焦磷酸測序法檢測abcc10基因試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及焦憐酸測序法檢測ABCC10基因多態(tài)性的試 劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 替諾福韋是一種核巧酸類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，臨床應(yīng)用于治療艾滋病、乙肝等的抗 病毒藥物。替諾福韋醋是替諾福韋的前藥，口服藥物替諾福韋醋具有水溶性，可被迅速吸收 并降解成活性物質(zhì)替諾福韋，替諾福韋然后被轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x產(chǎn)物替諾福韋雙憐酸鹽?；?性成分替諾福韋雙憐酸鹽可通過直接競爭性地與天然脫氧核糖底物相結(jié)合而抑制病毒聚 合酶，及通過插入DNA中終止DNA鏈。該藥通過干擾病毒DNA聚合酶的功能，抑制病毒復(fù)制，降 低血清及組織內(nèi)的病毒載量從而具有潛在的抗病毒的活性。替諾福韋幾乎不經(jīng)胃腸道吸 收，通過腎小球過濾和主動小管轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)排泄，約70%~80% W原形經(jīng)尿液排出體外。近端 腎小管上皮細(xì)胞是替諾福韋醋的主要作用祀點。因為近端小管的上皮細(xì)胞有復(fù)雜的藥物轉(zhuǎn) 運(yùn)機(jī)制，主要包括ΟΑΤ1和0ΑΤ3轉(zhuǎn)入蛋白及MRP-2、MRP-4和MRP-7轉(zhuǎn)出蛋白等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。其編 碼基因的SNP突變可能影響其蛋白活性從而導(dǎo)致替諾福韋的蓄積，毒副反應(yīng)增加，療效降 低。MRP-7的編碼基因為ABCC10,其nearGene-5區(qū)存在526G〉A(chǔ)(rs9349256)突變，可能影響 ABCC10的活性，從而影響MRP-7對替諾福韋的轉(zhuǎn)出過程。rs9349256與尿無機(jī)憐消耗及的小 球蛋白顯著相關(guān)，P值分別為0.02與0.04，等位基因 A攜帶者發(fā)生慢性腎臟疾病的風(fēng)險是等 位基因 G攜帶者的2.3倍(J Infect Dis.2011化1 1:204(1):145-53.)。我們進(jìn)一步研究發(fā) 現(xiàn)，攜帶rs9349256突變純合子AA和突變雜合子GA的在治療48周后的CD4免疫應(yīng)答分別為攜 帶GG野生型純合子的31.2%和40.8%，攜帶64+44型患者〔04免疫應(yīng)答效應(yīng)為攜帶66型患者 的 38.6%，P = 0.002。
[0003] 綜上所述，對ABCC10基因 nearGene-5區(qū)rs9349256單核巧酸多態(tài)性進(jìn)行分析檢測 可作為替諾福韋不良反應(yīng)及療效預(yù)測的有效指標(biāo)，為臨床制定替諾福韋抗病毒治療方案提 供依據(jù)。開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測ABCC10基因多態(tài)性的試劑盒將為替諾福韋 的臨床個體化治療起到積極的推動作用。
[0004] 焦憐酸測序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù)，該技術(shù)無須進(jìn)行 電泳，DNA片段也無須巧光標(biāo)記，是一種通用型技術(shù)平臺。該技術(shù)具有操作簡便、檢測成本 低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] ABCC10基因多態(tài)性是替諾福韋不良反應(yīng)預(yù)測的有效指標(biāo)。本發(fā)明提供一種檢測影 響ABCC10 rs9349256(G〉A(chǔ))單核巧酸多態(tài)性的試劑盒，W實現(xiàn)快速、簡便、準(zhǔn)確、高效、實用、 經(jīng)濟(jì)的檢測替諾福韋個體化用藥相關(guān)基因 SNP。
[0006] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：
[0007] 所述焦憐酸測序法檢測ABCC10基因多態(tài)性試劑盒，包括如下引物：
[000引 （1)擴(kuò)增引物；
[0009] ABCC10(rs9349256)上游引物：5'-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3'(SEQID N0.1)；
[0010] ABCC10(rs9：M9256)下游引物：5'-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3'(沈Q ID N0.2);
[0011] 其中，下游引物的5/進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[0012] (2)測序引物：
[0013] ABCC10(rs9：M9256)測序引物：5'-TTCACTCTCTCCTGACC-3'(沈Q ID N0.3);
[0014] 其中，48〔(：10'39349256(6〉4)目標(biāo)序列：野生型〇：1'刊6了〇：44(569 10^.4)、突 變型CCTTTATCCAA(SEQ ID N0.5)。
