本發(fā)明涉及一種檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法，屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

沙門氏菌為兩端鈍圓的革蘭氏陰性菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，其他都有周身鞭毛。沙門氏菌是一種常見的人畜共患病原體，不僅能夠引起胃腸炎，還會(huì)引起敗血癥、傷寒及腸外灶性感染等多種癥候群。尤其以鼠傷寒沙門氏菌為代表的病原菌在食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病預(yù)防等方面造成了巨大的威脅,對(duì)人體健康造成了很大危害，因而受到人們的強(qiáng)烈關(guān)注。

目前，主要用來檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法包括生化鑒定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺點(diǎn)與限制，需經(jīng)過增菌培養(yǎng)、選擇篩選、生化鑒定、血清分型等流程,耗時(shí)一周左右,不利于快速、準(zhǔn)確地對(duì)食品中的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)。因此,有必要建立一種高效快速檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法中特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測(cè)速度快的檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法。

本發(fā)明是通過以下步驟得到的：

本發(fā)明中一共用到了4條dna鏈，其序列分別是：

aptamer：5’-agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga-3’（seqidno.1）；

primer：5’-tcttttccttttcgggcattact-3’（seqidno.2）；

hp：5’-agtaatgcccgaaaaggaaaagaaacgcattact-3’（seqidno.3）；

helper：5’-cccaacccgccctaccccctcagcttttagtaatgcg-3’（seqidno.4）。

其中aptamer兩端序列與primer探針兩端序列分別互補(bǔ)結(jié)合，形成拱形探針結(jié)構(gòu)。hp的下劃線部分與primer完全互補(bǔ)，黑體下劃線標(biāo)注部分與helper的黑體下劃線標(biāo)注部分互補(bǔ)。helper的斜體下劃線標(biāo)注是nb.bbvci內(nèi)切酶的識(shí)別序列，黑體標(biāo)注與g-四聯(lián)體序列完全互補(bǔ)。

aptamer為目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的適配體，可以與目標(biāo)物特異性的識(shí)別并緊密結(jié)合。由于變形而釋放出的primer為等溫指數(shù)放大反應(yīng)（expar）的引物序列，可以打開hp。helper能與hp的部分序列互補(bǔ)，當(dāng)hp被primer打開時(shí)，結(jié)合到hp上，在酶的作用下，進(jìn)行expar過程。

本發(fā)明中用到了兩種酶：phi29dna聚合酶和nb.bbvci內(nèi)切酶。phi29dna聚合酶同時(shí)具有鏈延伸和置換功能，nb.bbvci內(nèi)切酶在特定識(shí)別位點(diǎn)切割雙鏈dna中的一條鏈。

本發(fā)明中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)是在均相溶液中實(shí)現(xiàn)的，通過expar策略來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，從而實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏檢測(cè)，并獲得較低的檢測(cè)下限。

均相中發(fā)生的反應(yīng)主要有：aptamer和primer形成拱形探針。形成的拱形探針，在有目標(biāo)物存在的情況下，該適配體序列能夠特異性的識(shí)別目標(biāo)物并與之結(jié)合，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，從而釋放出primer。此時(shí)均相中的primer就可以與hp的5’端結(jié)合，并打開hp結(jié)構(gòu)，從而使helper也能結(jié)合到打開的hp的3’端。此時(shí)在phi29dna聚合酶與dntp的共同作用下，以打開的hp為模板、在helper引物作用下，沿模板的3’端向5’端延伸，將結(jié)合在5’端的primer擠下來，繼續(xù)循環(huán)利用。同時(shí)，以helper為模板、在hp引物作用下，沿模板的3’端向5’端延伸，延伸的過程中形成雙鏈，在nb.bbvci的作用下，在識(shí)別位點(diǎn)切割，不斷地延伸、切割、延伸，產(chǎn)生了大量的單鏈dna，這些單鏈dna在k⁺的幫助下可以結(jié)合血紅素，得到g-四聯(lián)體/血紅素核酶，其可以催化abts-h2o2反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收。

一種檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法，具體操作步驟如下：

（1）將滅菌水，10×的buffer緩沖液、20μm的aptamer1μl和20μm的primer1μl加入到ep管中，在95℃下孵育5min，緩慢冷卻至室溫；

（2）向ep管中加入目標(biāo)菌，37℃，孵育2h；

（3）向ep管中加入20μm，1μlhp和20μm，1μlhelper，1μl內(nèi)切酶、1μl聚合酶和1μldntp；震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37℃的恒溫箱中孵育2h；37℃，孵育2h；

