專(zhuān)利名稱(chēng)：多肽測(cè)序的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)多肽進(jìn)行測(cè)序的方法和試劑盒。本方法和試劑盒對(duì)鑒定高分子量多肽，用于生物學(xué)、藥物學(xué)、個(gè)人清潔和織物清潔領(lǐng)域特別有用。
背景技術(shù)：
近來(lái)，對(duì)于高靈敏度肽和多肽測(cè)序用途已開(kāi)發(fā)了基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)質(zhì)譜分析和電子噴霧離子化。見(jiàn)例如Spengler等，“通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜分析進(jìn)行肽測(cè)序(Peptide Sequncing by Matrix-assistedLaser-desorption Mass Spectrometry)”，Rapid Communication in MassSpectrometry，Vol.6，pp.105-108(1992)；Spengler等，“基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜分析中源后衰變的基本形式(Fundamental Aspects of PostsourceDecay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry)”，Journalof Physical Chemistry，Vol.96，pp.9678-9684(1992)；Kaufman等，“通過(guò)采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化在反射飛行時(shí)間中的產(chǎn)物離子分析進(jìn)行線性肽的質(zhì)譜分析測(cè)序(Mass Spectrometry Sequncing of Linear Peptides byProduct-ion Analysis in a Reflection Time-of-flight Mass SpectrometerUsing Matrix-assisted Laser Desorption Ionization)”，RapidCommunication in Mass Spectrometry，Vol.7，pp.902-910(1993)；Kaufmann等“在飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中的肽測(cè)序基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)后源后衰變的評(píng)估(Sequencing of Peptides in a Time-of-flight Mass Spectrometer；Evaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted LaserDesorption Ionisation(MALDI))，International Journal of MassSpectrometry and Ion Process，Vol.l31，pp.355-385(1994)Kaufmann等，“基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-反射飛行時(shí)間質(zhì)譜分析中的源后衰變和遲發(fā)提取(Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted LaserDesorption/Ionisation-Reflection Time-of-flight Mass Spectrometry)”，Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol.10，pp.1199-1208(1996)；和Spengler，“生物分子的基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析中的源后衰變分析(Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted LaserDesorption/Ionizat ion Mass Spectrometry of Biomolecules)”，Journal ofMass Spectrometry，Vol.32，pp.1019-1036(1997)；Carr等，“分析生物技術(shù)中質(zhì)譜分析的集合(Integration of Mass Spectrometry in AnalyticalBiotechnology)”，Analytical Chemistry，Vol.68，pp.2802-2824(1991)；YatesIII等，“用MS探索基因組(Mining Genomes With MS)”，AnalyticalChemistry，Vol.68，pp.534A-540A，(1996)；Morris等，“新穎四極/直角加速飛行時(shí)間質(zhì)譜儀上的高靈敏度碰撞激活的分解串聯(lián)質(zhì)譜分析(HighSensitivity Collisionally Activated Decompostion Tandem MassSpectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-flight Mass Spectrometer)”，Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol.10，889-896(1996)。
MALDI在質(zhì)譜分析領(lǐng)域提供了幾個(gè)進(jìn)步。例如，MALDI比常規(guī)電噴三重四極設(shè)備靈敏度高。當(dāng)與飛行時(shí)間質(zhì)譜分析儀聯(lián)用時(shí)，MALDI還能用于比用三重四極設(shè)備分析的肽質(zhì)量更大的肽。MALDI還可用于分析樣品純化最低的復(fù)雜混合物。另一方面，電噴離子化易于和強(qiáng)效分離技術(shù)(包括液相層析(LC)和各種形式的毛細(xì)電泳(CE))接合。當(dāng)使用LC和CE作為樣品純化和引入裝置時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)高度自動(dòng)化分析。
然而，目前MALDI和在較低的程度上電噴離子化質(zhì)譜法，不能充分提供可預(yù)測(cè)的串聯(lián)質(zhì)譜片段化圖式。例如，通常觀察到多個(gè)離子系列(包括a-離子、b-離子和y-離子)，導(dǎo)致MALDI發(fā)送后衰變譜太復(fù)雜，不能有效翻譯和測(cè)序。電噴離子化產(chǎn)生的帶多個(gè)電荷的前體離子形成了多種離子系列(b-和y-離子)，加上中間片段以及帶單個(gè)或多個(gè)電荷的離子，得到的串聯(lián)質(zhì)譜也常常難于從頭翻譯。因此，片段化的問(wèn)題已限制了用質(zhì)譜分析快速測(cè)序多肽的能力。結(jié)果，質(zhì)譜分析特別是MALDI質(zhì)譜分析在該領(lǐng)域中價(jià)值有限。
幾個(gè)研究小組已嘗試通過(guò)使用化學(xué)衍生技術(shù)，改進(jìn)質(zhì)譜分析在多肽測(cè)序領(lǐng)域中的實(shí)用性。已利用這些技術(shù)在肽的MSMS譜中促進(jìn)和指導(dǎo)片段化，目標(biāo)是提高靈敏度和降低得到的質(zhì)譜的復(fù)雜性。這些已知技術(shù)大多提供了陽(yáng)離子衍生物。見(jiàn)例如Kidwell等，“用二級(jí)離子質(zhì)譜分析進(jìn)行肽測(cè)序(Sequencing ofPeptides by Secondary Ion Mass Spectrometry)”Journal of the AmericanChemical Society，Vol.106，pp.2219-2220(1984)(用季銨基團(tuán)衍生，用靜態(tài)SIMS離子化法分析(在MALDI和電噴離子化開(kāi)發(fā)之前))。使用MALDI和電噴離子化與低能碰撞活化這些技術(shù)證明一般無(wú)效。
最近，研究人員已利用其它衍生技術(shù)，嘗試用質(zhì)譜分析法改進(jìn)肽/多肽測(cè)序。例如，已顯示氧化存在于胰蛋白酶肽(用胰蛋白酶消化產(chǎn)生的肽)中的半胱氨酸殘基可改進(jìn)電噴串聯(lián)質(zhì)譜的片段化。見(jiàn)例如Gaskell等，“氣相肽離子的低能量分解中質(zhì)子化位點(diǎn)的作用(Role of the Site of Protonation in theLow-Energy Decompositions of Gas-Phase peptide Ions)”，Journal of theAmerican Society of mass Spectrometry，Vol.7，pp.522-531(1996)和Gaskell等，“半胱氨酸氧化成磺基丙氨酸對(duì)質(zhì)子化肽的碰撞激活分解的影響內(nèi)部離子化相互作用的證據(jù)(Influence of Cysteine to Cysteic Acid Oxidationon the Collision-Activated Decomposition of Protonated PeptidesEvidence for intraionic Interactions)”，Journal of the American Societyof Mass Spectrometry，Vol.3，pp，337-344(1992)。特別是促進(jìn)了y-離子片段化。然而，該技術(shù)有幾個(gè)局限之處。例如，該技術(shù)不能延伸至MALDI方法。該技術(shù)還僅限于分析在待分析的序列中存在的那些具有半胱氨酸殘基的多肽。事實(shí)上，半胱氨酸很少存在于天然多肽中，導(dǎo)致該技術(shù)實(shí)用性上的嚴(yán)重局限。
