空間轉(zhuǎn)錄組建庫測序方法及所用裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域,尤其是一種利用芯片探針獲取組織細胞空 間位置信息的空間轉(zhuǎn)錄組建庫測序技術(shù)。該技術(shù)可以根據(jù)細胞的位置,類別以及狀態(tài)信息 對細胞進行準確的、可重復(fù)的標記和分類,可以在保留細胞組織中的位置分布的從自然組 織微環(huán)境下的活細胞中分離出RNA,通過高通量測序和生物信息分析等流程,一次性定量獲 得不同空間位置組織細胞的完整的表達譜。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集 合。轉(zhuǎn)錄組測序即對特定細胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA進行測序。通過 新一代高通量測序,轉(zhuǎn)錄組測序能夠全面快速地獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態(tài) 下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息,已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領(lǐng)域。細胞 是生命活動的基本功能單位,而在生物體內(nèi)沒有任何兩個細胞是完全相同的。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄 組研究,絕大多數(shù)情況下都是針對混合的大量細胞進行的,無法觀察到單個細胞之間細微 的差別,掩蓋了獨立個體樣本的行為以及生命現(xiàn)象中特異性和細胞差異性。而針對單個細 胞的研究,是細胞生命分析技術(shù)所追求的極限狀態(tài),是對傳統(tǒng)技術(shù)發(fā)展的終極挑戰(zhàn)。目前我 們正在步入一個單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)時代,該研究方向會對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)生深刻的影響。然 而單細胞基因組及轉(zhuǎn)錄組測序所需要的測序樣本量要比單細胞中本身所含有的基因組及 轉(zhuǎn)錄組分子高出好多個數(shù)量級,所以這對核酸擴增技術(shù)(amplification technology)也是 一大考驗。而且目前采用的單細胞測序技術(shù)中,絕大多數(shù)方法都需要特定的前處理過程,制 備"測序文庫"。面對如此微量的分子,任何降解、樣品損失、或者污染都會對測序質(zhì)量帶來 非常嚴重的影響。而且多重擴增又容易帶來試驗誤差,比如基因組或轉(zhuǎn)錄組覆蓋不均一、操 作失誤率高、重復(fù)性差、背景噪聲以及定量不準確等問題均造成單細胞測序難以廣泛應(yīng)用 和推廣。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種基于組織和芯片空間位置信息的、操作簡 便、成本相對較低、特異性強、分辨率高、便于檢測特定組織特定細胞基因轉(zhuǎn)錄表達信息的 空間轉(zhuǎn)錄組建庫測序技術(shù)。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明提供一種基于組織和芯片空間位置信息的空間轉(zhuǎn) 錄組測序技術(shù)裝置:包括蓋玻片和硅基寡核苷酸芯片,在硅基寡核苷酸芯片上設(shè)有錨定探 針;
[0005] 所述蓋玻片位于硅基寡核苷酸芯片的上方,蓋玻片的面積大于(略大于即可)硅基 寡核苷酸芯片的面積;在蓋玻片和娃基寡核苷酸芯片之間用于放置厚度為10~50um(例如 為45~55μπι,β卩,厚度為50μπι左右)的組織冷凍切片,所述組織冷凍切片的面積小于蓋玻片 的面積;且組織冷凍切片的面積 <(即,略小于或等于)硅基寡核苷酸芯片上所有探針覆蓋 的面積。
[0006] 作為本發(fā)明的基于組織和芯片空間位置信息的空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)裝置的改進: 所述硅基寡核苷酸芯片的錨定探針為5 ' -GGNNNNNNNCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC ACC〇
[0007] 本發(fā)明還同時提供利用上述任意一種裝置進行的空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)方法,包括 以下步驟:
[0008] 1)、首先加入第一段引物(20nmol),第一段引物的序列為5'-GTGACTGGAGTTCAGACG TGTGCTCTTCCGATCT,退火溫度為 75 度/70 度;
[0009] 然后再加入第二段引物(約2ug的總量),0·lμMPolyd(T)Primer5'PH0-GNNNNNNNCCT (13-18) VN,退火溫度從70 降到 15度;
[0010] 再加入T4連接酶(2ul),用于連接第一段和第二段引物,維持溫度15度,反應(yīng)(快速 反應(yīng))20min,反應(yīng)完成后吸走多余液體;
