yōu)選的是，所述陰性對照為經(jīng)滅菌的雙蒸水。

進一步，優(yōu)選的是，所述的滅菌方法采用高溫高壓滅菌法。

進一步，優(yōu)選的是，所述的滅菌溫度為120℃，壓力為103.4kpa，時間為15min。

本發(fā)明同時提供一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測方法，采用上述人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒，具體如下：在不同的pcr反應(yīng)管中加入陽性對照pcr反應(yīng)體系、陰性對照pcr反應(yīng)體系、待測樣本pcr反應(yīng)體系，之后分別進行pcr擴增，得到的產(chǎn)物分別經(jīng)質(zhì)量百分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析；

當(dāng)待測樣本pcr反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物與陰性對照pcr反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物一樣，在400-500bp處均無擴增條帶，則說明待檢樣本未被支原體污染；

當(dāng)待測樣本pcr反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物與陽性對照pcr反應(yīng)體系得到的產(chǎn)物在400-500bp處出現(xiàn)相同的擴增條帶，則說明待檢樣本被支原體污染；

所述的陽性對照pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、陽性對照0.2~10ng/μl3μl；；

所述的陰性對照pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、陰性對照3μl；

所述的待測樣本pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、待測樣本3μl；所述的待測樣本為內(nèi)含待處理臍帶或胎盤組織的人臍帶保護液或人胎盤保護液；

所述pcr擴增程序為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

人臍帶保護液或人胎盤保護液均為常規(guī)可以購買到的產(chǎn)品。

本發(fā)明所采用的pcr試劑為2×powertaqpcrmastermix，為dnapolymerase、buffer、dntpmixture的2倍濃度的混合物。

所述專用引物在制備臍帶、胎盤保護液中支原體檢測試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明提供的臍帶、胎盤保護液中支原體檢測試劑盒的檢測原理如下：

根據(jù)細胞培養(yǎng)過程中常見支原體16~23srrna之間的間隔區(qū)保守序列，設(shè)計一對屬特異性引物（myco-f，myco-r）。該引物對和常見支原體的保守序列完全配對，保證了細胞培養(yǎng)常見支原體檢測方法的特異性。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

應(yīng)用本發(fā)明提供的臍帶、胎盤保護液中支原體檢測試劑盒進行檢測，操作作簡便，所需時間短，具有很高的靈敏性。與其他細胞培養(yǎng)支原體檢測方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的劑盒對臍帶保護液、胎盤保護液進行檢測，可以在細胞開始培養(yǎng)前對其是否被支原體污染進行檢測，避免因盲目開始細胞培養(yǎng)造成的經(jīng)濟損失；整個檢測約需1.25h，所需時間短，利于后續(xù)實驗的開展；從根源上杜絕支原體進入細胞培養(yǎng)室，減少支原體交叉污染細胞的可能性。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于干細胞庫臍帶和胎盤樣本制備前支原體污染的檢測。

由于支原體較小且細胞常常不引起明顯變化，用電子顯微鏡檢查檢出率太低。直接培養(yǎng)法是檢測支原體污染中最為直接、可靠的方法，支原體對環(huán)境的影響敏感，容易被滅活，而且分離培養(yǎng)操作相對繁瑣，所需時間較長（3~5周），有些支原體不能在培養(yǎng)基培養(yǎng)出來（如m.hyorhinis），實驗需同時培養(yǎng)支原體株作為陽性對照，易造成污染，靈敏度差。因此只能夠?qū)χгw污染進行定性觀察。dna熒光染色法較分離培養(yǎng)法縮短了檢測周期（3~4d），該方法易出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果，假陽性主要由于細胞碎片染色被誤認為是支原體，假陰性可能由于支原體污染較輕，dna熒光染色液或指示細胞被支原體染污，dna熒光染色靈敏度不高。一步法支原體檢測試劑整個過程只需一步，檢測結(jié)果顏色變化顯著，極易觀察?？焖僦гw檢測試劑依據(jù)支原體特有的代謝產(chǎn)物進行顯色反應(yīng)，陽性會產(chǎn)生藍綠色，代謝產(chǎn)物濃度越高，顏色越深。這兩種進口試劑雖然比較簡捷，但不能區(qū)分支原體的具體種類，長期使用成本較高。

附圖說明

圖1是人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的應(yīng)用圖；

圖2是人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的靈敏度檢測圖；

圖3是人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的特異性檢測圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用材料、試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑。

本發(fā)明的百分號如無特殊說明，均為質(zhì)量百分數(shù)。

pcr試劑：2×powertaqpcrmastermix，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；ultrapowertm核酸染料：北京百泰克生物技術(shù)有限公司；