因此，需要提供一種簡(jiǎn)單有效，可廣泛應(yīng)用于野生型和突變型多肽的多肽測(cè)序的質(zhì)譜方法。本發(fā)明提供了一種使用質(zhì)譜分析技術(shù)的高靈敏度多肽測(cè)序方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，具有相對(duì)強(qiáng)的酸性基團(tuán)的多肽和從其衍生的肽可提供近乎專(zhuān)一的y-離子片段化，得到能從頭易于翻譯的質(zhì)譜。本發(fā)明還涉及用于方便實(shí)施本方法的試劑盒。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及特別用于多肽測(cè)序的質(zhì)譜分析方法和試劑盒。該方法涉及測(cè)定多肽的氨基酸序列，步驟包括(a)用一種或多種當(dāng)和多肽或肽偶聯(lián)時(shí)，pKa小于2的酸性基團(tuán)衍生該多肽的N-末端或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽的N-末端，提供一種或多種衍生的分析物；(b)用質(zhì)譜分析技術(shù)分析一種或多種衍生的分析物，提供片段化模式；和(c)翻譯該片段化模式。
本發(fā)明的試劑盒含有一種或多種酸性基團(tuán)試劑，當(dāng)與多肽偶聯(lián)時(shí)，它提供pKa小于2的酸性基團(tuán)；和衍生該多肽N-末端或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽的N-末端的方法。本發(fā)明的試劑盒和實(shí)施該方法相結(jié)合特別有用。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法和試劑盒用于多肽測(cè)序，包括野生型、突變型和/或合成多肽。該方法和試劑盒特別用于鑒定用于例如生物學(xué)、藥物學(xué)、個(gè)人清潔和織物清潔領(lǐng)域的高分子量多肽。
本發(fā)明的方法和試劑盒具有廣泛的實(shí)用性。用途包括但不限于促進(jìn)需要迅速測(cè)定肽或多肽序列的生物學(xué)研究；鑒定蛋白質(zhì)中的翻譯后修飾和鑒定變體蛋白質(zhì)中的氨基酸修飾，如用于商業(yè)洗滌和清潔產(chǎn)品的那些；幫助設(shè)計(jì)基因克隆的寡核苷酸探針；迅速確定定向進(jìn)化研究中形成的產(chǎn)物的特征；組合化學(xué)和肽文庫(kù)的鑒定；和蛋白組學(xué)。
該方法涉及在多肽或通過(guò)切割該多肽形成的一條或多條肽的N-末端加上一個(gè)或多個(gè)較強(qiáng)的酸性基團(tuán)，然后用于質(zhì)譜分析。不希望受理論限制，相信得到的帶負(fù)電的衍生物有利于低能帶電位點(diǎn)引發(fā)的片段化。這在多肽或其衍生肽的C-末端是堿性或疏水殘基優(yōu)選堿性殘基時(shí)特別有效。另外，不受理論所限，相信在質(zhì)譜分析中質(zhì)子化一堿性殘基時(shí)，較強(qiáng)的酸性基團(tuán)將被去質(zhì)子化，它反向平衡了堿性殘基處的正電荷。離子化該衍生物的另一個(gè)質(zhì)子將基本上“自由”的隨機(jī)離子化多肽/肽骨架的酰氨基團(tuán)，因?yàn)樽顗A性的殘基已被質(zhì)子化。另外，不受理論所限，相信當(dāng)在多肽/肽中摻入第二個(gè)較強(qiáng)的酸性基團(tuán)時(shí)，兩個(gè)酸基團(tuán)都將去質(zhì)子化，提供了兩個(gè)基本上“自由”的質(zhì)子，來(lái)隨機(jī)離子化多肽/肽的骨架酰氨基團(tuán)。
利用本方法，提供了顯著增加的片段化效率。另外，對(duì)于具有相同序列的衍生肽與非衍生肽相比，觀察到片段離子信噪比增大。得到的樣品PSD MALDI和電噴串聯(lián)質(zhì)譜可按常規(guī)從頭翻譯。
在該公開(kāi)中參考了出版物和專(zhuān)利。所有本文引用的參考文獻(xiàn)在此引入以供參考。
本文所用的所有百分?jǐn)?shù)、比率和比例是以重量計(jì)的，除非另作說(shuō)明。
本文所用的縮寫(xiě)將被用來(lái)描述氨基酸。下文表I描述了這些縮寫(xiě)。表I中的其它描述是平均氨基酸殘基質(zhì)量，用于實(shí)施本發(fā)明。
表I
定義本文所用的術(shù)語(yǔ)“解吸離子化”指分析物作為離子從固相轉(zhuǎn)移到氣相。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“解吸”指分析物從表面分離和/或分析物進(jìn)入氣相。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“離子化”指在分析物上產(chǎn)生或維持一種等于加上或減去一個(gè)或多個(gè)電子單位的電荷的過(guò)程。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“MALDI”指基質(zhì)輔助激光解吸離子化。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”(參見(jiàn)“MALDI”)指可以與感興趣的多肽或其產(chǎn)生的肽在溶液中混合的小酸性光吸收性化學(xué)物質(zhì)，混合的方式是在樣品階段干燥后，晶狀的包埋在基質(zhì)中的分析物可在激光照射后成功解吸或離子化，從固相中進(jìn)入氣相或液相。另外，可將多肽或其產(chǎn)生的肽的溶液加到樣品階段預(yù)先干燥的合適基質(zhì)上。合適基質(zhì)的非限制性例子包括煙酸、芥子酸、阿巍酸、血凝酸、a-氰基-4-羥基肉桂酸，以及混有硝基纖維素的a-氰基-4-羥基肉桂酸。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“電噴離子化”指將溶液在高壓下從毛細(xì)電極向接地的相反電極靜電噴射，從溶液產(chǎn)生離子的過(guò)程。該定義同時(shí)包括電噴離子化和氣動(dòng)輔助電噴離子化，也指離子噴霧。本文所用的術(shù)語(yǔ)“電噴離子化”用于所有液體流速并包括微米噴霧和納米噴霧實(shí)驗(yàn)。另外，該定義將用于分析注入離子源而不分開(kāi)的肽，用于分析在電子噴霧離子化之前已分開(kāi)的肽或肽混合物。合適的在線分離方法包括但不限于HPLC、毛細(xì)HPLC和毛細(xì)電泳。可用各種質(zhì)譜分析儀進(jìn)行電噴離子化實(shí)驗(yàn)，包括但不限于三重四極透鏡、離子收集器、正交加速飛行時(shí)間分析儀和Fourier Trandform Ion CyclotronResonance儀。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”指具有兩個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的分子。本發(fā)明的方法適用于高分子量多肽的序列鑒定。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“野生型”指非突變生物體產(chǎn)生的多肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“突變型”指具有與野生型多肽的氨基酸序列不同的多肽。
本發(fā)明的方法本發(fā)明方法用于測(cè)定多肽的氨基酸序列。本發(fā)明使用詞組“測(cè)定氨基酸序列”不意味著限于測(cè)定給定多肽的整個(gè)序列，而是指測(cè)定序列的一部分、多個(gè)部分和/或整個(gè)序列。
本方法涉及在一條多肽或其一條或多條肽的N-末端加上一個(gè)或多個(gè)較強(qiáng)的酸性基團(tuán)，以產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)供質(zhì)譜分析的衍生的分析物。然后用質(zhì)譜分析技術(shù)分析多肽/肽，以提供片段化模式。翻譯得到的片段化模式，從而實(shí)現(xiàn)多肽的測(cè)序。
本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)衍生基團(tuán)的酸性對(duì)得到的質(zhì)譜有很深刻的作用。令人驚異的是，當(dāng)pKa小于2的酸性基團(tuán)與多肽或其產(chǎn)生的肽偶聯(lián)時(shí)，將產(chǎn)生易于翻譯的片段化模式，而提供所需的序列信息。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員完全能用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)量本文所述的pKa值。這些方法的非限制性例子包括例如滴定法和電化學(xué)方法。測(cè)量pKa值的優(yōu)選方法是通過(guò)滴定。
