一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種六次甲基四胺的檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)卡、膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物以及磷酸鹽緩沖稀釋液。同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法和應(yīng)用。該試劑盒及其檢測(cè)方法可以定性及半定量檢測(cè)樣品中是否含有待測(cè)物以及待測(cè)物含量的大致范圍。本發(fā)明提供的試劑盒中檢測(cè)卡結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)所需時(shí)間短，能夠同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，應(yīng)用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)腐竹、粉絲、水產(chǎn)品中六次甲基四胺的快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，這對(duì)于維護(hù)廣大消費(fèi)者利益及保障政府部門(mén)的食品安全監(jiān)管工作具有重大意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]六次甲基四胺(俗名烏洛托品)，分子式C6H12N4,屬化工原料，被衛(wèi)生部列入第五批《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單》中，六次甲基四胺被禁止添加到食品當(dāng)中或在加工食品過(guò)程中使用。部分違法者將其摻入腐竹、粉絲、水產(chǎn)品等食品中，會(huì)起到增白、保鮮、增加口感、防腐的效果。六次甲基四胺本身屬低毒類(lèi)，可作為藥物服用。但其在酸性條件下，能分解出甲醛，甲醛易與體內(nèi)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，如與氨基化合物可以發(fā)生縮合，與巰基化合物加成，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在體內(nèi)還可還原為醇，故可表現(xiàn)出甲醇的毒理作用，對(duì)人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害。
[0003]目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中還沒(méi)有關(guān)于六次甲基四胺的指定檢測(cè)方法，六次甲基四胺屬于小分子物質(zhì)，如想要對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，主要采用儀器檢測(cè)的方法，比如高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMS)等。這些方法雖然可以精確地進(jìn)行定性及定量檢測(cè)分析，但是存在檢測(cè)儀器昂貴、成本高、需要專(zhuān)門(mén)的技術(shù)人員來(lái)檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、方法操作復(fù)雜等缺陷，尤其不適用于食品安全監(jiān)管現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)方法是應(yīng)用免疫學(xué)理論設(shè)計(jì)的一系列測(cè)定抗原、抗體、免疫細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子的實(shí)驗(yàn)方法。它可以克服儀器檢測(cè)法的上述缺陷，能夠以其簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果直觀、無(wú)需儀器等高效地應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。免疫學(xué)檢測(cè)方法中應(yīng)用較廣泛的是酶聯(lián)免疫法，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA法。但是ELISA法相對(duì)更適用于定量檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，不適于快速定性檢測(cè)。因此，為適應(yīng)市場(chǎng)需求，行業(yè)內(nèi)迫切需要開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果直觀、無(wú)需精密儀器的六次甲基四胺的定性檢測(cè)裝置及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種六次甲基四胺的檢測(cè)試方法，以解決在食品安全檢驗(yàn)時(shí)，現(xiàn)有方法無(wú)法快速、準(zhǔn)確地、大批量定性或半定量檢測(cè)六次甲基四胺的問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種六次甲基四胺的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括:
檢測(cè)卡;所述檢測(cè)卡包括硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜上設(shè)有一條含六次甲基四胺包被抗原的檢測(cè)帶和一條含有羊抗兔二抗的質(zhì)控帶；
膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物；以及磷酸鹽緩沖稀釋液。
