一種沙門氏菌的檢測試紙及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種沙門氏菌的檢測試紙及其制備方法，具體提供了一種沙門氏菌的檢測試紙，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述膠體金墊上含有膠體金標記的沙門氏菌抗體，所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和對照線，所述檢測線由能與沙門氏菌結合的沙門氏菌抗體劃膜制成，所述對照線由能與沙門氏菌抗體結合的羊抗兔抗體劃膜制成。
【專利說明】
一種沙門氏菌的檢測試紙及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及檢測方法，具體涉及門氏菌的檢測試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 沙門氏菌是一種常見的人畜共患腸道病原菌，不僅能引起畜禽傷寒、副傷寒等疾 病，還能造成人類腹瀉、細菌性食物中毒等常見病，威脅人類健康。已知的沙門氏菌血清型 有2000余種，廣泛分布在自然界中。與人類疾病有關的血清型主要集中于A~E群，其中，鼠 傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌最為常見。在世界各國各類細菌性的食物 中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒高居前列。人畜感染沙門氏菌后可能加重病癥或加大死 亡率，也可能會降低動物繁殖力，造成巨大的經(jīng)濟損失，并嚴重威脅人民群眾的身體健康和 畜牧業(yè)的健康發(fā)展，對其防治歷來是公共衛(wèi)生的一項重要課題。快速、準確、簡便地檢測出 沙門氏菌，在醫(yī)療衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、動物疫病監(jiān)測等方面具有重要的意義。
[0003] 檢測沙門氏菌一直以傳統(tǒng)檢測方法為主，非選擇性和選擇性增菌、可疑細菌分離 等常規(guī)方法雖然經(jīng)典可靠，但程序復雜、十分繁瑣，不僅費時費力而且敏感性和特異性較 差，漏檢率較高。而免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、聚合酶鏈反應(PCR)技術等方 法需要使用指定的儀器設備、具備相應的試驗條件和技能，難以在基層推廣。膠體金標記免 疫分析法是近年興起并快速發(fā)展的一種新型分析技術，其特點是快捷簡便、成本低、無污染 且無需培訓，非常適合現(xiàn)場檢測。與ELISA相比，具有顯色時間短、無需儀器等優(yōu)點，具有廣 闊的市場前景和應用價值。本研究采用豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌免疫兔制得的兔 抗沙門氏菌多抗血清，研制膠體金試紙條用于臨床快速檢測。

【發(fā)明內容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明一個方面提供了一種沙門氏菌的檢測試紙，其包括底 板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次組 裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，
[0005] 其中，所述膠體金墊上含有膠體金標記的沙門氏菌抗體，
[0006] 所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和對照線，所述檢測線由能與沙門氏菌 結合的沙門氏菌抗體劃膜制成，所述對照線由能與沙門氏菌抗體結合的羊抗兔抗體劃膜制 成。
[0007] 其中，所述膠體金標記的沙門氏菌抗體通過以下方法制得：
[0008] 取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入1單位體積的1 %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫 色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至1〇〇單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地， 所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0 · 8-1 · 0;