本發(fā)明的方法可如下實(shí)施多肽和/或多肽產(chǎn)生的肽的衍生本發(fā)明的一個(gè)重要特征是用一個(gè)或多個(gè)較強(qiáng)的酸性基團(tuán)(即當(dāng)與多肽或該多肽產(chǎn)生的肽偶聯(lián)時(shí)，pKa小于2，優(yōu)選小于0，更優(yōu)選小于-2的酸性基團(tuán))衍生感興趣的多肽或該多肽產(chǎn)生的肽?！岸嚯漠a(chǎn)生的肽”在本文中意味著多肽被消化或切割(本文籠統(tǒng)稱(chēng)為“消化”等)成兩條或多條肽。將得到的肽按照本方法衍生?！爱?dāng)……偶聯(lián)時(shí)”意味著酸性基團(tuán)的pKa定義為與多肽或其產(chǎn)生的肽共價(jià)鍵合后測(cè)量的。
可用任何方法產(chǎn)生多肽或其產(chǎn)生的肽。例如，如需要，可分離感興趣的多肽用于分析?？刹捎脦讉€(gè)分離程序，包括一維和兩維凝膠電泳。作為另一個(gè)實(shí)施例，可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的組合化學(xué)方法合成多肽。
消化可通過(guò)許多方法發(fā)生，包括凝膠內(nèi)或在膜上，優(yōu)選在凝膠內(nèi)，見(jiàn)例如Shevchenko等，“對(duì)來(lái)自銀染色的聚丙烯酰胺凝膠的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)序(Mass Spectrometric Sequncing of Proteins from Silver-StrainedPolyacrylamide Gels)”，Analytical Chemisty，Vol.68，pp.850-858(1996)。然而，可以用酶或化學(xué)方法消化多肽，優(yōu)選用酶。最優(yōu)選是采用一種消化方法，該方法在產(chǎn)生的肽的C-末端或附件產(chǎn)生堿性或疏水性殘基，最優(yōu)選堿性殘基?！霸凇弊衷诒疚闹兄笁A性或疏水性殘基是肽的C-末端殘基?！案浇痹诒疚闹兄笁A性或疏水性殘基優(yōu)選距該肽C-末端約40個(gè)氨基酸殘基，較優(yōu)選約30個(gè)殘基，更優(yōu)選約20個(gè)殘基和最優(yōu)選約10個(gè)氨基酸殘基之內(nèi)。
雖然該過(guò)程中可采用許多方法，但優(yōu)選用酶消化多肽，使用例如胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶LysC、內(nèi)切蛋白酶ArgC或胰凝乳蛋白酶，優(yōu)選胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶LysC和內(nèi)切蛋白酶ArgC，最優(yōu)選胰蛋白酶。胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Lys C和內(nèi)切蛋白酶Arg C是優(yōu)選的，因?yàn)榈玫降亩嚯漠a(chǎn)生的肽通常將在C-末端以精氨酸或賴氨酸殘基(堿性殘基)結(jié)束，當(dāng)然除了該多肽原來(lái)的C-末端。胰凝乳蛋白酶也是消化優(yōu)選的，它通常切斷疏水性氨基酸殘基。還可用化學(xué)消化。例如用氰化溴消化。
本發(fā)明的方法可按照Patterson等，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,821,063，授予PerSeptive Biosystems，Inc.，1998年10月13日提交，特別是其中所述的消化技術(shù)來(lái)修改。例如，可采用多個(gè)具有不同試劑和多肽比的樣品并按照本發(fā)明予以衍生。
然而，不總是需要消化，特別是當(dāng)測(cè)序(但當(dāng)然不限于)小型多肽時(shí)。本文所用的“小型”多肽包括那些優(yōu)選少于50個(gè)氨基酸殘基，較優(yōu)選少于40個(gè)殘基，更優(yōu)選少于30個(gè)，還要優(yōu)選少于20個(gè)殘基和最優(yōu)選少于10個(gè)氨基酸殘基的多肽。
例如，可用熟知方法，包括組合化學(xué)法(“合成多肽”)合成的那些將確定特征的多肽。就此，最優(yōu)選合成在得到的多肽C-末端或附近具有堿性或疏水性殘基，優(yōu)選堿性殘基的多肽。
用一個(gè)或多個(gè)pKa小于2，優(yōu)選小于0，最優(yōu)選小于-2(當(dāng)和多肽或肽偶聯(lián)時(shí))的酸性基團(tuán)衍生多肽(如果多肽足夠“小”，如本文定義的)或該多肽產(chǎn)生的肽，以提供衍生的分析物。通過(guò)和酸性基團(tuán)試劑偶聯(lián)制備了該衍生的分析物的酸性基團(tuán)。酸性基團(tuán)試劑不受限制，只要該多肽或其產(chǎn)生的肽上的酸性基團(tuán)具有本文所述的pKa?？捎糜谂悸?lián)的酸性基團(tuán)試劑的非限制性例子包括例如二硫二(丙酸磺基琥珀酰亞氨)、S-乙?；鶐€基琥珀酸酐、2-亞氨基硫烷(還可稱(chēng)作Traut’s試劑)、二硫二乙二醇酐、四氟琥珀酸酐、六氟戊二酸酐、磺基琥珀酸酐、2-磺基苯甲酸環(huán)酐、氯化磺?；阴Ｂ群?，3-丙磺酸內(nèi)酯。使用例如S-乙?；鶐€基琥珀酸酐、2-亞氨基硫烷和二硫二乙二醇酐等試劑需要在衍生肽后氧化產(chǎn)生酸性基團(tuán)。不需要氧化步驟的酸性基團(tuán)試劑包括例如四氟琥珀酸酐、六氟戊二酸酐、磺基琥珀酸酐、2-磺基苯甲酸環(huán)酐和氯磺?；阴Ｂ取＿@些試劑通常是優(yōu)選的，因?yàn)楦行У暮铣珊?或在多肽或其產(chǎn)生的肽中沒(méi)有不穩(wěn)定剩余物的復(fù)雜氧化。將酸性基團(tuán)試劑與含半胱氨酸的肽的N端偶聯(lián)，然后氧化半胱氨酸的半胱巰基，是一種產(chǎn)生含有兩個(gè)酸性基團(tuán)(磺酸)的多肽的方法。
酸性基團(tuán)最優(yōu)選是磺酸。在這些中間，更優(yōu)選的酸性基團(tuán)包括2-磺基乙酰基、3-磺基丙基和2-磺基苯甲?；?。
還優(yōu)選使用二磺酸衍生物。使用二磺酸衍生物優(yōu)選在靠近肽N-末端產(chǎn)生兩個(gè)磺酸基團(tuán)。例如將一酸性基團(tuán)試劑與含半胱氨酸的肽的N端偶聯(lián)，然后將半胱氨酸巰基氧化成磺基丙氨酸，是一種產(chǎn)生含有兩個(gè)酸性基團(tuán)(磺酸)的肽的方法。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員有能力進(jìn)行本發(fā)明所需的較簡(jiǎn)單的偶聯(lián)方法。然而為了方便，如下說(shuō)明了衍生感興趣多肽或該多肽產(chǎn)生的肽的非限制性例子實(shí)施例1 在使用之前，制備了濃度為0.1M的2-磺基苯甲酸環(huán)酐(從Aldrich ChemicalCo.，Milwaukee，WI購(gòu)得)的無(wú)水四氫呋喃溶液。將多肽ASHLGLAR(1nmol，購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)(SEQ ID NO1)稀釋于20微升0.05M的三甲胺。加入2-磺苯甲酸環(huán)酐溶液(2微升)，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)混合物30秒。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約2分鐘，然后稀釋得到的衍生分析物并作質(zhì)譜分析。當(dāng)衍生更小的數(shù)量時(shí)，該酸性基團(tuán)試劑的濃度降低100倍。
實(shí)施例2 將ASHLGLAR(1nmol，從Sigma Chemical Co.，St.Louis MO購(gòu)得)(SEQ IDNO1)與2微升0.02M的磺基乙酸混合，后者是通過(guò)將2微升純氯化磺?；阴Ｂ?購(gòu)自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)和500微升水混合形成的。干燥該混合物，然后在20微升四氫呋喃∶二異丙基乙基胺(4∶1，v∶v)中重建。加入0.1M氯化磺基乙酰氯(2微升，購(gòu)自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)的無(wú)水四氫呋喃溶液，旋轉(zhuǎn)振蕩混合物30秒。衍生反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行約2分鐘。干燥衍生的分析物，重建于20微升水中，并進(jìn)一步稀釋?zhuān)缓笞髻|(zhì)譜分析。氯磺基乙酰氯也是一種衍生2D凝膠分離物的有用試劑，但修改的合成程序提供了更一致的產(chǎn)物產(chǎn)率。實(shí)施例14討論了該修改的程序。