[000?]所述六次甲基四胺包被抗原是通過(guò)以下方法制備的:配制濃度為15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液;配置濃度為0.lmol/L、pH值為7.4、含有卵清蛋白4.5_5.0mg/ml的磷酸鹽緩沖液;將六次甲基四胺溶液緩慢滴加到含卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入體積比濃度為25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時(shí)，4°C靜置過(guò)夜，裝入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續(xù)透析5天，每天換液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原;所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸緩沖溶液:戊二醛水溶液的添加比例為5-6 mg: 2_5ml: 1-2 ml0
[0007]所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物是通過(guò)以下步驟制備的:
(A)合成六次甲基四胺完全抗原:配制濃度為200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液;配制PH值為7-10、離子濃度為10-1000 mmol、含載體蛋白30-50 mg/ml的復(fù)合磷酸鹽緩沖液;所述載體蛋白為牛血清白蛋白；將所述六次甲基四胺溶液滴加到所述復(fù)合磷酸鹽緩沖液中，再加入體積比濃度為25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1-2小時(shí)，4°C冰箱過(guò)夜，再裝入透析袋中，透析3-5天，每天換液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原;所述六次甲基四胺:復(fù)合磷酸鹽緩沖液:戊二醛水溶液質(zhì)量體積比為:80-120 mg: 1-5ml: 2_3ml;
(B)制備六次甲基四胺多克隆抗體:采用所述六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，獲得六次甲基四胺多克隆抗體；
(C)制備膠體金溶液:將100ml質(zhì)量比濃度為0.01%的HAuC14水溶液用恒溫磁力攪拌器加熱至沸騰，保持煮沸2-3 min，攪拌，加入1.2 ml質(zhì)量比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，待溶液顏色變?yōu)橥该鞯募t色并不再變化時(shí)，保持煮沸15 min，停止加熱，攪拌，冷卻至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至100 ml；
(D)制備膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物:調(diào)節(jié)膠體金的pH值為8-10，按體積比為1:0.06取所述膠體金和所述六次甲基四胺多克隆抗體，在磁力攪拌下，將所述六次甲基四胺多克隆抗體逐滴加入到膠體金溶液中，10-15 min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的終濃度達(dá)到1-2%，攪拌30-40 min，置于4 °C下過(guò)夜;在40C下1500r/min離心1min，取上清液于4 °C下、10000r/min離心30min，棄去上清液，得膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物。
[0008]所述制備六次甲基四胺多克隆抗體的方法為:采用初次免疫制劑對(duì)兩只雄性大耳白家兔進(jìn)行初次免疫，之后用加強(qiáng)免疫制劑分別于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加強(qiáng)免疫I次，采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)進(jìn)行免疫，于最后一次免疫完第10天，從兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于離心管中，室溫靜置30-35min，待血漿凝聚后，4°C靜置過(guò)夜，將血清以3000 r/min離心15-20 min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗體。
[0009]所述初次免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:4溶于磷酸鹽緩沖液中，得抗原磷酸緩沖液，在抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏完全佐劑，乳化即得;所述加強(qiáng)免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:9溶于磷酸鹽緩沖液中，得加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液，在加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏不完全佐劑，乳化即得;所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01 !1101/1，？田直為7.4。
[0010]所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01mol/L、pH值為7.4，為市售商品。
[0011]所述質(zhì)控帶與檢測(cè)帶相互平行且間隔0.3-0.7cm;所述檢測(cè)帶用8-12μ1的六次甲基四胺包被抗原劃線而成，所述質(zhì)控帶用8_12μ1的羊抗兔二抗稀釋液劃線而成，所述羊抗兔二抗稀釋液是指將0.5μ1的羊抗兔二抗用磷酸鹽緩沖液稀釋100倍。