[0009] 調節(jié)膠體金溶液的pH至8.0;在膠體金溶液中加入沙門氏菌抗體至沙門氏菌抗體 的濃度為8-llμg/mL(9·6μg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為l%，獲得 純化前的膠體金標記的沙門氏菌抗體；
[0010] 將膠體金標記的沙門氏菌抗體以2000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀；
[0011 ] 將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清；
[0012] 用〇 . 05m〇 1 /L的TBS(內含1 %BSA，0.05 %NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體 積，重復前兩步的離心2~3次，將沉淀溶于1 /10TBS (內含1 % BSA，0.05 % NaN3)中至純化前 原體積，4°C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標記的沙門氏菌抗體。
[0013] 其中，所述膠體金墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的，
[0014] 優(yōu)選地，所述膠體金墊通過如下方法制得：
[0015] 配制膠體金墊處理液：用PH7 ·4的PBS加入1 %的BSA、0 · 5%的SDS、1 %的Tween-20 混勻后過濾；
[0016] 把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37°C烘干；
[0017] 將膠體金標記的沙門氏菌抗體以5yL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖 維素膜上，烘干。
[0018] 其中，所述樣品墊是經(jīng)過是BSA、SDS和Tween-20處理過的，
[0019] 優(yōu)選地，所述樣品墊通過如下方法制得：
[0020] 配制樣品墊處理液：用pH7 ·4的PBS加入1 %的BSA、0 · 5%的SDS、1 %的Tween-20混 勻后過濾；
[0021] 把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37°C烘干。
[0022] 其中，設置檢測線和對照線的硝酸纖維素膜是將沙門氏菌抗體稀釋為2mg/mL，羊 抗兔抗體稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑量在硝酸纖維素膜上進行劃膜，劃膜后烘干。
[0023] 本發(fā)明的另一個方面提供了一種沙門氏菌檢測試紙的制備方法，其包括如下步 驟：
[0024] 1)制備膠體金標記的沙門氏菌抗體：
[0025] 1-1)取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入1單位體積的1 %氯金酸溶液，繼續(xù)煮 沸l(wèi)-10min，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變 成紫色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選 地，所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0 · 8-1 · 0;
[0026] 1-2)調節(jié)膠體金溶液的pH至8.0;
[0027] 在膠體金溶液中加入沙門氏菌抗體至沙門氏菌抗體的濃度為8-1 lyg/mL(9.6yg/ mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標記的沙門 氏菌抗體；
[0028] 1-3)將膠體金標記的沙門氏菌抗體以2000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀；
[0029] 1-4)將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清；
[0030] 1-5)用0.05m〇VL的TBS (內含1 % BSA，0.05 %NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原 體積，重復前兩步的離心2~3次，將沉淀溶于1 /10TBS(內含1 % BSA，0.05 %NaN3)中至純化 前原體積，4°C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標記的沙門氏菌抗體；
[0031] 2)制備膠體金墊：
[0032] 2-1)配制膠體金墊處理液：用pH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5 %的SDS、1 %的 Tween-20混勾后過濾；