[0011] 2)、將組織切片放置于蓋玻片表面(加有位置標記的蓋玻片表面),組織切片的厚 度為10~50um(原則以小于或約等于細胞厚度為準),大小不超過1.5 X 1.5cm;將樣品朝上 的蓋玻片放置于顯微鏡下觀察組織細胞的位置,并拍照用于后續(xù)定位;
[0012] 完成拍照后,在芯片表面加入裂解液(10ul),從而使裂解液鋪滿探針芯片探針表 面;將蓋玻片覆蓋在芯片上,組織樣品向下直接與芯片探針接觸;
[0013] 蓋玻片大小與芯片探針部分的大小對應(yīng),用于對應(yīng)定位組織的部位;
[0014] 對芯片進行如下孵育,75°C3min65°C_0· l°C/s_(37~45)°C取出;
[0015] 注意,75°C---3min打開Total RNA的二級結(jié)構(gòu),準備和引物結(jié)合;0. l°C/s退火使 引物與模版結(jié)合更加準確;根據(jù)結(jié)合區(qū)域長度設(shè)定一般為40°C,長度改變需調(diào)整,當(dāng)〇1 igoT 數(shù)目在13-18個之間變化時,最終溫度范圍在37-40°C變化,OligoT增多時提高溫度(例如至 45°〇;
[0016] 取走蓋玻片以及覆蓋在芯片表面的組織樣品,并吸走所有液體,使用RNase free 水輕柔洗滌一次;
[0017] 3)、在上述步驟2)完成后,在芯片上完成第一鏈反轉(zhuǎn)錄,然后消化RNA;
[0018] BP,消化lul RNase A(10mg/ml)(分解游離的RNA);
[0019] 具體如下:降解剩余的RNA,然后95°C孵化10min,吸取所有液體,轉(zhuǎn)移到離心管。芯 片使用RNase free水洗滌2次,并烘干可以重復(fù)使用。在PCR管里進行的反應(yīng):加入0.5ul酶 RNase Η(6〇υ/μ1)(分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈),37°C反應(yīng)5min;
[0020] 備注:先RNase A消化游離的單鏈RNA,同時95°C高溫使雜交RNA解鏈,并且熱打斷 RNA;然后RNase Η將退火結(jié)合回反轉(zhuǎn)錄第一鏈的小片段RNA降解;
[0021] 4)、在上述3)步驟結(jié)束后的消化體系里,進行第二鏈引物的結(jié)合;
[0022] 即,加入ΙμΜ Second Primer和ΙμΜ Second REV Primer從98°C---lmin---80°C- 0.2°C/s-25°C30min,采用梯度孵化的方式結(jié)合反應(yīng);
[0023] 5)、將上述步驟4)孵化后的反應(yīng)液里,接著進行第二鏈條延伸反應(yīng);
[0024] 8。,分別加入9.5以1(1(1!12〇,44110\陬811打6『,2411〇111]\1(1階?和2411(1611〇¥(3'-5'exo-),在預(yù)先設(shè)置成25°CPCR儀中延伸(PCR儀背景溫度設(shè)為<25°C,溫度太高會使第五步 結(jié)合的引物脫落);
[0025] 6)、將上述步驟5)反應(yīng)完后,對產(chǎn)物進行磁珠純化(先配制80 %無水乙醇,總體積 = 0.4*(n+l)ml,n =樣品數(shù));
[0026] 具體步驟可如下:
[0027] 1.加水補齊至 80μ1,加入 80μ1 BECKBeads(lx);
[0028] 2.充分混勻后(吸打至少10次),靜置5min;
[0029] 3.稍離心,至于磁珠板上;
[0030] 4.靜置5min或看到液體澄清,緩慢吸取155μ1上清,丟棄;
[0031 ] 5.加入200μ1現(xiàn)配的80%無水乙醇,靜置30s;
[0032] 6.緩慢吸打2次后,吸取198μ1上清,丟棄;
[0033] 7 ·加入200μ1現(xiàn)配的80%無水乙醇,靜置30s;
[0034] 8.緩慢吸打2次后,吸取198μ1上清,丟棄;
[0035] 9.換10μ1槍吸去剩余酒精,干燥;
[0036](注意:步驟4-9,管子都要放在磁力架上)
[0037] 10.在磁珠出現(xiàn)裂紋后,將上述8管磁珠用26μ1 ddH20混合在一起,充分吸打混勻 后(吸打至少10次);
[0038](備注:磁珠干燥太久會影響DNA得率);
[0039] 11.靜置2min,稍離心,置于磁力架上2min,吸取全部上清至新的管中;
[0040] 12.新管再置于磁力架上5min,緩慢吸取23μ1上清用于后續(xù)實驗;
[0041 ] 13.剩余上清吸2μ1,Qubit測值,記錄。
[0042] 7)、進行 PCR 擴增;
[0043] 具體如下:
[0044]反應(yīng)體系:
[0046] 使用以下PCR擴增程序:
[0047] 98〇C 30s
[0048] 98〇C 10s
[0049] 65〇C 30s 12_23Cycle
[0050] 72〇C 30s (PCR產(chǎn)量與起始mRNA相關(guān))
[0051 ] 72〇C 5min
[0052] 4°C 保存;
[0053] 8)、對PCR產(chǎn)物再進行磁珠純化(先配制80 %無水乙醇,總體積=0.4*(n+1 )ml,n = 樣品數(shù));
[0054] 具體輔助操作步驟如