[0012]本發(fā)明提供的六次甲基四胺的檢測(cè)試劑盒在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0013]一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法，包括以下步驟: (a)合成六次甲基四胺完全抗原:配制濃度為0.16-0.3mg/ml的六次甲基四胺溶液;配制pH值為7-10、離子濃度為10-1000 mmol、含載體蛋白30-50 mg/ml的復(fù)合磷酸鹽緩沖液；所述載體蛋白為牛血清白蛋白；將所述六次甲基四胺溶液滴加到所述復(fù)合磷酸鹽緩沖液中，再加入體積比濃度為25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1-2小時(shí)，4°C冰箱過(guò)夜，再裝入透析袋中，透析3-5天，每天換液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原;所述六次甲基四胺:復(fù)合磷酸鹽緩沖液:戊二醛水溶液質(zhì)量體積比為:80-120 mg: 1-5ml: 2_3ml;
(b)制備六次甲基四胺多克隆抗體:采用所述六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，獲得六次甲基四胺多克隆抗體；
(c)制備六次甲基四胺包被抗原:用卵清蛋白對(duì)所述六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行包被，獲得六次甲基四胺包被抗原；
(d)制備膠體金溶液；
(f)膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物的制備和純化:調(diào)節(jié)膠體金的PH值為8-10，按體積比為1:0.06取所述膠體金和所述六次甲基四胺多克隆抗體，在磁力攪拌下，將所述六次甲基四胺多克隆抗體逐滴加入到膠體金溶液中，10_15min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的終濃度達(dá)到1_2%，攪拌30-40 min，置于4°C下過(guò)夜；在4°C下1500r/min離心1min，取上清液于4°C下、1000r/min離心30min，棄去上清液，得膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物；
(g)制備檢測(cè)卡:準(zhǔn)備硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜上劃線設(shè)有相互平行的檢測(cè)帶和質(zhì)控帶，所述檢測(cè)帶用六次甲基四胺包被抗原劃線，所用體積10μ1;所述質(zhì)控帶用羊抗兔二抗稀釋液劃線，所用體積為10μ1，所述羊抗兔二抗稀釋液是指將0.5μ1的羊抗兔二抗用磷酸鹽緩沖液稀釋100倍;所述質(zhì)控帶與檢測(cè)帶間隔0.3-0.7cm，劃線后在37°C恒溫箱中固定20-25min，再浸泡在5%脫脂牛奶中封閉30 min;將封閉完的膜用PBST沖洗三次，用吸水紙吸去多余的水分，37°C干燥15min即可；
(h)檢測(cè)待測(cè)樣品:預(yù)處理待測(cè)樣品;將所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物與磷酸鹽緩沖液按1:2混合，將預(yù)處理后的待測(cè)樣品與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物和磷酸鹽緩沖液的混合物按體積比為1:5混合，得混合液;將所述混合液逐滴加到檢測(cè)卡上檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上;靜置10-15min，觀察，若質(zhì)控帶和檢測(cè)帶都顯紅色，則待測(cè)樣品為陰性，即表明待測(cè)樣品中不含六次甲基四胺或其含量小于0.5ng/ml最低檢出限；若僅質(zhì)控帶顯紅色，則待測(cè)樣品為陽(yáng)性，即表明待測(cè)樣品中含有六次甲基四胺，且含量大于所述最低檢出限，若質(zhì)控帶不顯色，則該測(cè)試無(wú)效。所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0111101/1、？!1值為7.4。
[0014]步驟(b)所述制備六次甲基四胺多克隆抗體的工藝為:采用初次免疫制劑對(duì)兩只雄性大耳白家兔進(jìn)行初次免疫，之后用加強(qiáng)免疫制劑分別于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加強(qiáng)免疫I次，采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)進(jìn)行免疫，于最后一次免疫完第10天，從兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于離心管中，室溫靜置30-35min，待血漿凝聚后，4°C靜置過(guò)夜，將血清以3000 r/min離心15-20 min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗血清；
步驟(b)所述初次免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:4溶于磷酸鹽緩沖液中，得抗原磷酸緩沖液，在抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏完全佐劑，乳化即得;所述加強(qiáng)免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:9溶于磷酸鹽緩沖液中，得加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液，在加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏不完全佐劑，乳化即得;所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.0l !1101/1，？田直為7.4。