（4）將上步反應(yīng)后的溶液加入血紅素、過氧化氫和abts反應(yīng)5min；用uv-vis分光光度計(jì)在410nm處檢測(cè)abts紫外吸收信號(hào)，檢測(cè)范圍380nm-680nm，讀取信號(hào)變化，檢測(cè)目標(biāo)物；

其中，hp（摩爾）、aptamer（摩爾）、primer（摩爾）、聚合酶（活力）、內(nèi)切酶（活力）和dntp（活力）的摩爾與活性的比為1：1：1：2：40：2。

該發(fā)明的檢測(cè)方式是比色法檢測(cè)，利用uv-vis分光光度計(jì)。在檢測(cè)之前，先將aptamer和primer形成拱形探針。然后將目標(biāo)菌加入到反應(yīng)后的均相溶液，在37℃孵育2h，目標(biāo)物與aptamer結(jié)合，釋放primer序列，打開hp，結(jié)合helper，并完成之后的expar過程，從而產(chǎn)生信號(hào)的放大。然后加入血紅素、過氧化氫和abts，用光譜儀檢測(cè)410nm處紫外吸收。

本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別，具有鏈置換功能的dna聚合酶的鏈延伸和置換作用，expar過程以及g-四聯(lián)體/血紅素核酶催化abts-h2o2反應(yīng)的特性構(gòu)提供了本檢測(cè)方法。該發(fā)明具有檢測(cè)速度快，檢測(cè)限低，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，可以彌補(bǔ)鼠傷寒沙門氏菌現(xiàn)有檢測(cè)方法的缺陷與不足，實(shí)現(xiàn)對(duì)其快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果：

1、利用了核酸適配體的特異型識(shí)別，利用鼠傷寒沙門氏菌的適體作為識(shí)別物質(zhì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的高特異性檢測(cè)；

2、利用了內(nèi)切酶的切割作用，實(shí)現(xiàn)了定位切割；

3、利用聚合酶的聚合作用，實(shí)現(xiàn)了expar過程，起到了信號(hào)放大的作用；

4、該傳感器的反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度快；

5、檢測(cè)原理的主要過程均是在均相中實(shí)現(xiàn)的，提高的反應(yīng)速度，降低了操作的復(fù)雜程度，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的快速，簡(jiǎn)單，靈敏的檢測(cè)；

6、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，性能穩(wěn)定，反應(yīng)條件穩(wěn)定性好，適用于食品安全中鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

一種檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法，具體如下：

a、將滅菌水，10×的緩沖液（buffer），1μlprimer鏈和aptamer鏈加入到預(yù)先準(zhǔn)備好的滅菌的ep管中。震蕩30s，在95℃下孵育5min，緩慢冷卻至室溫；

b、向該ep管中加入目標(biāo)菌（濃度分別為9.8*10⁵cfu/ml、9.8*10⁴cfu/ml、9.8*10³cfu/ml、9.8*10²cfu/ml、9.8*10¹cfu/ml），震蕩30s，放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

c、繼續(xù)向ep管中加入hp（1μl）、helper（1μl）、內(nèi)切酶（1μl）、聚合酶（1μl）和dntp（1μl）；震蕩30s，然后將混勻的混合液繼續(xù)放入37℃的恒溫箱中孵育2h；

d、將c步反應(yīng)后的溶液加入血紅素、過氧化氫和abts反應(yīng)5min；

用uv-vis分光光度計(jì)在410nm處檢測(cè)abts紫外吸收信號(hào)，檢測(cè)范圍380nm-680nm，讀取信號(hào)變化，檢測(cè)目標(biāo)物；

其中，hp（摩爾）、aptamer（摩爾）、primer（摩爾）、聚合酶（活力）、內(nèi)切酶（活力）和dntp（活力）的摩爾與活性的比為1：1：1：2：40：2。

上述過程：

1、超純水均需進(jìn)行高溫滅菌處理。具體方法是，將超純水分別放置在錐形瓶中，然后用錫箔紙和報(bào)紙進(jìn)行封口。在高壓滅菌鍋中在120℃的溫度下滅菌20min。

2、10×的緩沖液（buffer）是隨聚合酶一起買來的，可直接使用。

本發(fā)明檢測(cè)時(shí)間短，速度快，檢測(cè)結(jié)果顯示，沙門氏菌濃度在9.8*10¹cfu/ml時(shí)仍滿足線性關(guān)系，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確檢測(cè)。

<110>濟(jì)南大學(xué)

<120>一種檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的方法

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