實(shí)施例3 制備了0.1M的S-乙酰基巰基琥珀酸酐(從Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI商品購(gòu)得)的無(wú)水四氫呋喃溶液，然后使用。將ASHLGLAR(1nmol，購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)(SEQ ID NO1)稀釋于20微升0.05M的三甲胺中。加入S-乙酰基巰基琥珀酸酐溶液(5微升)，旋轉(zhuǎn)振蕩反應(yīng)混合物30秒。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約2分鐘，然后用10微升19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)氧化。氧化在室溫下進(jìn)行16小時(shí)，干燥樣品，然后稀釋并作質(zhì)譜分析。當(dāng)衍生更小的數(shù)量時(shí)，該酸性基團(tuán)試劑的濃度降低100倍。
實(shí)施例4 在ASHLGLAR(1nmol，購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)(SEQ ID NO1)的0.1M三甲胺(20微升)溶液中加入2-亞氨基硫烷(Traut’s試劑，購(gòu)自AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI)(3微升，0.1M溶于去離子水)。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約5分鐘。用3微升19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)氧化產(chǎn)物。氧化在室溫下進(jìn)行5分鐘，干燥衍生的分析物，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
實(shí)施例5 通過(guò)混合1-5nM的多肽(于5-20微升水)于10微升19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)，氧化該多肽CDPGYIGSER(購(gòu)自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)(SEQ ID NO2)。氧化在室溫下進(jìn)行30分鐘，干燥衍生的分析物，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
實(shí)施例6 將二硫二(磺基琥珀酰亞酰氨丙酸酯，DTSSP)(購(gòu)自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)以50nM/20微升溶于磷酸緩沖液中，用1N NaOH調(diào)節(jié)pH到7.7。將1微升的肽HLGLAR(以1nM/微升)(SEQ ID NO3)加到該溶液(20微升)中，使之反應(yīng)30分鐘。用三羥甲基氨基甲烷(0.1M，20微升)淬滅反應(yīng)。除去樣品中的鹽分，用10微升19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)氧化。氧化在室溫下進(jìn)行30分鐘，干燥衍生的分析物，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。
實(shí)施例7 將二硫二乙醇酸(0.93克，5.1mmol，購(gòu)自Sigma Chemical Co.St.LouisMO)(另外，可用其酸酐(環(huán)狀或非環(huán)狀)的聚合物)溶于二氯甲烷(20ml)中并置于惰性氣氛下。在一部分中加入二環(huán)己基碳二亞胺(1.05克，5.1mmol)。96小時(shí)后，過(guò)濾出去沉淀，真空濃縮濾液。將得到的物質(zhì)溶于乙醚并過(guò)濾。再次真空濃縮濾液，得到二硫二乙醇酸酐。
在使用前，制備了濃度為0.1M的二硫二乙醇酸酐(該實(shí)施例中顯示為環(huán)狀形式)的無(wú)水四氫呋喃溶液。將ASHLGLAR(1nmol)(SEQ ID NO1)稀釋于20微升0.05M的三甲胺中。加入二硫二乙醇酸酐溶液(5微升)，旋轉(zhuǎn)振蕩反應(yīng)產(chǎn)物30秒。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約2分鐘。用2微升比率為19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)氧化所得到的產(chǎn)物。氧化過(guò)程在室溫下進(jìn)行30分鐘，干燥衍生的分析物，然后作質(zhì)譜分析。當(dāng)衍生更小的數(shù)量時(shí)，該酸性基團(tuán)試劑的濃度降低100倍。
實(shí)施例8 在使用之前，制備了濃度為0.1M的3-磺基丙酸酐的無(wú)水四氫呋喃溶液。將ASHLGLAR(1nmol)(SEQ ID NO1)稀釋于20微升四氫呋喃∶二異丙基乙基胺4∶1(v∶v)中。加入3-磺基丙酸酐溶液(2微升)，旋轉(zhuǎn)振蕩反應(yīng)混合物30秒。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約2分鐘，然后稀釋并進(jìn)行質(zhì)譜分析。當(dāng)衍生更小的數(shù)量時(shí)，該酸性基團(tuán)試劑的濃度降低100倍。
實(shí)施例9 在使用之前，制備了濃度為0.1M的四氟琥珀酸酐的無(wú)水四氫呋喃溶液。將ASHLGLAR(1nmol)(SEQ ID NO1)稀釋于20微升0.05M的三甲胺中。加入四氟琥珀酸酐溶液(2微升)，旋轉(zhuǎn)振蕩反應(yīng)混合物30秒。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行約2分鐘，然后稀釋并進(jìn)行質(zhì)譜分析。當(dāng)衍生更小的數(shù)量時(shí)，該酸性基團(tuán)試劑的濃度降低100倍。
實(shí)施例10 將多肽CDPGYIGSR(購(gòu)自Sigma Chemical Company，St.Louis，MO)(SEQ IDNO2)與2微升0.02M的磺基乙酸(將2微升純氯化磺?；阴Ｂ?商品購(gòu)自Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)和500微升水混合形成)混合。干燥混合物，在20微升四氫呋喃∶二異丙基乙基胺(4∶1v/v)中重建。加入0.1M氯化磺?；阴Ｂ?2微升)的無(wú)水四氫呋喃溶液，旋轉(zhuǎn)反應(yīng)混合物30秒。衍生反應(yīng)在環(huán)境溫度下進(jìn)行約2分鐘。干燥衍生的分析物，在10微升水中重建。在該溶液中加入10微升19∶1的甲酸(88％)H2O2(30％)。氧化在室溫下進(jìn)行5分鐘，產(chǎn)生在N-末端附近具有兩個(gè)磺酸基團(tuán)的衍生肽。
用質(zhì)譜分析技術(shù)分析衍生后，用質(zhì)譜技術(shù)分析多肽或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽。雖然所用的技術(shù)不受限制，但優(yōu)選的技術(shù)是源后衰變(PSD)基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)和電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜分析。見(jiàn)例如Spengler等，“通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜分析進(jìn)行肽測(cè)序(Peptide Sequncing by Matrix-assistedLaser-desorption Mass Spectrometry)”，Rapid Communication in MassSpectrometry，Vol.6，pp.105-108(1992)；Spengler等，“基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜分析中源后衰變的基本形式(Fundamental Aspects of PostsourceDecay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry)”，Journalof Physical Chemistry，Vol.96，pp.9678-9684(1992)；Kaufman等，“通過(guò)采用基質(zhì)輔助激光解吸離子化在反射飛行時(shí)間中的產(chǎn)物離子分析進(jìn)行線性肽的質(zhì)譜分析測(cè)序(Mass Spectrometry Sequncing of Linear Peptides byProduct-ion Analysis in a Reflection Time-of-flight Mass SpectrometerUsing Matrix-assisted Laser Desorption Ionization)”，RapidCommunication in Mass Spectrometry，Vol.7，pp.902-910(1993)；Kaufmann等“在飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中的肽測(cè)序基質(zhì)輔助激光解吸離子化(MALDI)后源后衰變的評(píng)估(Sequencing