[0033] 2-2)把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干；
[0034] 2-3)將膠體金標記的沙門氏菌抗體以lyL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻 璃纖維素膜上，烘干；
[0035] 3)制備樣品墊：
[0036] 3-1)配制樣品墊處理液：用ρΗ7·4的PBS加入1%的BSA、0.5%的SDS、1%的Tween- 20混勻后過濾；
[0037] 3-2)把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干；
[0038] 4)制備設置檢測線和對照線的硝酸纖維素膜：
[0039] 4-1)將沙門氏菌抗體稀釋為2mg/mL，羊抗兔抗體稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm 的劑量在硝酸纖維素膜上劃膜，劃膜后烘干；
[0040] 5)組裝:依次將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊粘貼在底板上即得。
[0041] 本發(fā)明另一個方面提供了前述的檢測試紙在檢測沙門氏菌中的應用。
[0042] 本發(fā)明另一個方面提供了一種非診斷目的的檢測沙門氏菌的方法，其包括以下步 驟：
[0043] a)對待測樣品進行預處理；
[0044] b)將預處理獲得的待測樣品以前述的檢測試紙進行檢測；
[0045] 其中，步驟1)為：
[0046] a-Ι)將待測樣品勻漿，并加入緩沖蛋白胨水中，混勻后37°C培養(yǎng)8_18h;
[0047] a-2)取步驟a-1)培養(yǎng)液lml-10ml，加入四硫酸鈉煌綠增菌液中42 °C培養(yǎng)18-24h;
[0048] a-3)取步驟a-2)培養(yǎng)液加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中37°C培養(yǎng)18-24h；
[0049] 優(yōu)選地，檢測步驟設立陽性對照。
[0050] 本試驗是將膠體金與沙門氏菌抗體的偶聯(lián)物噴涂在玻璃纖維膜的膠體金墊上，沙 門氏菌抗體和羊抗兔抗體分別噴于硝酸纖維膜的檢測線和對照線上。當待檢樣品加在玻璃 纖維膜上的樣品區(qū)時，由于毛細管作用，樣品迅速浸透膠體金墊，金標抗體被溶解，并在上 部吸水墊材料吸水漲力的牽引下隨著樣品溶液沿膜條向前移動。若樣品中存在沙門氏菌， 它就和金標抗體形成復合物。隨后，通過檢測線區(qū)域時，檢測線上固相化的的沙門氏菌抗體 其他表位捕獲復合物中的沙門氏菌，在檢測線處形成一條肉眼清晰可見的紫紅色線。其余 復合物繼續(xù)前移，通過質控線時，固相化的羊抗兔抗體捕獲復合物中的沙門氏菌抗體，出現(xiàn) 紫紅色線。該線必須出現(xiàn)，否則試紙條失效。若待檢樣品中沒有沙門氏菌，金標沙門氏菌抗 體將不會與包被在檢測線上的固相化沙門氏菌抗體結合，檢測線上不會出現(xiàn)紫紅色線。
[0051] 本試驗建立的沙門氏菌抗原膠體金試紙條具有很強的便捷性和實用性。本方法兼 有免疫反應和色譜層析的優(yōu)點，無需設備、操作簡單，時間短、效率高，特異性強、靈敏度高， 穩(wěn)定性較好。與增菌培養(yǎng)基配合使用，即可作為沙門氏菌監(jiān)測和診斷的常規(guī)手段，具有很強 的推廣和應用價值。目前國外沙門氏菌膠體金試紙條檢測靈敏度能達到1.07X107~1.07 X 108cfu/ml，國內試紙條靈敏度可達1.07 X 106~1.07 X 107cfu/ml，本實驗制備的試紙條 靈敏度能達到1.07X107cfu/ml，且特異性良好。在檢測時無須樣品預處理，可以直接使用 前增菌培養(yǎng)基如緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、四硫酸鈉煌綠增菌液 (TTB)等，將增菌后的樣品滴加到試紙條的樣品區(qū)即可。減少了繁瑣的試劑稀釋、配制等步 驟，結果直觀易判定，即拆即用，非專業(yè)人員也可操作。試紙條4°C或37°C存放5個月，檢測結 果穩(wěn)定。通過對實驗室周邊超市和菜市場的豬肉、雞肉和雞蛋等隨機采樣檢測，結果均為陰 性，說明市場上抽檢的肉樣和雞蛋沒有受到沙門氏菌污染。
【附圖說明】
[0052]圖1沙門氏菌膠體金試紙條組裝示意圖。
[0053 ]圖2沙門氏菌膠體金試紙條靈敏性實驗。
[0054] 圖3沙門氏菌膠體金試紙條特異性實驗。
[0055] 圖4沙門氏菌膠體金試紙條靈敏性比較實驗。
[0056] 圖5沙門氏菌膠體金試紙條特異性比較實驗。
