本發(fā)明屬于基因診斷領域，涉及肝纖維化早期診斷，具體涉及乙肝患者肝纖維化早期診斷用lncrna基因標志物和試劑盒。
背景技術：
：乙型肝炎發(fā)展至肝纖維化階段仍然是可逆的，因此，準確診斷肝的纖維化程度具有重要的臨床意義?，F(xiàn)行診斷方法仍以組織病理學診斷作為金標準，而獲取肝組織的部分切除手術以及穿刺活檢術均為有創(chuàng)檢查。比較而言，無創(chuàng)診斷方法更易被臨床接受。雖然肝組織病理學檢查是診斷肝纖維化的金標準，但由于標本取材部位局限，不一定能代表肝纖維化的整體水平，而且穿刺取材可能造成出血、繼發(fā)感染等并發(fā)癥，并不易被患者接受，尤其是肝纖維化程度較輕、肝炎活動相對穩(wěn)定的部分患者。非編碼rna是指不編碼蛋白質(zhì)的rna，其中包括rrna、trna、snrna、snorna、mirna及長鏈非編碼rna(lncrna)。lncrna是一類長度大于200堿基的rna分子，由于缺少有效的開放式閱讀框不編碼蛋白，但具備復雜的生物學功能并在各種生物過程中發(fā)揮重要的作用，如染色質(zhì)修飾、x染色體的失活、參與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯以及到蛋白活動調(diào)控等，其變異和調(diào)節(jié)能夠?qū)е掳[瘤在內(nèi)的多重疾病。已有研究將組織或血液中的lncrna作為疾病診斷的標志物。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供靈敏度高、特異性強、準確度高的lncrna基因標志物用于乙肝患者肝纖維化早期診斷，以實現(xiàn)肝纖維化的無創(chuàng)診斷。實現(xiàn)本發(fā)明上述目的技術方案如下：血漿lncrna基因標志物在制備早期診斷乙肝患者肝纖維化的試劑盒中的應用，所述lncrna基因標志物由lncrnaccat2和lncrnauca1組成。一種引物組合物，用于測定血漿中l(wèi)ncrna基因標志物lncrnaccat2和lncrnauca1的表達水平，包括seqidno.1所示的lncrnaccat2的上游引物、seqidno.2所示的lncrnaccat2的下游引物、seqidno.3所示的lncrnauca1的上游引物和seqidno.4所示的lncrnauca1的下游引物。優(yōu)選地，所述的引物組合物還包括seqidno.5所示的內(nèi)參u6的上游引物和seqidno.6所示的內(nèi)參u6的下游引物。一種早期診斷乙肝患者肝纖維化的試劑盒，包括上述引物組合物。優(yōu)選地，所述的試劑盒還包括rt-pcr反應所需的酶和試劑。本發(fā)明的突出優(yōu)點：本發(fā)明提供的lncrna基因標志物lncrnaccat2和lncrnauca1聯(lián)合用于診斷乙肝患者肝纖維化的診斷性能優(yōu)異，準確度和靈敏度高，特異性強，可以用于開發(fā)成早期診斷乙肝患者肝纖維化的診斷試劑盒。附圖說明圖1為lncrnaccat2和lncrnauca1聯(lián)合用于診斷乙肝患者肝纖維化的roc曲線；圖2為lncrnaccat2單獨用于診斷乙肝患者肝纖維化的roc曲線；圖3為lncrnauca1單獨用于診斷乙肝患者肝纖維化的roc曲線。具體實施方式下面就結(jié)合實施例具體介紹本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，由于篇幅原因，實驗過程的描述無法做到非常詳細，凡是實驗中未詳細描述的部分均為本領域技術人員熟知的常規(guī)操作。一、實驗樣本和試劑1、測試集樣本金標準病理學加影像學檢查方法：經(jīng)皮肝穿刺活檢術采用16g活檢針，在超聲引導下采集肝右葉組織，長度不小于1.5cm，肝切除手術患者組織取材于切除部分近邊緣無其他病變處。組織標本經(jīng)10％甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，經(jīng)he、masson和網(wǎng)織纖維染色，由經(jīng)驗豐富的、具有中級職稱的病理醫(yī)師閱片，采用scheuer分級標準進行肝纖維化分期：s0期為無肝纖維化；s1期為匯管區(qū)纖維化擴大，局限于竇周及小葉內(nèi)纖維化；s2期為匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，小葉結(jié)構保留；s3期為纖維間隔伴有小葉結(jié)構紊亂，無肝硬化；s4期為早期肝硬化。測試集樣本收集于2014年3月至2015年3月間江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽外科擬行肝切除手術或經(jīng)皮肝穿刺活檢術的乙型肝炎患者114例，其中男74例，女40例，年齡27-52歲。