[0015]步驟(c)所述六次甲基四胺包被抗原的制備工藝為:配制濃度為15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液;配置濃度為0.lmol/L、pH值為7.4、含有卵清蛋白4.5_5.0mg/ml的磷酸鹽緩沖液;將六次甲基四胺溶液緩慢滴加到含卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入體積比濃度為25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時(shí)，4°C靜置過(guò)夜，裝入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續(xù)透析5天，每天換液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原;所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸緩沖溶液:戊二醛水溶液的添加比例為5-6 mg: 2_5ml: 1-2 ml0
[0016]步驟(d)所述的制備膠體金溶液的方法為:將100ml質(zhì)量比濃度為0.01%的HAuCl4水溶液用恒溫磁力攪拌器加熱至沸騰，保持煮沸2-3 !1^11，攪拌，加入1.2 ml質(zhì)量比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，待溶液顏色變?yōu)橥该鞯募t色并不再變化時(shí)，保持煮沸15 min，停止加熱，攪拌，冷卻至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至100 ml。
[0017]本發(fā)明中所述六次甲基四胺溶液的溶劑為甲醇、乙醇或水中的任意一種。
[0018]本發(fā)明還可在所述的檢測(cè)方法的步驟(h)之前制備標(biāo)準(zhǔn)比色卡，所述標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備方法為:將六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品用含體積比濃度為5%的甲醇的磷酸緩沖液稀釋成系列濃度為0.01ng/ml、0.I ng/ml、0.5 ng/ml、l ng/ml、5 ng/ml和 10 ng/ml的稀釋液，以不添加六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品為空白對(duì)照，將所述六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物稀釋液按體積比為1:5混合，將所述混合液逐滴加到檢測(cè)卡上檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上；制得不同濃度六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品的比色帶，將不同東都比色帶拼接制成標(biāo)準(zhǔn)比色卡;從實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)裸眼觀察顯色情況，確定該檢測(cè)卡的最低檢出限為0.5ng/ml;濃度為0.5ng/ml以上的所述標(biāo)準(zhǔn)比色卡用作與測(cè)定樣品測(cè)試結(jié)果的比對(duì)參照卡，待測(cè)樣品通過(guò)比對(duì)，即可半定量確定待測(cè)樣品含有六次甲基四胺的含量范圍。
[0019]本發(fā)明提供的檢測(cè)方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，可以在食品安全定性及半定量檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
[0020]本發(fā)明首創(chuàng)制備了特異性和靈敏性高的六次甲基四胺的完全抗原，并以六次甲基四胺抗原為基礎(chǔ)首次研發(fā)了一種六次甲基四胺的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒中的檢測(cè)卡是以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，以硝酸纖維素膜為固相載體，包被六次甲基四胺抗原作為檢測(cè)帶，包被羊抗兔二抗作為質(zhì)控帶，加入待檢樣本和膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物(金標(biāo)記抗體)后，經(jīng)微孔濾膜毛細(xì)管作用使待測(cè)樣本中的抗原與膜上包被的抗原競(jìng)爭(zhēng)金標(biāo)記抗體，當(dāng)樣品中待檢測(cè)物濃度低時(shí)，金標(biāo)記抗體與包被抗原結(jié)合的就多，這時(shí)肉眼可見(jiàn)顯色的紅色條帶，即以此可直接判斷待測(cè)樣品中是否含有六次甲基四胺，即樣品的陰陽(yáng)性，同時(shí)，本發(fā)明還可做標(biāo)準(zhǔn)比色卡，可以將待測(cè)物與標(biāo)準(zhǔn)比色卡相比對(duì)，從而半定量預(yù)測(cè)待測(cè)物中六次甲基四胺的含量范圍。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒中的檢測(cè)卡只需固相載體硝酸纖維素膜和在其上劃線即可制備，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)速度快，靈敏性高，檢出限低，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程只需10-15分鐘，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果直觀，無(wú)需儀器，非常適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床、食品檢測(cè)、環(huán)境污染、生物沾染和生物制劑的定性或半定量免疫檢測(cè)。