乙二胺四乙酸二鈉（na2edta）、三羥甲基氨基甲烷（tris）、乙酸（aceticacid）、瓊脂糖：北京全式金生物科技有限公司；

dnamaker：寶生物工程(大連)有限公司；

pcr反應(yīng)管：愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司；

本發(fā)明待測樣本的取得方式是：在樣本預(yù)處理間的無菌操作臺內(nèi)，將裝有臍帶及其保護液或者裝有胎盤及其保護液的采集盒子輕輕晃動后打開，用移液器從一側(cè)吸取保護液1ml至1.5ml離心管中，即得。

實施例1人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的制備

一、引物合成

人工合成以下引物對：

上游引物myco-f：5’-ggcgaatgggtgagtaacacg-3’；（seqidno.1）

下游引物myco-r：5’-cggataacgcttgcgacctatg-3’。（seqidno.2）

用超純水配制引物并稀釋至2.5μm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、陽性對照制備

干細胞培養(yǎng)過程中經(jīng)分離培養(yǎng)法檢測確認被支原體污染的細胞，用巴氏吸管或移液器吸取細胞培養(yǎng)上清1ml，取3μl作為待測樣本，之后經(jīng)采用上述一步驟的引物對pcr擴增后，再經(jīng)質(zhì)量百分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在400-500bp處獲得清晰條帶，經(jīng)切膠回收，回收產(chǎn)物即得陽性對照，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

所述的pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、待測樣本3μl；

所述pcr擴增程序為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

三、陰性對照的制備

用雙蒸水經(jīng)120℃高溫103.4kpa高壓滅菌15min，分裝后獲得。

四、試劑盒的組裝

該試劑盒由以下物質(zhì)組成：步驟一合成的引物、步驟二制備的陽性對照、步驟三制備的陰性對照、pcr試劑（2×powertaqpcrmastermix）和pcr反應(yīng)管。

實施例2人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的應(yīng)用

采用實施例1制備的試劑盒對樣本進行檢測。

一、待測樣本的取得

按照前述方法，取未被支原體污染的臍帶保護液取三支作為a組待測樣本；被支原體污染的臍帶保護液取三支作為b組待測樣本；未被支原體污染的胎盤保護液取三支作為c組待測樣本；被支原體污染的胎盤保護液取三支作為d組待測樣本。

二、pcr擴增

1.將a、b、c、d組作為待測樣本，按照擴增體系往pcr反應(yīng)管內(nèi)加入如下試劑：

2×powertaqpcrmastermix5μl；

上游引物2.5μm1μl（2.5μm）；

下游引物2.5μm1μl（2.5μm）；

待測樣本3μl。

同時取陽性對照和陰性對照各3μl（陽性對照濃度為0.2~10ng/μl），試驗設(shè)3個重復(fù)，按照上述擴增體系往pcr管內(nèi)分別加入pcrmastermix、上游引物、下游引物。

2.按如下反應(yīng)程序設(shè)置pcr擴增程序：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

三、結(jié)果判定

pcr產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量百分數(shù)）的瓊脂糖凝膠電泳分析并拍照，如圖1，陽性對照對應(yīng)的點樣孔上方出現(xiàn)擴增條帶（400-500bp處），陰性對照對應(yīng)的點樣孔上方無擴增條帶。a、c組3個重復(fù)對應(yīng)的點樣孔上方均無擴增條帶，b、d組3個重復(fù)對應(yīng)的點樣孔上方均出現(xiàn)擴增條帶。3次重復(fù)試驗結(jié)果一致，表明該方法重復(fù)性良好。

實施例3人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的靈敏度檢測

采用實施例1制備的試劑盒對樣本進行檢測。

一、待測樣本的取得

干細胞培養(yǎng)過程中經(jīng)分離培養(yǎng)法檢測確認被支原體污染的細胞，用巴氏吸管或移液器吸取細胞培養(yǎng)上清1ml，取3μl作為待測樣本，之后經(jīng)采用上述一步驟的引物對pcr擴增后，再經(jīng)質(zhì)量百分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在400-500bp處獲得清晰條帶，經(jīng)切膠回收，回收產(chǎn)物。

所述的pcr反應(yīng)體系為pcr試劑2×powertaqpcrmastermix5μl、上游引物2.5μm1μl、下游引物2.5μm1μl、待測樣本3μl；

所述pcr擴增程序為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

測定上述膠回收產(chǎn)物基因組的濃度（125.9ng/μl），進行10倍梯度稀釋，取以下稀釋度：10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9ng/μl，分別作檢測組1、2、3、4、5、6，每組作3個重復(fù)，取陰性對照3個重復(fù)。