排除嗜酒及酗酒患者，以及明確藥物依賴史及膽道梗阻患者。全部乙肝患者未發(fā)現(xiàn)明確腹腔積液，肝功能分級均為childa級，具體包括無明顯肝纖維化患者48例(s0-s1期，稱為nfg組)、明顯肝纖維化患者66例(≥s2期，即s2、s3、s4期，稱為ofg組)。ofg和nfg樣本性別年齡無顯著差異(p＜0.05)。2、驗證集樣本測試集樣本收集于2014年3月至2015年3月間南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽外科擬行肝切除手術或經(jīng)皮肝穿刺活檢術的乙型肝炎患者196例，其中男112例，女84例，年齡28-55歲。排除嗜酒及酗酒患者，以及明確藥物依賴史及膽道梗阻患者。全部乙肝患者未發(fā)現(xiàn)明確腹腔積液，肝功能分級均為childa級，具體包括無明顯肝纖維化患者100例(s0-s1期，稱為nfg組)、明顯肝纖維化患者96例(≥s2期，即s2、s3、s4期，稱為ofg組)。ofg和nfg樣本性別年齡無顯著差異(p＜0.05)。3、部分試劑trizol試劑，美國invitrogen公司；primescripttmrtreagentkit，日本takara公司；sybrpremixextaqtm，日本takara公司；引物設計好后由上海生工生物工程有限公司合成。二、實驗方法1、血漿樣本收集用edta抗凝管分別采集各樣本的靜脈血5ml，靜置10min后，常溫下以3000r/min離心10min，可見分為兩層，用移液槍吸取上層透明淡黃色液體即血漿，分裝成1ml于1.5mlep管后，置于-80℃保存。2、血漿總rna提取(trizol法)及濃度測定按比例(1ml血漿:3mltrizol)往血漿加入trizol，混勻后于4℃放置10min；再按比例(1mltrizol:200μl氯仿)加入氯仿200μl，劇烈振蕩，4℃放置15min，4℃12000×g離心15min后吸取上層水相至新ep管；按比例(1mltrizol:500μl異丙醇)加入異丙醇500μl，混勻，4℃放置10min，4℃12000×g離心10min，棄上清，rna沉于管底；按比例(1mltrizol:1ml75％乙醇)加入75％乙醇1ml，溫和振蕩，4℃12000g離心5min，棄上清(重復75％乙醇洗滌一次)，晾干；加10μldepc水溶解rna，吸取2μlrna溶液用于測定濃度，其余于-80℃保存。將2μlrna溶液在紫外分光光度計中測定rna濃度，調(diào)節(jié)od260/od280于1.9-2.1間。3、逆轉(zhuǎn)錄反應反應體系如下表：反應條件：37℃，15min逆轉(zhuǎn)錄反應；85℃，5s逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應；4℃，反應結(jié)束，產(chǎn)物為cdna。于-20℃冰箱保存待用。4、引物設計和合成引物設計如下，由上海生工生物工程有限公司合成：5、rt-pcr反應反應體系如下表：反應條件：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個循環(huán)；4℃保存。6、數(shù)據(jù)分析熒光定量pcr結(jié)束后，查看擴增曲線和熔解曲線，分析擴增情況，從電腦中導出相應循環(huán)ct值。以u6為內(nèi)參，計算lncrnaccat2和lncrnauca1相對表達量。數(shù)據(jù)用2-δδct法進行相對定量分析，δct＝ct目的-ct內(nèi)參，δδct＝δct實驗-δct對照。數(shù)據(jù)分析采用spss20.0軟件進行，數(shù)據(jù)表示方法為均值±標準差，組間比較采用t檢驗，p<0.05認為有統(tǒng)計學差異。在測試集樣本中，以目標lncrna的相對內(nèi)參表達量為自變量，組別為應變量，建立乙肝患者肝纖維化診斷的logistic回歸模型，回歸模型的擬合度采用似然比檢驗，回歸參數(shù)估計值采用wald檢驗。根據(jù)roc曲線及曲線下面積(auc)評估目標lncrna聯(lián)合診斷的敏感性和特異性。最后用驗證集驗證診斷準確度。三、實驗結(jié)果1、目標lncrna在測試集樣本中的表達水平與nfg組比較，ofg組血漿lncrnaccat2和lncrnauca1的相對內(nèi)參表達量顯著上調(diào)(p＜0.05)，變化倍數(shù)如表1。