of Peptides in a Time-of-flight Mass SpectrometerEvaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted LaserDesorption Ionisation(MALDI))，International Journal of MassSpectrometry and Ion Process，Vol.131，pp.355-385(1994)Kaufmann等，“基質(zhì)輔助激光解吸/離子化-反射飛行時(shí)間質(zhì)譜分析中的源后衰變和遲發(fā)提取(Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted LaserDesorption/Ionisation-Reflection Time-of-flight Mass Spectrometry)”，Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol.10，pp.1199-1208(1996)；和Spengler，“生物分子的基質(zhì)輔助激光解吸/離子化質(zhì)譜分析中的源后衰變分析(Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted LaserDesorption/Ionization Mass Spectrometry of Biomolecules)”，Journal ofMass Spectrometry，Vol.32，pp.1019-1036(1997)；Carr等，“分析生物技術(shù)中質(zhì)譜分析的集合(Integration of Mass Spectrometry in AnalyticalBiotechnology)”，Analytical Chemistry，Vol.68，pp.2802-2824(1991)；YatesIII等，“用MS探索基因組(Mining Genomes With MS)”，AnalyticalChemistry，Vol.68，pp.534A-540A，(1996)；Morris等，“新穎四極/直角加速飛行時(shí)間質(zhì)譜儀上的高靈敏度碰撞激活的分解串聯(lián)質(zhì)譜分析(HighSensitivity Collisionally Activated Decompostion Tandem MassSpectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-flight Mass Spectrometer)”，Rapid Communications in Mass Spectrometry，Vol.10，889-896(1996)。最優(yōu)選的，所用的技術(shù)是正離子模型PSD MALDI和電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜。為了方便起見(jiàn)，下文實(shí)施例11和12說(shuō)明了可用于分析多肽或其產(chǎn)生的肽的質(zhì)譜分析技術(shù)。
如本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，恰當(dāng)衍生的肽或該多肽產(chǎn)生的肽提供了主要特征的y-離子的MSMS譜。如本領(lǐng)域熟知的，y-離子表明離子化片段含有多肽或肽的原來(lái)C-末端。本文所用的術(shù)語(yǔ)“y-離子”也包括(y-NH3)離子；為了說(shuō)明，非完全消化產(chǎn)物含有第二個(gè)堿性(比方說(shuō))殘基，常常產(chǎn)生大量(y-NH3)離子。優(yōu)選該方法產(chǎn)生的譜基本沒(méi)有a-離子和b-離子。a-離子和b-離子是通過(guò)在骨架羰基任何一側(cè)切斷而形成的。重要的是，具有a-離子和b-離子的N-末端片段仍保留了電荷。本文所用的，關(guān)于a-離子和/或b-離子的術(shù)語(yǔ)“基本沒(méi)有”指與占優(yōu)勢(shì)的y-離子系列相比，a-離子系列和b-離子系列的集合性相對(duì)豐度小于約20％，優(yōu)選小于約10％，最優(yōu)選約小于5％。
根據(jù)本發(fā)明的方法，不需要分析和/或鑒定所有消化產(chǎn)物，來(lái)鑒定其多肽，特別是如果多肽的序列存在于序列數(shù)據(jù)庫(kù)中。
實(shí)施例11-PSD MALDI測(cè)序技術(shù)在該實(shí)施例中，在裝備了N2激光器(337nm，3nsec脈沖寬度，20Hz重現(xiàn)率)的Voyager DE-RP或Voyager DE-STR(PerSeptive Biosystems Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)(或合適的等價(jià)物)上進(jìn)行質(zhì)譜分析技術(shù)。在反射模式中用衰變抽提獲得質(zhì)譜。用低質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行外部質(zhì)量標(biāo)定，質(zhì)量測(cè)量的準(zhǔn)確度通常是±0.3Da。將衍生的多肽或其產(chǎn)生的肽稀釋到約10μpM/μL于0.1％三氟乙酸(TFA)溶液中。然后將樣品以a-氰基-4-羥基肉桂酸(αCN，通過(guò)將10mg溶于1mL含0.1％TFA的50％乙腈水溶液中制備)稀釋5-10倍。見(jiàn)例如，Beavis等，“作為基質(zhì)輔助激光解吸離子質(zhì)譜分析的基質(zhì)的α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted LaserDesorption Mass Spectrometry)”，Organic Mass Spectrometry，Vol.27，pp.156-158(1992)。分析了用快速蒸發(fā)方法制備的a-氰基-4-羥基肉桂酸/硝基纖維素(αCN/NC)的薄膜表面上的凝膠分離物，見(jiàn)例如，Arnott等，“一種蛋白庫(kù)分析的集合方法與心臟肥大有關(guān)的蛋白質(zhì)的鑒定(An IntegratedApproach to Proteome AnalysisIdentification of Proteins Associatedwith Cardiac Hypertrophy)”，Analytical Biochemistry，Vol.258，pp.1-18(1998)。
在用定時(shí)離子選擇分離合適的前體離子后，得到供衍生分析物的PSD MALDI串聯(lián)質(zhì)譜?？捎迷S多MALDI基質(zhì)(包括但不限于αCN、αCN/NC和2，5-二羥基苯甲酸(DHB))分析衍生的分析物。通過(guò)逐步改變施加在反射器上的電壓將片段化離子重新聚焦在最終探頭上。通常可用的電壓比如下1.0000(前體離子區(qū)段)、0.9126、0.6049、0.4125、0.2738、0.1975和0.1213(片段化區(qū)段)。用從PerSpetive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA購(gòu)得的軟件合并(或如該領(lǐng)域常用的，“縫合在一起”)這些獨(dú)立的區(qū)段(從分析窗口選擇“PSD”)。在低激光功率(可變阻尼＝1450)＜256激光脈沖下得到所有前體離子區(qū)段，以避免探頭飽和。對(duì)于PSD MALDI收藏的所有剩余的區(qū)段，增大激光器功率(可變阻尼＝1650)。通常對(duì)各片段化離子區(qū)段達(dá)到了256激光脈沖。以20MHz的數(shù)字化率獲得該數(shù)據(jù)。
實(shí)施例12-電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序技術(shù)在該實(shí)施例中，采用了與裝有自建的顯微電噴源(μES)的LCQ離子捕獲質(zhì)譜儀(ThermoQuest，San Jose，CA)連接的毛細(xì)LC系統(tǒng)(Perkin ElmerBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)獲得質(zhì)譜。以5μl/min的流速使用0.5×150mmC18LC柱(Perkin Elmer Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。LC流動(dòng)相是水和乙腈，各含有0.02％的TFA。典型的梯度是15％乙腈5分鐘，然后是15-60％乙腈40分鐘以上。通過(guò)在LC柱后放置一分離三通(1/16″，0.25mm孔徑，Valco，Houston，TX)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)于μES源，流速是0.5μl/min，對(duì)于UV探頭是4.5ul/min。將衍生的肽或多肽樣品用自動(dòng)進(jìn)樣器(ALCOTT，719型，Norcross，GA)注射入LC柱。將μES源放在X，Y，z測(cè)微計(jì)(New Focus，Inc.，Santa Clara，CA)上，固定于該儀器的前端。顯微電噴針是PicoTip(FS360-50-15-D)，來(lái)自NewObjective(Cambridge，MA)。