[0021]同時(shí)，本發(fā)明還提供了一種利用制備的檢測(cè)試劑盒定性分析檢測(cè)樣品中是否含有的六次甲基四胺的方法，同時(shí)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)比色卡的比對(duì)，可以半定量檢測(cè)樣品中的六次甲基四胺的大致含量范圍，該方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，其最低檢測(cè)限(LOD值)為0.5ng/ml。本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間短，無(wú)需大型儀器，對(duì)樣品的前處理要求低，處理過(guò)程簡(jiǎn)單，能夠同時(shí)快速檢測(cè)大批樣品，而且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高，應(yīng)用性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)腐竹、粉絲、水產(chǎn)品中六次甲基四胺的快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)，這對(duì)于維護(hù)廣大消費(fèi)者利益及保障政府部門(mén)的食品安全監(jiān)管工作具有重大意義。
[0022]【附圖說(shuō)明】；
圖1為牛血清白蛋白的光譜掃描圖譜。
[0023]圖2為六次甲基四胺偶聯(lián)牛血清白蛋白的光譜掃描圖譜。
[0024]圖3為六次甲基四胺膠體金檢測(cè)卡檢測(cè)示意圖，其中:I為硝酸纖維素膜，2為質(zhì)控線，3為檢測(cè)線。
[0025]圖4為六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)準(zhǔn)比色卡示意圖，圖中六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度從下到上依次為:a:空白，b:0.01 ng/ml ,c:0.1 ng/ml ,d:0.5 ng/ml ,e: I ng/ml ,f: 5ng/ml，g:10ng/mlo
[0026]圖5為本發(fā)明采用檢測(cè)卡定性檢測(cè)腐竹樣品中六次甲基四胺含量的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。
[0028]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0029]實(shí)施例1六次甲基四胺完全抗原的制備
配制pH值為7.4、離子濃度為100 mmol、含有200 mg牛血清白蛋白(載體蛋白)的復(fù)合磷酸鹽緩沖液5ml ；稱(chēng)取10mg六次甲基四胺溶于400μ1甲醇中，溶解后將其滴入到配好的復(fù)合磷酸鹽緩沖液中；再加入3ml體積比濃度為25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時(shí)，4°C冰箱過(guò)夜，用磷酸鹽緩沖液連續(xù)透析5天，每天換液I次，得六次甲基四胺完全抗原(完全抗原HMTA-BSA)ο
[0030]實(shí)施例2六次甲基四胺完全抗原的鑒定
用去離子水精確配制六次甲基四胺和牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)溶液。用去離子水配制偶聯(lián)物HMT A_B S A標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用凱氏定氣法測(cè)其蛋白質(zhì)的濃度，并使偶聯(lián)物溶液蛋白質(zhì)的濃度和BSA蛋白濃度一致，在波長(zhǎng)200nm?700nm的范圍內(nèi)分別對(duì)其進(jìn)行光譜掃面，判斷其是否偶聯(lián)成功。其結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。
[0031]結(jié)果顯示:六次甲基四胺抗原的最大吸收波長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的吸光值與六次甲基四胺和牛血清白蛋白的明顯不同，由圖1和圖2對(duì)比可知，六次甲基四胺與載體蛋白發(fā)生偶聯(lián)后，其偶聯(lián)物紫外光譜掃描圖譜與載體蛋白BSA的相比，光譜曲線發(fā)生了改變，最大吸收峰處的吸收波長(zhǎng)由285nm移動(dòng)至507nm，吸光值也有所增加，這說(shuō)明載體蛋白分子上已經(jīng)成功的連接上了一定數(shù)量的六次甲基四胺半抗原小分子，說(shuō)明六次甲基四胺和牛血清白蛋白已經(jīng)偶聯(lián)成功。經(jīng)過(guò)計(jì)算，六次甲基四胺和牛血清白蛋白結(jié)合的摩爾比為7:1。
[0032]實(shí)施例3六次甲基四胺包被抗原的制備準(zhǔn)確稱(chēng)取六次甲基四胺5mg溶于300μ1甲醇當(dāng)中，然后準(zhǔn)確稱(chēng)取12mg卵清蛋白(OVA)溶于2.5ml濃度為0.lmol/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中；將溶有六次甲基四胺的甲醇溶液緩慢滴加到卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入I.5ml體積比濃度為25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時(shí)，4 0C冰箱過(guò)夜;將其裝入透析袋，4 °C下在0.0 Imo I /L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續(xù)透析5天，每天換液I次;得到的六次甲基四胺包被抗原(包被抗原HMTA-0VA)，將該抗原用碳酸鹽緩沖液(濃度為0.05mol/L、pH值為9.6)以0.75mg/ml的濃度分裝于1.5ml離心管中，于-80°C冷凍保存，備用。