[0057] 圖6沙門氏菌膠體金試紙條保存期實驗。
[0058]圖7肉樣和雞蛋在SC中培養(yǎng)后滴入本試紙條的結果。
[0059] 圖8肉樣和雞蛋在TTB中培養(yǎng)后滴入本試紙條的結果。
【具體實施方式】
[0060] 本發(fā)明所用的所有試劑均為分析純，其中氯金酸、碳酸鉀購自國藥集團化學試劑 公司；羊抗兔抗體、單面膠PVC板、玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜(NC膜)購自上海金標生物科技 有限公司；紫外分光光度計購自Amersham公司；高速冷凍離心機購自Sigma公司；膠體金點 樣系統(tǒng)(噴涂機、切條機、手動貼膜機)購自Bio Dot公司，對比用國內某品牌沙門氏菌膠體 金試紙條(批號20150211)、國外某品牌沙門氏菌膠體金試紙條(批號KW852015)。
[0061] 本發(fā)明所用的菌株豬霍亂沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌均購自中國科學院微生物 研究所(CGMCC，No. 1.1859和1.1190);大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、肺炎克雷伯桿 菌、奇異變形桿菌、鏈球菌等由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室保存和提供。檢測用 豬肉和雞蛋購自實驗室周邊超市和農貿市場。
[0062] 本發(fā)明所用的沙門氏菌抗體由山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室制備。
[0063]實施例1抗體的制備與純化
[0064]將沙門氏菌用專用培養(yǎng)基活化，培養(yǎng)后呈現(xiàn)特征性菌落。將兩株沙門氏菌擴大培 養(yǎng)，保存?zhèn)溆?。測得菌液濃度約為1 X l〇1()CFU，細菌用0.3%的甲醛滅活24小時，滅活后菌液 經(jīng)細菌檢驗平板不再長菌。滅活后的菌液加入弗氏不完全佐劑制作成疫苗用于免疫新西蘭 白兔，lmL/只，背部皮下注射，共免疫4次，每次間隔15d，采用同樣方法再連續(xù)注射4次，四免 前兔耳靜脈采血檢測抗體生成情況。經(jīng)測試合格者頸動脈采血，分離血清，冷凍保存。
[0065]實施例2膠體金溶液的制備
[0066] 取100ml雙蒸水加熱沸騰后加入lml 1 %的氯金酸溶液，搖勻后繼續(xù)加熱沸騰 3min，然后迅速加入1 %的朽1檬酸三鈉溶液lml，轉至磁力攪拌器中攪拌2min，此時顏色由灰 色變成黑色，再變成紫色，放到電爐上加熱沸騰6min，顏色變?yōu)榫萍t色，冷卻后再加蒸餾水 定容至100ml。膠體金溶液需避光、4 °C保存。
[0067] 實施例3膠體金標記的沙門氏菌的制備與純化
[0068] 取需制備量的膠體金溶液，用0.2mol/L的K2C03或0. lmol/L的HC1溶液調膠體金溶 液的pH至8.0。然后按每lmL膠體金溶液加入9.6ug純化的兔抗體，磁力攪拌混合均勾，加入 10 % PEG20000至終濃度為1 %，混勻后4 °C靜置過夜即為標記好的金標抗體。將金標單抗用 2000r/min、4°C 離心 20min，棄去沉淀；10000r/min、4°C 離心30min，棄去上清。用0 · 05mol/L 的TBS(內含1 % BSA，0.05 % NaN3)緩沖液溶解沉淀至原體積，重復離心2~3次，將沉淀溶于 1/10原體積的TBS中，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0069] 實施例4金標抗體最適蛋白量的確定
[0070] 用0.2mol/L的K2C〇3或0. lmol/L的HC1溶液調膠體金溶液的pH至8.0。取pH8.0的膠 體金溶液9管，每管lml，前8管每管分別加入倍比稀釋的抗體lOOul，濃度分別為4ug/ml、 5ug/ml、6ug/ml、7ug/ml、8ug/ml、9ug/ml、1 Oug/ml，設空白對照?；旃春笫覝胤磻?min，再每 管分別加入10 %的NaCl溶液100ul，混勻后室溫靜置2h，觀察顏色變化?？瞻坠芗皢慰沟鞍?量不足以穩(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象，而單抗蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定 量的各管仍保持紅色不變。選擇8ug/ml為最佳，再此基礎上加量20%為標記的最適蛋白量， 最終抗體濃度約為9.6ug/ml。
[0071] 實施例5質控線、檢測線濃度的確定