用下列儀器條件獲得的電噴串聯(lián)質(zhì)譜噴射針電壓1.5kV，加熱的毛細(xì)管溫度200℃，和碰撞能量35eV。在每個(gè)完全-MS掃描中使用300-2000m/z的質(zhì)量范圍。用數(shù)據(jù)依賴性掃描在“三次重演”模式獲得了電噴串聯(lián)質(zhì)譜，它由3種連續(xù)顯微掃描構(gòu)成1)作完全MS掃描，2)在所選離子上作圖像電子放大以確定帶電狀態(tài)，和3)在選自圖像電子放大掃描的合適離子上作MS/MS掃描。通過(guò)LC運(yùn)行重復(fù)這三次掃描活動(dòng)。
翻譯片段化模式翻譯質(zhì)譜分析所產(chǎn)生的片段化模式，從而對(duì)多肽測(cè)序。質(zhì)譜領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能從頭手工翻譯小型多肽的片段化模型，而無(wú)需商品購(gòu)得的軟件或序列數(shù)據(jù)庫(kù)的幫助。類(lèi)似的，技術(shù)人員還能從頭對(duì)該多肽產(chǎn)生的肽(消化產(chǎn)物)進(jìn)行測(cè)序。另外，技術(shù)人員可使用進(jìn)行翻譯的已知輔助工具，例如可商品購(gòu)得的軟件或序列數(shù)據(jù)庫(kù)。
例如，用本發(fā)明產(chǎn)生的y-離子片段化模式能有效并準(zhǔn)確的測(cè)定多肽或其產(chǎn)生的肽的序列。通過(guò)測(cè)量y-離子系列中用毗鄰成員之間的質(zhì)量差異，可從頭完成各氨基酸殘基的鑒定。然后通過(guò)將測(cè)量的質(zhì)量差異與已知的氨基酸殘基質(zhì)量(見(jiàn)上文表I)比較，完成鑒定。例如，測(cè)量的71.1Da的質(zhì)量差異對(duì)應(yīng)于丙氨酸。還可從質(zhì)譜直接建立閱讀方向。如果測(cè)量是從低質(zhì)量到高質(zhì)量，則方向從C-末端到N-末端。如果測(cè)量從高質(zhì)量到低質(zhì)量，閱讀方向則是從N-末端到C-末端。
還可采用接受質(zhì)譜片段化數(shù)據(jù)(未翻譯的y-離子系列質(zhì)量或從y-離子質(zhì)量衍生得到的序列標(biāo)記)作為序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的輸入的軟件，有效而準(zhǔn)確的測(cè)定多肽和其產(chǎn)生的肽的序列。這些技術(shù)人員常使用的檢索軟件包括但不限于“Protein Prospector”(從加州大學(xué)舊金山分校或http//prospector.ucsf.edu購(gòu)得)和“Peptide Search”(從European Molecular Biology Laboratory atHeidelberg，Germany或http//www.mann.embl-heidelberg.de購(gòu)得)。
可針對(duì)許多序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索本發(fā)明產(chǎn)生的片段化模式，包括但不限于NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)(ncbi.nlm.nih.gov/blast/db.nr.z)，SWISPROT(ncbi.nlm.gov/repository/SWISSPROT/sprot33.dat.z)，EMBL(FTP//ftp.ebi.ac.uk/pub/database/peptidesearch)，OWL(ncbi.nlm.nih.gov/repostory/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z)，dbEST(ncbi.nlm.gov/repository/dbEST/dbEST.weekly.fasta.mmddyy.z)和Genebank(ncbi.nlm.nih.gov/genebank/genpept.fsa.z)。通?？蓮男蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)檢索一個(gè)或多個(gè)用本發(fā)明的方法形成的相關(guān)肽衍生物產(chǎn)生的片段化數(shù)據(jù)，重新獲得感興趣多肽的完整序列。
當(dāng)然，當(dāng)使用數(shù)據(jù)庫(kù)檢索技術(shù)時(shí)，最有效的是通過(guò)限定僅檢索y-離子或(y-NH3)離子能被片段化，來(lái)限制檢索，因?yàn)閥-和(y-NH3)離子是在采用本發(fā)明方法的片段化模式中觀察到的最主要種類(lèi)。其他片段化離子類(lèi)型，如a-、b-、(b+H2O)、(b-H2O)、(b-NH3)和內(nèi)部切割離子可被剔除，因?yàn)樗鼈冊(cè)谟帽景l(fā)明方法衍生的肽譜圖中不占優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明形成的衍生物提供了簡(jiǎn)單的片段化模式，常常產(chǎn)生比用相同肽不經(jīng)衍生的質(zhì)譜獲得的更大的檢索特異性。
在下面的非限制性實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的方法。在這些實(shí)施例中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到產(chǎn)生的“候選蛋白”數(shù)目可以和本文公開(kāi)的不同，因?yàn)樵跀?shù)據(jù)庫(kù)中一直在加入新的蛋白質(zhì)。
實(shí)施例13用氧化的胰島素B-鏈FVNQHLC(SO3H)GERGFFYTPKA(SEQ ID NO4)演示了高質(zhì)量多肽的PSD MALDI串聯(lián)質(zhì)譜(MM計(jì)算值＝3495.9Da)(從Sigma Chmical Co.，St.Louis，MO購(gòu)得)。該多肽的質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了大部分常規(guī)三重四極儀器的上限。天然多肽的串聯(lián)質(zhì)譜顯示基本由y-離子構(gòu)成的較強(qiáng)的離子系列。不難觀察到所有在y9和y24之間的y-離子。明確該分子的N-末端的序列特異性片段y25至y29在譜圖中不存在。
用酸性基團(tuán)試劑磺基苯甲酸環(huán)酸酐(購(gòu)自Aldrich Chemical Co.，St.Louis，MO)衍生，改善該多肽的譜圖。衍生的多肽顯示從該分子N-末端區(qū)衍生的y-離子顯著增強(qiáng)(y25、y26、y27、y28和y29)。衍生后，觀察到了從y8至y29的完整的y-離子系列。未檢測(cè)到占優(yōu)勢(shì)的b-離子。
實(shí)施例14用胰蛋白酶在凝膠內(nèi)消化以二維凝膠電泳分離的一個(gè)多肽。通過(guò)MALDI，該肽顯示了幾個(gè)強(qiáng)MH+信號(hào)，包括m/z1060.8、1090.8、1271.0、1299.0、1312.0、1344.0、1399.1、1450.1、1460.1和1794.4處的離子。用Protein Prospector軟件對(duì)NCBI蛋白質(zhì)序列文庫(kù)中的記載進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到一張41個(gè)候選蛋白的表，匹配5個(gè)或以上輸入的胰蛋白酶消化肽的質(zhì)量(檢索參數(shù)MW范圍1,000-150,000，等電點(diǎn)3.0-10.0，作為副反應(yīng)，得到氧化的Met，保守性質(zhì)量容許誤差+/-0.6Da)。
可用前述實(shí)施例中討論的數(shù)種試劑之一衍生該多肽產(chǎn)生的肽。它們包括但不限于2-磺基苯甲酸環(huán)酸酐、3-磺基丙酸酐或氯磺?；阴０薄Ｔ谠搶?shí)施例中，用氯磺酰基乙酰氯作為酸性基團(tuán)試劑。修飾從2D凝膠電泳分離的低水平肽的衍生程序，以改進(jìn)再現(xiàn)性和衍生物產(chǎn)率。通常將2D凝膠的肽抽提物在加速真空泵上濃縮至近乎干燥(5-10微升)。用15微升0.1％的TFA酸化濃縮物，并用商品購(gòu)得的C18小柱(ZipTipTM，MilliporeCorporation，Bedford，MA01730)純化。純化的樣品在加速真空泵上干燥，并重建于10微升堿(THF∶DIEA 19∶1v/v)中。在該實(shí)施例中，加入2微升氯磺?；阴Ｂ热芤?2微升純液體于1毫升THF中)，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行1-2分鐘。再次在加速真空泵上干燥衍生樣品，并重建于10微升0.1％TFA中，然后分析。在該階段，可將樣品與MALDI基質(zhì)混合，并將一部分加到樣品平臺(tái)上，用于分析，或再用商品購(gòu)得的C18小柱(ZipTipTM，MilliporeCorporation，Bedford，MA01730)純化。然后從ZipTip上直接洗脫出純化的樣品，加到MALDI樣品平臺(tái)上，體積為含有10mg/mlMALDI基質(zhì)的1-2微升的乙腈∶0.1％TFA(1∶1 v/v)。