[0033]實(shí)施例4六次甲基四胺多克隆抗體的制備
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫:準(zhǔn)確量取0.1ml完全抗原HMTA-BSA，溶于0.4ml濃度為0.01 mo I/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，將得到的溶液與0.5ml的弗氏完全佐劑充分乳化后進(jìn)行初次免疫，加強(qiáng)免疫用0.1ml完全抗原HMTA-BSA溶于0.9ml濃度為0.01 mol/L、pH值為7.4的PBS中，與Iml的弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行免疫，免疫兩只雄性大耳白家兔，采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)(6?9點(diǎn))注射，分別于初次免疫后2周、4周、8周、12周共加強(qiáng)免疫四次，于第五次免疫完后第10天，由兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于10毫升的離心管中，室溫靜置30min，待血楽凝聚后，4°C冰箱過(guò)夜，將血清以3000r/min離心15min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗體(抗血清)，將抗血清分裝，于-80°C冷凍保存。
[0034]實(shí)施例5膠體金顆粒的制備
采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金溶液:將質(zhì)量比濃度為0.01%的HAuCl4水溶液10ml用恒溫磁力攪拌器加熱至沸騰，保持煮沸2min，不斷攪拌的同時(shí)迅速加入質(zhì)量比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液1.2ml，期間溶液顏色變化為由灰色逐漸加深成黑色，再慢慢變紫，然后向紅色轉(zhuǎn)變，待溶液顏色變?yōu)橥该鞯募t色并不再變化時(shí)，繼續(xù)煮沸15min，撤去熱源，繼續(xù)攪拌，冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
[0035]實(shí)施例6膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物的制備與純化
制備:用0.lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至9，量取膠體金溶液1ml、六次甲基四胺多克隆抗體0.6ml，在磁力攪拌下，將六次甲基四胺多克隆抗體用微量加樣器逐滴加入到10 ml的膠體金溶液中，1min后逐滴加入質(zhì)量比濃度為10%的牛血清白蛋白(BSA)使溶液中BSA的質(zhì)量比終濃度為1%，以穩(wěn)定膠體金標(biāo)記物，攪拌30min后置于4 V過(guò)夜；
純化:將過(guò)夜后的膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體，于4 °C下1500r/min離心1min，取上清液分裝后，再于4°C下，10000r/min離心30min，棄去上清液，得膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物，可將其儲(chǔ)存液重懸為原體積的1/10，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0036]實(shí)施例7六次甲基四胺膠體金檢測(cè)卡及其試劑盒的制備
將硝酸纖維素膜裁剪為長(zhǎng)*寬為0.2cm*5cm，在其上用HMTA-0VA(六次甲基四胺包被抗原)用劃線筆劃線，劃線帶所用材料的體積為10μ1，線寬約5mm，作為檢測(cè)帶(T帶);再將0.5μI的羊抗兔二抗用PBS稀釋100倍，以相同的方法劃線，劃線帶所用羊抗兔二抗緩沖液的體積也為10μ1，即為質(zhì)控帶(C帶)，其T帶與C帶間隔0.7^11;劃線后首先在37°(:恒溫箱中固定20min，再浸泡在5%脫脂牛奶中封閉30min;將封閉完的膜用I3BST沖洗三次，用吸水紙吸去多余的水分，3 7 °C干燥15m i η后，即得檢測(cè)卡。
[0037]以上述制備的檢測(cè)卡、實(shí)施例6制備的膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物以及50-100ml磷酸鹽緩沖液(濃度為0.01 mol/L，pH值為7.4)組成六次甲基四胺的檢測(cè)試劑盒。
[0038]本發(fā)明中的羊抗兔二抗為北京博奧康生物技術(shù)有限公司的市售商品，品名為Solarb10
[0039]實(shí)施例8六次甲基四胺的檢測(cè)
預(yù)處理待測(cè)樣品:取樣，置于研缽中研磨粉碎，過(guò)篩去除大的顆粒，分別稱(chēng)取15g樣本置于蒸發(fā)皿中，加入1ml正己烷，搖勻后水浴蒸干，取出再加入1ml正己烷，搖勻繼續(xù)蒸干;分別向其中加入1ml的甲醇，搖勻，凝縮定容至lml，用PBS做1:10的稀釋?zhuān)频么郎y(cè)樣品溶液；將所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物與磷酸鹽緩沖液按1:2混合均勻，將處理后的待測(cè)樣品溶液與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物和磷酸緩沖液按體積比為I: 5混合，得混合液；