[0072] 把羊抗兔抗體作系列稀釋后包被到NC膜上，從lmg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml到 5mg/ml，每個濃度分別包被兩個試紙條(設一個重復），與吸附有金標抗體的玻璃纖維膜組 條進行免疫層析，比較質控線顯色水平。在每個條上包被lul稀釋好的羊抗兔抗體，最后兩 個試紙條為空白對照。在樣品墊滴入水后，發(fā)現(xiàn)包被lmg/ml二抗的試紙條出線顏色較淺， 2mg/ml、3mg/ml出線顏色較明顯，4mg/ml、5mg/ml條帶顏色不再加深，最終確定對照線的濃 度為211^/1111。把沙門氏菌抗體作系列稀釋，從111^/1111、211^/1111、311^/1111、411^/1111到511^/1111，分 別取lul包被于NC膜上，與最佳稀釋度金標抗體纖維膜組裝成試紙條。對照線均包被2mg/ml 的羊抗兔抗體lul。在樣品墊滴入水，發(fā)現(xiàn)lmg/ml出線顏色較淺，2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml至lj 5mg/ml出線顏色較明顯，最終確定檢測線的濃度為2mg/ml。羊抗兔抗體和沙門氏菌抗體都 是稀釋成2mg/ml，用機器以lul/cm劃膜，劃膜后37°C烘干，加入干燥劑，熱合封口，置4°C冰 箱備用。
[0073]實施例6膠體金墊和樣品墊的優(yōu)化處理
[0074] (1)配制膠體金墊和樣品墊處理液：用pH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5%的SDS、1 % 的Tween-20用漩渦振蕩器混勻后過濾備用。
[0075] (2)把玻璃纖維膜和樣品墊放置于處理液中浸泡30min，37 °C烘干，備用。
[0076]實施例7膠體金試紙條的組裝
[0077]取優(yōu)化處理過的玻璃纖維膜，由噴涂機將確定為最佳稀釋度的金標單抗液按5ul/ cm的噴量噴涂于玻璃纖維膜上，再將沙門氏菌抗體、羊抗兔抗體分別包被在硝酸纖維素膜 上的檢測線(T線)和對照線(C線）的位置，烘干后加入干燥劑，熱合封口，置4°C冰箱備用。依 次將樣品墊、膠體金墊、NC膜(其上包被有檢測線和質控線)和吸水墊粘貼在PVC底板(支持 物)上（圖1)，用切刀切成3mm寬的條帶即可用于檢測。
[0078]實施例8待測樣品的預處理
[0079]將待測樣品勻漿后取2.5g到22.5ml的BPW(緩沖蛋白胨水）中，混勻后37°C培養(yǎng)8-18h，把培養(yǎng)液各取lml到10ml，并加入TTB(四硫酸鈉煌綠增菌液）中42°C培養(yǎng)18-24h，再另 取lml到lOmlSC(亞硒酸鹽胱氨酸增菌液）中37°C培養(yǎng)18-24h.把培養(yǎng)液滴入試紙條，觀察檢 測結果。同時設陽性對照(沙門氏菌菌液）。
[0080] 結果
[0081 ] 1沙門氏菌抗體效價檢測及純化
[0082] 分離的血清經(jīng)玻片凝集實驗抗體效價達到1: 256，采用Protein A Sepharose TMCL-4B柱進行純化，純化后其蛋白含量為15mg/mL。其余未純化血清分裝冷凍保存。
[0083] 2兔抗沙門氏菌抗體膠體金的制備和試紙條的優(yōu)化組裝
[0084] 2.1膠體金質量鑒定配制好的膠體金溶液用紫外分光光度計測波長在520nm和 535nm處的吸光值，吸光值在0.8-1.0之間。肉眼觀察為酒紅色。
[0085] 2.2靈敏性與特異性把1.07\10!^11/1111沙門氏菌菌液作10()~10 1()倍系列稀釋，終 濃度分別為1.07X 109~1.07Χ1〇Λ?νπι1，共11個梯度。用組裝好的試紙條進行檢測，每個 試紙條各加入80ul，檢測靈敏性至1.07X10Tcfu/ml為陽性，1.07X 106cfu/ml顯示弱陽性 (圖2)。取8個組裝好的試紙條，分別加入沙門氏菌、大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、肺 炎克雷伯桿菌、奇異變形桿菌、鏈球菌、水各80ul。沙門氏菌檢測顯示陽性反應，奇異變形桿 菌有較弱的假陽性，其他均呈陰性(圖3)。