[001引利用上述試劑盒檢測ABCCIO基因多態(tài)性的方法，不包括如下步驟：
[0016] (l)DNA 提??；
[0017] (2)聚合酶鏈反應(yīng)
[001 引配制50μ1 PCR擴(kuò)增體系，包含：10XPCR buffer 5.0μ1，(1ΝΤΡ 1.化1，ABCC10-上游 引物0.化1，ABCCIO下游引物0.扣1，rTaqO.扣1，水40μ1，模板化1;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置 擴(kuò)增儀:95°C 5min預(yù)變性;然后依次在95°C 30S，55°C 30S，72°C 30S，進(jìn)行36個循環(huán);再在 72°C保持3min，最終保持在4°C，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0019] (3)焦憐酸測序單鏈樣本純化；
[0020] (4)焦憐酸測序；
[0021] (5)焦憐酸測序結(jié)果分析。
[0022] 本發(fā)明適用于對ABCC10基因多態(tài)性進(jìn)行快速檢測，可廣泛應(yīng)用于臨床上替諾福韋 個體化用藥方案制定的基因檢測。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦憐酸測序技術(shù)可W快速、準(zhǔn)確 地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程;具有高通量、低成本等特點；PCR產(chǎn)物即 可直接用于測序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。
【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明ABCC10 rs9349256(GG)焦憐酸測序結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1
[00 巧]ABCC10(rs9349256)上游引物：5'-CCTGTTCACCTCCTGTTCTGAGTT-3'(SEQID N0.1)；
[0026] ABCC10(rs9：M9256)下游引物：5'-AATGTGGTGGAGGCAATTCA-3'(沈Q ID N0.2);
[0027] 其中，下游引物的5/進(jìn)行生物素標(biāo)記；
[002引 ABCC10(rs9：M9256)測序引物5'-TTCACTCTCTCCTGACC-3'(沈Q ID N0.3);
[0029] 1.DNA 提取
[0030] 1.1實驗前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下：
[0031] (1)檢查試劑盒保質(zhì)期W及確保Wash Buffer 1和2中已添加乙醇，并在瓶上相應(yīng) 標(biāo)識處打勾^Γ;(2)異丙醇(如無，可用無水乙醇替代)和75%乙醇；（3)高壓滅菌有效期內(nèi)的 1.5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。
[0032] 1.2從4°C冰箱中取出裝有全血的邸ΤΑ抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
[0033] 1.3在1.5mL Eppendorf管對應(yīng)標(biāo)本唯一性標(biāo)識做好標(biāo)記；
[0034] 1.4分別移取900uL Cell Lysis Solution加至滅菌的 1.5mL Eppendorf管；
[0035] 1.5小屯、移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的1.5mL EP管；
[0036] 1.6蓋上化pendorf管蓋，室溫解育lOmin;
[0037] 1.7 13,000巧 m 室溫離屯、20 秒；
[003引 1.8取出化pendorf管，觀察白色沉淀；
[0039] 1.9開化pendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管口棄去部分紅色上清，盡量將紅色上 清吸盡；
[0040] 1.10蓋上化pendorf管，用手指彈擊EP管底部，使白色沉淀重懸；
[0041 ] 1.11 移取300uL Nuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛 倒數(shù)次混勻；
[0042] 1.12打開Eppendorf管，移取lOOuL Protein Precipitation Solution入上述 Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，00化pm室溫離屯、3min;
[0043] 1.13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌1.5mL E卵endorf管；
[0044] 1.14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀曲NA 析出；
[0045] 1.15 13,000巧 m 室溫離屯、Imin;
[0046] 1.16打開化pendorf管，手捏管