將所述混合液逐滴加到檢測(cè)卡的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上;靜置10_15min，觀察，若質(zhì)控帶和檢測(cè)帶呈紅色，則待測(cè)樣品為陰性，即表明待測(cè)樣品中不含六次甲基四胺或其含量小于0.5ng/ml最低檢出限;若僅質(zhì)控帶呈紅色，則待測(cè)樣品為陽(yáng)性，即表明待測(cè)樣品中含有六次甲基四胺，若質(zhì)控帶呈無(wú)色，則該測(cè)試無(wú)效。
[0040]實(shí)施例9六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)準(zhǔn)比色卡的制備
將六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品用含體積比濃度為5%的甲醇的磷酸緩沖液稀釋成系列濃度為0.01ng/mK0.1 ng/ml、0.5 ng/ml、l ng/ml、5 ng/ml和10 ng/ml的稀釋液，以不添加六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品為空白對(duì)照，將所述六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物稀釋液按體積比為1:5混合，將所述混合液逐滴加到檢測(cè)卡上檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上;得到不同濃度檢測(cè)條帶，拼接制得不同濃度六次甲基四胺標(biāo)準(zhǔn)品的比色卡，見(jiàn)圖4。從圖4可知，根據(jù)裸眼觀察情況，確定該檢測(cè)卡的最低檢出限為0.5ng/ml;濃度為0.5ng/ml以上的所述標(biāo)準(zhǔn)比色卡用作與測(cè)定樣品測(cè)試結(jié)果的比對(duì)參照卡，待測(cè)樣品通過(guò)比對(duì)，即可半定量確定待測(cè)樣品含有六次甲基四胺的含量范圍。
[0041]本發(fā)明提供的檢測(cè)方法通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，可以在食品安全現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中推廣應(yīng)用。
[0042]實(shí)施例10本發(fā)明制備的檢測(cè)卡及其檢測(cè)方法在食品檢測(cè)中的應(yīng)用
取適量腐竹樣品(購(gòu)于保定惠友超市，衛(wèi)生檢疫合格，高效液相色譜法檢測(cè)不含有六次甲基四胺)放入研缽中研磨粉碎，過(guò)篩去除大的顆粒，將均質(zhì)樣本置于蒸發(fā)皿中，一式兩份，分別添加0.1ng/g、10ng/g含量的六次甲基四胺，加入1ml正己烷，搖勾后水浴蒸干，再加入1ml正己烷搖勻繼續(xù)蒸干;加入1ml甲醇，搖勻，凝縮定容至lml。取樣品提取液用PBS稀釋1倍，用作待測(cè)樣品溶液。其中添加濃度為0.lng/g的腐竹為樣品1、添加濃度為10ng/g的腐竹為樣品2。
[0043]將所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物與磷酸鹽緩沖液按1:2混合，將處理后的待測(cè)樣品溶液與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物和磷酸鹽緩沖液按體積比為1:5混合，反應(yīng)5min后，將所述混合液逐滴加到檢測(cè)卡上檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上，靜置15min，觀察顯色情況。結(jié)果如圖5所示，通過(guò)肉眼可觀察出:樣品I檢測(cè)帶出現(xiàn)明顯顯色紅色條帶現(xiàn)象，則說(shuō)明該樣品中不含六次甲基四胺或含量極少(小于檢測(cè)極限值0.5ng/ml);樣品2的檢測(cè)帶用裸眼無(wú)法辨認(rèn)顯色現(xiàn)象，則說(shuō)明樣品2中含有六次甲基四胺，其濃度大于0.5ng/ml。由以上實(shí)驗(yàn)可以證明，本發(fā)明提供的試劑盒及其檢測(cè)方法檢測(cè)快速、有效，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，適合大批量樣品現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。
[0044]上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的單一限制條件。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種六次甲基四胺的檢測(cè)方法，其特征在于，采用試劑盒檢測(cè)六次甲基四胺，包括以下步驟: 所述試劑盒，包括: 檢測(cè)卡;所述檢測(cè)卡包括硝酸纖維素膜，在所述硝酸纖維素膜上設(shè)有一條含六次甲基四胺包被抗原的檢測(cè)帶和一條含有羊抗兔二抗的質(zhì)控帶； 膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物；以及 磷酸鹽緩沖稀釋液； (1)預(yù)處理待測(cè)樣品； (2)將所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物與磷酸鹽緩沖液按1:2混合，將處理后的待測(cè)樣品與所述膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物和磷酸鹽緩沖液的混合物按體積比為I: 5混合，得混合液； (3)將所述混合液逐滴加到所述檢測(cè)卡的檢測(cè)帶與質(zhì)控帶之間的區(qū)域上；靜置10-15min，觀察，若質(zhì)控帶和檢測(cè)帶都顯紅色，則待測(cè)樣品為陰性，即表明待測(cè)樣品中不含六次甲基四胺或其含量小于0.5ng/ml最低檢出限;若僅質(zhì)控帶顯紅色，則待測(cè)樣品為陽(yáng)性，SP表明待測(cè)樣品中含有六次甲基四胺且含量大于所述最低檢出限，若質(zhì)控帶均不顯色，則該測(cè)試無(wú)效； 