[0086] 2.3靈敏性與特異性比較用本實驗建立的試紙條分別和國內、國外某品牌試紙條 的靈敏性、特異性做比較實驗。把1.07 X 109cfu/ml沙門氏菌菌液作10~106倍系列稀釋，終 濃度分別為1.07 X 108~1.07 X 103cfu/ml，和細菌原液用組裝好的試紙條進行檢測，每個試 紙條各加入80ul，并設陰性對照。本實驗制備的試紙條與國內某品牌試紙條檢測濃度1.07 X 107cfu/ml為陽性，1.07X 106cfu/ml顯示弱陽性;而國外某品牌試紙條在1.07X 108cfu/ ml、1 · 07 X 107cfu/ml均為弱陽性（圖4)。取本實驗室制備、國內某品牌和國外某品牌組裝好 的試紙條各9個，分別加入大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、綠膿桿菌、雙歧桿菌、奇異變形桿菌、 副豬嗜血桿菌、鏈球菌、沙門氏菌、水(陰性對照)各80ul，沙門氏菌檢測均呈陰性(圖5)。 [0087] 2.6穩(wěn)定性制備的試紙條3批，各取100條，分別置4°C冰箱和37°C培養(yǎng)箱中，每隔1 周分別取出2條。常溫保存了9周的試紙條滴入水和菌液8min后，C線和T線都很弱，隱約能看 到。封口的試紙條常溫保存和4°C保存了7周后滴入水和菌液，4°C保存的出現(xiàn)要比常溫保存 的出現(xiàn)更深些（圖6)。
[0088] 3試紙條的檢測將2015年9月份購自山東省濟南市周邊超市和菜市場的肉樣和雞 蛋用試紙條檢測，結果發(fā)現(xiàn)樣品均呈陰性(圖7、圖8、表1)。
[0089]表1沙門氏菌膠體金試紙條臨床檢測結果
[0090]
[0091 ] 參考文獻
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【主權項】
1. 一種沙門氏菌的檢測試紙，其包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述 第一端向第二端的方向，所述底板上依次組裝有樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水 墊， 其中，所述膠體金墊上含有膠體金標記的沙門氏菌抗體， 所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和對照線，所述檢測線由能與沙門氏菌結合 的沙門氏菌抗體劃膜制成，所述對照線由能與沙門氏菌抗體結合的羊抗兔抗體劃膜制成。2. 根據(jù)權利要求1所述的檢測試紙，其中，所述膠體金標記的沙門氏菌抗體通過以下方 法制得： 取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入1單位體積的1 %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫 色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地， 所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0 · 8-1 · 0; 調節(jié)膠體金溶液的pH至8.0 ;在膠體金溶液中加入沙門氏菌抗體至沙門氏菌抗體的濃 度為8-llμg/mL(9·6μg/mL)，混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為l%，獲得純化 前的膠體金標記的沙門氏菌抗體； 將膠體金標記的沙門氏菌抗體以2000r/min，4 °C離心20min，棄去沉淀； 將上一步所得上清以l〇〇〇〇r/min，4°C離心30min，棄去上清； 用0.05mo 1 /L的TBS (內含1 % BSA，0.05 % NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體積，重復 前兩步的離心2~3次，將沉淀溶于1/10TBS(內含l%BSA，0.05%NaN3)中至純化前原體積，4 °(：保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標記的沙門氏菌抗體。3. 根據(jù)權利要求2所述的檢測試紙，其中，所述沙門氏菌抗體是通過以下方法獲得的： 以沙門氏菌用培養(yǎng)基沙門氏菌，培養(yǎng)后取兩株呈現(xiàn)沙門氏菌特征性的菌落并擴大培養(yǎng)，保 存?zhèn)溆?測得菌液濃度約為1 X l〇1()CFU，細菌用0.3%的甲醛滅活24小時，滅活后菌液經(jīng)細菌 檢驗平板不再長菌；將滅活后的菌液加入弗氏不完全佐劑制作成疫苗用于免疫新西蘭白 兔，lmL菌液/只，背部皮下注射，共免疫4次，每次間隔15天，采用同樣方法再連續(xù)注射4次， 四疫前兔耳靜脈采血檢測抗體生成情況;經(jīng)測試合格者頸動脈采血，分離血清，即得沙門氏 菌抗體。4. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的檢測試紙，其中，所述膠體金墊是經(jīng)過是BSA、SDS和 Tween-20處理過的， 優(yōu)選地，所述膠體金墊通過如下方法制得： 配制膠體金墊處理液：用PH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5%的SDS、1 %的Tween-20混勻 后過濾； 把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37°C烘干； 將膠體金標記的沙門氏菌抗體以5yL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖維素 膜上，烘干。