二、pcr擴增

1.分別將檢測組1、2、3、4、5、6及陰性對照組，按照擴增體系往pcr反應(yīng)管內(nèi)加入如下試劑：

2×powertaqpcrmastermix5μl；

上游引物2.5μm1μl；

下游引物2.5μm1μl；

待測樣本3μl。

同時取陽性對照和陰性對照各3μl（陽性對照濃度為0.2~10ng/μl），也作為待測樣本，試驗設(shè)3個重復(fù)，擴增體系與上述相同。

2.按如下反應(yīng)程序設(shè)置pcr擴增程序：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

三、結(jié)果判定

取10μlpcr產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量百分數(shù)）的瓊脂糖凝膠電泳分析并拍照，如圖2，陰性對照組3個重復(fù)對應(yīng)的點樣孔上方均無擴增條帶，檢測組1、2、3、4、5三個反應(yīng)對應(yīng)的點樣孔上方均出現(xiàn)擴增條帶（400-500bp間），檢測組6三個反應(yīng)對應(yīng)的點樣孔上方均無擴增條帶。檢測結(jié)果說明，最低可檢測到10^-8稀釋度的dna濃度，即靈敏度為1.26pg/ml。

實施例4人臍帶、胎盤保護液支原體檢測試劑盒的特異性檢測

制備含支原體模板和不含支原體模板的保護液樣本，采用實施例1制備的試劑盒對樣本進行檢測。

一、待測樣本的取得

經(jīng)確認未被支原體污染臍帶保護液、胎盤保護液分別取6只，其中3只臍帶保護液做檢測組1，另3只臍帶保護液按體積比1:1加入陽性對照，放置24h后作為檢測組2；3只胎盤保護液做檢測組3，另3只胎盤保護液按體積比1:1加入陽性對照，放置24h后作為檢測組4。

二、pcr擴增

1.分別將檢測組1、2、3、4，按照擴增體系往pcr反應(yīng)管內(nèi)加入如下試劑：

2×powertaqpcrmastermix5μl；

上游引物2.5μm1μl；

下游引物2.5μm1μl；

待測樣本3μl。

同時取陽性對照和陰性對照各3μl（陽性對照濃度為0.2~10ng/μl），也作為待測樣本，試驗設(shè)3個重復(fù)，擴增體系與上述相同。

2.按如下反應(yīng)程序設(shè)置pcr擴增程序：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃30s，25個循環(huán)；72℃5min；16℃∞。

三、結(jié)果判定

pcr產(chǎn)物經(jīng)1%（質(zhì)量百分數(shù)）的瓊脂糖凝膠電泳分析并拍照，如圖3，陰性對照組組3個重復(fù)對應(yīng)的點樣孔上方均無擴增條帶，陽性對照組組3個重復(fù)對應(yīng)的點樣孔上方均出現(xiàn)擴增條帶；檢測組1、3三個反應(yīng)對應(yīng)的點樣孔上方均無擴增條帶，檢測組2、4三個反應(yīng)對應(yīng)的點樣孔上方均出現(xiàn)擴增條帶（400-500bp間）。檢測結(jié)果說明在陽性對照臍帶保護液、胎盤保護液中，均能檢測出陽性，且條帶單一，檢測結(jié)果不受保護液成分影響具有特異性。

同時，本發(fā)明還對支原體污染檢測方法進行比較，比較結(jié)果如表1所示。

表1支原體污染檢測方法比較

目前，細胞培養(yǎng)的支原體檢測最常應(yīng)用的是培養(yǎng)法、dna熒光染色法和pcr法。在檢測價格方面，一步法支原體檢測試盒價格昂貴，dna熒光染色法和pcr法價格相當(dāng)，直接培養(yǎng)法最便宜；在檢測時限方面，直接培養(yǎng)法所需時間最長，dna熒光染色法至少需3～4d，pcr法需1.25h左右檢測時間最短。在可操作性方面，直接培養(yǎng)法、dna熒光染色法需進行大量的前期工作，一步法支原體檢測試盒、pcr法操作簡便易行，可操作性強；在結(jié)果判定方面，dna熒光染色法因背景熒光的存在，使實驗結(jié)果判定有一定的主觀性，不準(zhǔn)確；pcr法結(jié)果判定簡單、客觀；在檢測靈敏度方面，直接培養(yǎng)法、dna熒光染色法靈敏度一般，一步法支原體檢測試盒較好，pcr法最靈敏。直接培養(yǎng)法操作繁瑣、環(huán)節(jié)多、時間長，dna熒光染色法結(jié)果判定有一定的主觀性，一步法支原體檢測試盒法價格較昂貴，而pcr法檢測準(zhǔn)確、快速、簡便易行，是作為細胞培養(yǎng)支原體污染的前期檢測快速而有效的方法。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

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<110>云南舜喜再生醫(yī)學(xué)工程有限公司

<120>一種人臍帶、胎盤保護液支原體檢測用引物對、試劑盒及其檢測方法

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