該程序能將所有回收的衍生物加到MALDI樣品平臺(tái)上用于分析，從而改進(jìn)該方法的整體靈敏度。對(duì)衍生的重量約1572Da的肽進(jìn)行了PSD MALDI串聯(lián)質(zhì)譜分析。獲得的序列標(biāo)記具有m/z574.5、661.7、875.9、1003.8、1103.9、1204.6、1304.1的y-離子和m/z1451.0的MH+衍生物離子。)對(duì)蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索該質(zhì)譜，返回了6個(gè)候選蛋白(所有線粒體天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)(檢索參數(shù)MW范圍1,000-150,000，親代離子質(zhì)量容許誤差+/-0.6Da，片段化離子質(zhì)量容許誤差+/-2.5Da，Par(mi)Frag(av)，允許丟失的離子數(shù)目＝1)。獲得該水平的特異性是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)檢索被約束于將y-離子看作唯一的允許片段。這種檢索約束是可能的，因?yàn)樵谶@些衍生物的串聯(lián)質(zhì)譜中，N-末端和內(nèi)部切割離子不占優(yōu)勢(shì)(因?yàn)榘凑毡景l(fā)明衍生)。當(dāng)對(duì)整個(gè)文庫(kù)檢索這相同的串聯(lián)質(zhì)譜時(shí)，獲得了小得多的特異性(返回了239個(gè)候選蛋白)，并獲得了所有片段離子類(lèi)型(a、b、(b+H2O)、(b-NH3)、(b-H2O)、內(nèi)部和y)。該肽被鑒定為FVTVQTISGTGALR(SEQ ID NO5)。
PSD MALDI查找證實(shí)了該蛋白質(zhì)的身份，衍生物重量約1916Da。圖譜除了質(zhì)子化的前體離子外，含有7個(gè)m/z為724.6、1154.2、1299.3、1439.0、1551.9、1665.5和1779.2的片段。假定片段是y-離子，就該質(zhì)譜檢索了數(shù)據(jù)庫(kù)。該檢索沒(méi)有返回線粒體天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶或任何其他候選蛋白質(zhì)。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)使y和(y-NH3)離子都返回了16個(gè)候選蛋白質(zhì)，其中10個(gè)是線粒體天冬酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶。該后一項(xiàng)檢索證實(shí)了該蛋白質(zhì)的身份。這種特別檢索要求包括(y-NH3)離子作為可能片段是因?yàn)樵撾氖且环N不完全的胰蛋白酶消化產(chǎn)物(ILIRPLYSNPPLNGAR)(SEQ ID NO6)，它含有第二個(gè)精氨酸殘基。如本文上述，衍生的不完全消化產(chǎn)物常常在PSD串聯(lián)質(zhì)譜中顯示(y-NH3)片段離子。
實(shí)施例15用LC電噴串聯(lián)質(zhì)譜在LCQ離子捕獲裝置上，在如本文的實(shí)施例14那樣衍生后分析從2D凝膠電泳分離的其蛋白質(zhì)的凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化物。可用“三次運(yùn)行”順序的顯微掃描以自動(dòng)化數(shù)據(jù)依賴性模式，無(wú)須照管而獲得所有質(zhì)譜。一衍生的胰蛋白酶消化肽(MH+＝971.5)的串聯(lián)質(zhì)量譜顯示了幾種y-型產(chǎn)物離子，包括m/z401.1、538.3、651.3、750.4。將測(cè)量得到的y-離子作為輸入，與未衍生的胰蛋白酶消化肽(971.5-122＝849.5)的MH+質(zhì)量一起用于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索。用Protein Prospector軟件對(duì)NCBI蛋白質(zhì)序列文庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，返回3個(gè)候選蛋白質(zhì)(檢索參數(shù)MW范圍全部，親代離子容許誤差+/-0.6Da；片段離子容許誤差+/-1.0Da，單一同位素型親代和片段離子，不允許丟失的離子)。從數(shù)據(jù)庫(kù)檢索返回的全部三個(gè)候選蛋白是觸珠蛋白。該肽被鑒定為VVLHPER(SEQ ID NO7)。
采用第二條衍生肽(衍生物的MH+＝771.4Da)產(chǎn)生的串聯(lián)質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了對(duì)該蛋白質(zhì)身份的肯定。質(zhì)譜顯示有幾個(gè)離子，包括m/z322.1、436.2和535.3處的y-型離子。使用上述相同檢索參數(shù)，三條肽序列和電噴串聯(lián)質(zhì)譜的輸入數(shù)據(jù)相符。三條肽序列之一與觸珠蛋白相對(duì)應(yīng)。該肽被鑒定為NVNFR(SEQ ID NO8)。該結(jié)果證實(shí)了該蛋白質(zhì)的身份。
實(shí)施例16本發(fā)明的方法不難用于鑒定各種多肽。酶分離物的胰蛋白酶消化物的MALDI質(zhì)譜顯示許多與商品蛋白酶Savinase(商品購(gòu)自Novo Nordisk，Copenhagen，Denmark)的胰蛋白酶解肽質(zhì)量相同的質(zhì)量。在質(zhì)譜中沒(méi)有預(yù)期的胰蛋白酶解肽GVLVVAASGNSGASISYPAR(MH+＝1933Da)(SEQ ID NO9)，并在m/z1963處觀察到未知的離子。這提示分離物是Savinase變異型。11個(gè)不同的單氨基酸改變可解釋觀察到的+30Da的質(zhì)量漂移(4G→S，4A→T，和3V→E)。如本文實(shí)施例2那樣衍生后，獲得了PSD MALDI串聯(lián)質(zhì)譜。對(duì)于21個(gè)氨基酸的肽，觀察到了完整的y-離子系列。該質(zhì)譜證實(shí)14位殘基甘氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻z氨酸。測(cè)量了該質(zhì)譜中所有y-離子的質(zhì)量。用包括在PerSeptive BiosystemsMALDI數(shù)據(jù)系統(tǒng)中的肽序列梯測(cè)序程序自動(dòng)翻譯了該質(zhì)譜。
實(shí)施例17通過(guò)比較按照實(shí)施例5和實(shí)施例10衍生的CDPGYIGSR(SEQ ID NO2)產(chǎn)生的MALDI PSD圖譜，證明了含有兩個(gè)磺酸基團(tuán)都靠近該肽N-末端的二磺酸衍生物的用途。用PSD MALDI從α-氰基-4-羥基肉桂酸的基質(zhì)分析半胱氨酸殘基(實(shí)施例5)的巰基過(guò)甲酸氧化形成的衍生物。得到的PSD譜主要是y7片段離子，它是通過(guò)切割不穩(wěn)定的Asp-Pro酰胺鍵形成的。質(zhì)量較小的y-型離子顯示較低的豐度。例如，y3和y4離子的豐度相對(duì)于y7離子僅分別為8％和5％(峰高比)。不希望受理論所限制，相信“運(yùn)動(dòng)”離子化質(zhì)子優(yōu)先位于堿性Asp-Pro酰胺氮原子上，因?yàn)镻ro酰胺氮比其他骨架酰胺基團(tuán)更具堿性。認(rèn)為這種電荷定位優(yōu)先使Asp和質(zhì)子化Pro之間的酰胺鍵片段化。按照實(shí)施例10，在該肽的N-末端附近加入第二個(gè)磺酸基團(tuán)，使該問(wèn)題最小化。加入第二個(gè)磺酸基團(tuán)需要加入第二個(gè)“運(yùn)動(dòng)”質(zhì)子，來(lái)產(chǎn)生用于MALDI PSD分析的帶正電離子。另外，不受理論限制，相信這第二個(gè)質(zhì)子能自由的離子化其他骨架酰胺基團(tuán)，因?yàn)檩^堿性的Pro基團(tuán)已被離子化了。其他骨架酰胺基團(tuán)的質(zhì)子化導(dǎo)致那些基團(tuán)的片段化增強(qiáng)，并增大了相應(yīng)的y-離子在MALDI PSD質(zhì)譜中的豐度。按照實(shí)施例10形成的衍生物的PSD質(zhì)譜中，y3和y4離子的豐度相對(duì)于y7離子，分別增加到約41％和57％(峰高比)。
本發(fā)明的試劑盒本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是可用于測(cè)定多肽的氨基酸序列的試劑盒。該試劑盒包括(a)一種或多種酸性基團(tuán)試劑，當(dāng)與多肽或該多肽產(chǎn)生的一種或多種肽偶聯(lián)時(shí)，提供了pKa小于約2的酸性基團(tuán)；和(b)用一種或多種酸性基團(tuán)試劑衍生該多肽的N-末端或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽的N-末端的方法。
本發(fā)明的試劑盒適合質(zhì)譜分析儀，其樣式類(lèi)似于Patterson(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,827,659，授予PerSeptive Biosystems，Inc，1998年10月27日發(fā)布)描述的樣品容器。