5. 根據(jù)權利要求1-3任一項所述的檢測試紙，其中，所述樣品墊是經(jīng)過是BSA、SDS和 Tween-20處理過的， 優(yōu)選地，所述樣品墊通過如下方法制得： 配制樣品墊處理液：用PH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5%的SDS、1 %的Tween-20混勻后 過濾； 把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干。6. 根據(jù)權利要求1-5任一項所述的檢測試紙，其中，設置檢測線和對照線的硝酸纖維素 膜是將沙門氏菌抗體稀釋為2mg/mL，羊抗兔抗體稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑量在 硝酸纖維素膜上進行劃膜，劃膜后烘干。7. 權利要求1-6任一項所述的檢測試紙的制備方法，其包括如下步驟： 1) 制備膠體金標記的沙門氏菌抗體： 1-1)取100單位體積的雙蒸水煮沸然后加入1單位體積的1 %氯金酸溶液，繼續(xù)煮沸1-lOmin，然后加入3單位體積的1%的檸檬酸三鈉，攪拌至液體顏色由灰色變成黑色再變成紫 色，再煮沸至液體顏色變?yōu)榫萍t色，再加雙蒸水至100單位體積，獲得膠體金溶液;優(yōu)選地， 所述膠體金溶液在520nm和535nm處的吸光值為0 · 8-1 · 0; 1-2)調節(jié)膠體金溶液的pH至8.0; 在膠體金溶液中加入沙門氏菌抗體至沙門氏菌抗體的濃度為8-llyg/mL(9.6yg/mL)， 混勻后加入10%PEG20000至PEG20000的濃度為1%，獲得純化前的膠體金標記的沙門氏菌 抗體； 卜3)將膠體金標記的沙門氏菌抗體以2000r/min，4 °C離心20min，棄去沉淀； 1- 4)將上一步所得上清以10000r/min，4°C離心30min，棄去上清； 1 -5)用0.05mo 1/L的TBS(內含1 % BSA，0.05 %NaN3)緩沖液溶解沉淀至純化前的原體 積，重復前兩步的離心2~3次，將沉淀溶于1 /10TBS (內含1 % BSA，0.05 % NaN3)中至純化前 原體積，4°C保存?zhèn)溆?，獲得純化后的膠體金標記的沙門氏菌抗體； 2) 制備膠體金墊： 2- 1)配制膠體金墊處理液：用pH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5%的SDS、1 %的Tween-20 混勻后過濾； 2-2)把玻璃纖維膜放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干； 2- 3)將膠體金標記的沙門氏菌抗體以lyL/cm的噴量噴涂于經(jīng)處理液處理過的玻璃纖 維素膜上，烘干； 3) 制備樣品塾： 3- 1)配制樣品墊處理液：用pH7.4的PBS加入1 %的BSA、0.5%的SDS、1 %的Tween-20混 勻后過濾； 3- 2)把樣品墊放置于膠體金處理液中浸泡30min，37 °C烘干； 4) 制備設置檢測線和對照線的硝酸纖維素膜： 4- 1)將沙門氏菌抗體稀釋為2mg/mL，羊抗兔抗體稀釋為2mg/mL，并分別以lyL/cm的劑 量在硝酸纖維素膜上劃膜，劃膜后烘干； 5) 組裝:依次將樣品墊、膠體金墊、硝酸纖維膜和吸水墊粘貼在底板上即得。8. 權利要求1-6所述的檢測試紙在檢測沙門氏菌中的應用。9. 一種非診斷目的的檢測沙門氏菌的方法，其包括以下步驟： a) 對待測樣品進行預處理； b) 將預處理獲得的待測樣品以權利要求1-6任一項所述的檢測試紙進行檢測； 其中，步驟1)為： a_l)將待測樣品勻漿，并加入緩沖蛋白胨水中，混勻后37°C培養(yǎng)8-18h; a-2)取步驟a-1)培養(yǎng)液加入四硫酸鈉煌綠增菌液中42°C培養(yǎng)18-24h; a_3)取步驟a-2)培養(yǎng)液加入亞硒酸鹽胱氨酸增菌液中37°C培養(yǎng)18-24h; 優(yōu)選地，檢測步驟設立陽性對照。
【文檔編號】G01N33/531GK106018799SQ201610318472
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】李俊, 彭喆, 黃保華, 時建立, 王莉莉, 王金寶, 徐紹建, 吳曉燕, 朱曉琳, 鄭書軒, 張玲玲
【申請人】山東省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所