所述試劑盒中膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物的制備工藝包括以下步驟: (A)合成六次甲基四胺完全抗原:配制濃度為200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液；配制pH值為7-10、離子濃度為10-1000 mmol、含載體蛋白30-50 mg/ml的復(fù)合磷酸鹽緩沖液；所述載體蛋白為牛血清白蛋白；將所述六次甲基四胺溶液滴加到所述復(fù)合磷酸鹽緩沖液中，再加入體積比濃度為25%的戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置1-2小時(shí)，4°C冰箱過(guò)夜，再裝入透析袋中，透析3-5天，每天換液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原;所述六次甲基四胺:復(fù)合磷酸鹽緩沖液:戊二醛水溶液質(zhì)量體積比為:80-120 mg: 1-5ml: 2_3ml; (B)制備六次甲基四胺多克隆抗體:用所述六次甲基四胺完全抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫，獲得六次甲基四胺多克隆抗體； (C)制備膠體金溶液:將100ml質(zhì)量比濃度為0.01%的HAuCl4的水溶液邊攪拌邊加熱至沸騰，保持煮沸2-3 min，攪拌，加入1.2 ml質(zhì)量比濃度為1%的檸檬酸三鈉水溶液，待溶液顏色變?yōu)橥该鞯募t色并不再變化時(shí)，保持煮沸15 min，停止加熱，攪拌，冷卻至室溫，添加蒸餾水恢復(fù)溶液至100 ml； (D)制備膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物:調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為8-10，按體積比1:0.06取所述膠體金溶液和所述六次甲基四胺多克隆抗體，在磁力攪拌下，將所述六次甲基四胺多克隆抗體逐滴加入到所述膠體金溶液中，10-15 min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的終濃度達(dá)到1-2%，攪拌30-40min，置于4 °C下過(guò)夜；在4°C下1500r/min離心lOmin，取上清液于4°C下、10000r/min離心30min，棄去上清液，得膠體金標(biāo)記六次甲基四胺多克隆抗體復(fù)合物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的六次甲基四胺的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(B)所述的制備六次甲基四胺多克隆抗體的工藝為:采用初次免疫制劑對(duì)兩只雄性大耳白家兔進(jìn)行初次免疫，之后用加強(qiáng)免疫制劑分別于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加強(qiáng)免疫I次，采用背部皮下脊柱兩側(cè)多點(diǎn)進(jìn)行免疫，于最后一次免疫完第10天，從兔子的耳緣靜脈取血，將血清收集于離心管中，室溫靜置30-35min，待血漿凝聚后，4°C靜置過(guò)夜，將血清以3000 r/min離心15-20 min，得到的上清液為六次甲基四胺多克隆抗血清。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的六次甲基四胺的檢測(cè)方法，其特征在于，所述初次免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:4溶于磷酸鹽緩沖液中，得抗原磷酸緩沖液，在抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏完全佐劑，乳化即得;所述加強(qiáng)免疫制劑的制備工藝為將所述六次甲基四胺完全抗原按體積比為1:9溶于磷酸鹽緩沖液中，得加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液，在加強(qiáng)抗原磷酸緩沖液中加入與其等體積的弗氏不完全佐劑，乳化即得;所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01 mol/L，pH值為7.4。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的六次甲基四胺的檢測(cè)方法，其特征在于，所述試劑盒檢測(cè)卡的六次甲基四胺包被抗原的制備工藝為:配制濃度為15_25mg/ml的六次甲基四胺溶液;配置濃度為0.lmol/L、pH值為7.4、含有卵清蛋白4.5_5.0mg/ml的磷酸鹽緩沖液;將六次甲基四胺溶液緩慢滴加到含卵清蛋白磷酸緩沖溶液中，之后，再加入體積比濃度為25%戊二醛水溶液，混勻，室溫靜置I小時(shí)，4 °C靜置過(guò)夜，裝入透析袋，4 °C下在0.0ImoI/L、pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液中連續(xù)透析5天，每天換液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸緩沖溶液:戊二醛水溶液的添加比例為5-6 mg: 2-5ml: 1-2 ml。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK106018793SQ201610330766
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年5月8日
【發(fā)明人】王庭欣, 周麗巖, 孟墨, 龐艷榮, 王庭祥, 謝飛, 任勃儒
【申請(qǐng)人】河北大學(xué)