表1ofg組相對于nfg組各lncrna的相對內(nèi)參表達量的變化倍數(shù)目標lncrna上調(diào)倍數(shù)p值lncrnaccat23.860.0008lncrnauca13.920.00132、測試集目標lncrna的roc曲線分析以測試集ofg組和nfg組所有樣本中l(wèi)ncrnaccat2和lncrnauca1的相對內(nèi)參表達量作為自變量(設x1＝lncrnaccat2相對內(nèi)參表達量，x2＝lncrnauca1相對內(nèi)參表達量)，以組別作為應變量(ofg組設為1，nfg組設為2)，對lncrnaccat2和lncrnauca1在ofg組和nfg組樣本中的相對內(nèi)參表達量進行二元邏輯回歸，得到二元邏輯回歸方程；再將各樣本中l(wèi)ncrnaccat2和lncrnauca1的相對內(nèi)參表達量代入該二元邏輯回歸方程，即可得到各個樣本的回歸值，以可能的回歸值作為診斷點，計算靈敏度和特異性，據(jù)此繪制roc曲線。得邏輯回歸方程：logit＝-3.323+0.914x1+0.409x2。模型擬合參數(shù)如表2。表2目標lncrna聯(lián)合診斷ofg的logistic模型擬合參數(shù)自變量系數(shù)標準誤wald檢驗p值or值ccat20.9140.0013.8670.000.00uca10.4090.00114.0580.000.31截距-3.3230.31515.2620.000.00roc曲線如圖1所示，roc曲線下面積為0.982，最佳cutoff值為0.499(診斷閾值)，最佳cutoff值處靈敏度為96.24％，特異性為96.07％。roc曲線下面積auc作為診斷試驗真實性評價的固有準確度指標已被普遍認可，完全無價值的診斷試驗auc為0.5，理想的診斷試驗auc為1；一般認為，auc在0.5-0.7之間時診斷價值較低，在0.7-0.9之間時具有一定的診斷價值，在0.9以上時診斷價值較高。因此，lncrnaccat2和lncrnauca1聯(lián)合診斷ofg和nfg具有較高診斷價值，且auc顯著優(yōu)于lncrnaccat2或lncrnauca1單個用于診斷區(qū)分ofg和nfg(auc分別為0.746、0.763，分別如圖2、3所示)。3、驗證集獨立驗證目標lncrna聯(lián)合診斷ofg的準確性在驗證集中，基于二元邏輯回歸方程(logit＝-3.323+0.914x1+0.409x2)將驗證集所有樣本中目標lncrna的相對內(nèi)參表達量作二元邏輯回歸變換，計算出所有樣本中目標lncrna相對內(nèi)參表達量的邏輯回歸值。低于最佳cutoff值0.499(診斷閾值)的預測為nfg，高于最佳cutoff值0.499的預測為ofg，最后計算出以血漿lncrnaccat2和lncrnauca1表達水平診斷ofg的準確率、靈敏度和特異性。lncrnaccat2和lncrnauca1在驗證集中聯(lián)合診斷ofg的效能如表3。表3目標lncrna在驗證集中診斷ofg的效能由上表可以看出，在驗證集中，血漿lncrnaccat2和lncrnauca1聯(lián)合用于診斷ofg的準確度極高，達97.4％，196個樣本僅有5個樣本診斷錯誤。上述實驗表明，本發(fā)明提供的lncrna基因標志物lncrnaccat2和lncrnauca1聯(lián)合用于診斷乙肝患者肝纖維化的診斷性能優(yōu)異，準確度和靈敏度高，特異性強，可以用于開發(fā)成早期診斷乙肝患者肝纖維化的診斷試劑盒。上述實施例是對本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容的體現(xiàn)，用于更好地解釋本發(fā)明，但本領域技術人員應當知曉，不應將本發(fā)明的保護范圍局限于上述具體的實施例。sequencelisting<110>南京蓋斯夫醫(yī)藥科技有限公司<120>乙肝患者肝纖維化早期診斷用lncrna基因標志物和試劑盒<130>1<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1ttgcttaacctcttcctatctcag24<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<400>2gtattaactctggctacacctctt24<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gcttaggctggcaaccatca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4aagctgaggctggcaaagag20<210>5<211>17<212>dna<213>人工序列<400>5ctcgcttcggcagcaca17<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6aacgcttcacgaatttgcgt20當前第1頁12