可任選的，該試劑盒還可包括要測(cè)試質(zhì)譜分析技術(shù)準(zhǔn)確性的一條或多條驗(yàn)證肽。還可任選的包括參考的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
上文描述了可包含在試劑盒中的酸性基團(tuán)試劑。
尤其優(yōu)選的衍生設(shè)備包括那些能使分析人員或其他對(duì)獲得衍生的多肽或肽感興趣的人員能方便使用的衍生設(shè)備。特別優(yōu)選的衍生設(shè)備包括一種或多種容器裝置，含有例如酸性基團(tuán)試劑和最終的感興趣的多肽/肽。
合適的容器裝置包括例如小管、試管、移液器頭(pipette tip)、板、樣品容器和多孔板。提供了可任選的方便，如在容器裝置中存在酸性基團(tuán)試劑，因而它不需要由分析人員加入。例如，酸性基團(tuán)試劑可存在于移液器頭的內(nèi)部，并隨著用合適的緩沖液將多肽或肽推入移液器頭時(shí)被激活。密封裝置最優(yōu)選一次性的，但不必需。
酸性基團(tuán)試劑還可與一固相載體結(jié)合。例如，試劑在移液器頭內(nèi)可以與載體結(jié)合。可將感興趣的多肽和肽溶于合適的緩沖系統(tǒng)中，并可反復(fù)吸取該結(jié)合試劑。反應(yīng)后，可將合適量的衍生多肽或肽直接加到MALDI質(zhì)譜的樣品階段，或注射入電噴離子化質(zhì)譜裝置中。
可在本發(fā)明的試劑盒中包括用于促進(jìn)衍生的一種或多種緩沖液系統(tǒng)。適合包含的緩沖系統(tǒng)取決于所含酸性基團(tuán)試劑。在上文的衍生實(shí)施例中公開(kāi)了優(yōu)選的緩沖系統(tǒng)的例子。具體的優(yōu)選緩沖系統(tǒng)包括但不限于叔胺溶液(水或非水溶液(例如溶于四氫呋喃))和純叔胺。特別優(yōu)選的叔胺包括三甲基胺、三乙基胺和二異丙基乙基胺。
本發(fā)明試劑盒還可包含一種或多種消化輔助劑，如本文上述的那些。消化輔助劑可以是化學(xué)性或酶性的。作為消化輔助劑，可包含例如胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Lys C、內(nèi)切蛋白酶Arg C、和/或胰凝乳蛋白酶，優(yōu)選胰蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Lys C、內(nèi)切蛋白酶Arg C，最優(yōu)選胰蛋白酶。也可在其中含有化學(xué)消化輔助劑，如氰化溴。
序列表<110>Keough，Thomas W.
Youngquist，Robert S.<120>多肽測(cè)序的方法和試劑盒<130>測(cè)序多肽的方法/試劑盒<140>7379P2<141>1999-09-29<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>8<212>PRT<213>合成構(gòu)建物<400>1Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>合成構(gòu)建物<400>2Cys Asp Pro Gly Tyr Ile Gly Ser Arg1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>合成構(gòu)建物<400>3His Leu Gly Leu Ala Arg1 5<210>4<211>30<2 12>PRT<213>牛胰島素<400>4Phe Val Ash Gln His Leu Xaa Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Xaa Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala20 25 30<210>5<211>14<212>PRT<213>前脂肪細(xì)胞<400>5Phe Val Thr Val Gln Thr Ile Ser Gly Thr Gly Ala Leu Arg1 5 10<210>6<211>16<212>PRT<213>前脂肪細(xì)胞<400>6Ile Leu Ile Arg Pro Leu Tyr Ser Asn Pro Pro Leu Asn Gly Ala Arg1 5 10 15<210>7<211>7<212>PRT<213>大鼠淋巴<400>7Val Val Leu His Pro Glu Arg1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>大鼠淋巴<400>8Asn Val Asn Phe Arg1 5<210>9<211>21<212>PRT<213>未知<400>9Gly Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile1 5 10 15Ser Tyr Pro Ala Arg20
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定多肽的氨基酸序列的方法，其特征在于，該方法包括(a)用一種或多種當(dāng)與多肽或肽偶聯(lián)時(shí)，pKa小于約2，優(yōu)選小于0，更優(yōu)選小于-2的酸性基團(tuán)試劑衍生該多肽的N-末端或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽的N-末端，以提供一種或多種衍生分析物；(b)用質(zhì)譜分析技術(shù)分析一種或多種衍生的分析物，以提供一種片段化模式，優(yōu)選該片段化模式基本上沒(méi)有a-離子和b-離子；和(c)翻譯該片段化模式。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜分析技術(shù)是MALDI PSD質(zhì)譜，優(yōu)選陽(yáng)離子模式PSD MALDI；或電噴離子化串聯(lián)質(zhì)譜，優(yōu)選串聯(lián)電噴離子化質(zhì)譜。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，片段化模式的翻譯包括使用可商品購(gòu)得的軟件程序或數(shù)據(jù)庫(kù)。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述多肽是一種合成的多肽。
5.如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述多肽產(chǎn)生的肽是通過(guò)消化產(chǎn)生的，優(yōu)選消化是化學(xué)消化，更優(yōu)選化學(xué)消化是氰化溴消化。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述消化是酶消化，優(yōu)選酶消化選自內(nèi)切蛋白酶Lys C消化、內(nèi)切蛋白酶Arg C消化，胰蛋白酶消化和胰凝乳蛋白酶消化。
7.如權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述酸性基團(tuán)是一個(gè)或多個(gè)磺酸或二磺酸衍生物，優(yōu)選酸性基團(tuán)是2-磺基乙酰基，3-磺基丙酰基、或2-磺基苯甲酰基。
8.一種用于測(cè)定多肽的氨基酸序列的試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有(a)一種或多種酸性基團(tuán)試劑，當(dāng)與多肽或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽偶聯(lián)時(shí)，該試劑提供pKa小于2的一種或多種酸性基團(tuán)；和(b)用一種或多種酸性基團(tuán)試劑衍生該多肽的N-末端或該多肽產(chǎn)生的一條或多條肽低得多N-末端的設(shè)備。
9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，用于衍生的設(shè)備含有一個(gè)或多個(gè)容器裝置，優(yōu)選所述酸性基團(tuán)試劑位于該容器裝置內(nèi)；優(yōu)選衍生設(shè)備還含有緩沖系統(tǒng)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有一種或多種消化輔助劑。
全文摘要
本公開(kāi)提供了用于多肽測(cè)序的方法和試劑盒。該方法涉及多肽或其產(chǎn)生的肽的N－末端的衍生化。一種或多種產(chǎn)生的衍生分析物的質(zhì)譜分析提供了本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能用所熟知的技術(shù)進(jìn)行翻譯的質(zhì)譜。本文還公開(kāi)還描述了能提高該增強(qiáng)方法方便實(shí)施的試劑盒。
文檔編號(hào)G01N27/62GK1340162SQ00802949
公開(kāi)日2002年3月13日 申請(qǐng)日期2000年1月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月20日
發(fā)明者T·W·基奧, R·S·楊古斯特 申請(qǐng)人:寶潔公司