本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域和臨床檢測(cè)診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的核酸提取試劑、試劑盒及其方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高疫情國(guó)家之一，患者數(shù)居世界第2位，感染率為44.5％，活動(dòng)性肺結(jié)核患者為450萬(wàn)例，每年新發(fā)病例約100萬(wàn)左右，死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)例每年，是其他傳染病死亡人數(shù)的2倍以上。目前針對(duì)結(jié)核的診斷方法主要包括痰涂片抗酸染色、痰培養(yǎng)方法、結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)和干擾素釋放試驗(yàn)等，雖然這些技術(shù)已經(jīng)在臨床檢測(cè)和對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的監(jiān)測(cè)等方面被廣泛應(yīng)用，但檢出率相對(duì)較低，檢出時(shí)間長(zhǎng)，操作過(guò)程復(fù)雜，易受到其他疾病干擾等因素影響，這些檢測(cè)手段已不能滿足臨床需求。

目前，臨床上對(duì)菌陰性肺結(jié)核(指患者在進(jìn)行痰液涂片時(shí)或是在進(jìn)行一次的痰液培養(yǎng)陰性的活動(dòng)性肺結(jié)核)缺乏相對(duì)可靠的檢測(cè)方法，菌陰性肺結(jié)核在初期屬于非傳染性結(jié)核病，但若對(duì)于部分體質(zhì)較差的患者，多表現(xiàn)為與呼吸道癥狀相似的臨床癥狀，如咳嗽、咳痰及嚴(yán)重者出現(xiàn)咯血的癥狀，故多數(shù)患者因誤診而導(dǎo)致病情加重，最終因?yàn)橹委熝诱`使其轉(zhuǎn)為陽(yáng)性肺結(jié)核。

市場(chǎng)上已經(jīng)有多種商業(yè)化的分枝桿菌結(jié)核核酸檢測(cè)試劑產(chǎn)品，但由于諸多因素限制因素使得其檢出符合率與臨床診斷結(jié)果相差很大，這些因素主要包括：1)樣本質(zhì)量達(dá)不到檢測(cè)要求；2)對(duì)mtb-dna提取能力較差，不能完全富集樣本中的mtb-dna，使得檢測(cè)結(jié)果不理想；3)試劑盒敏感性不夠；4)目前大部分檢測(cè)產(chǎn)品為液體試劑，其對(duì)運(yùn)輸過(guò)程要求較高，實(shí)際運(yùn)輸中很難完全按照要求運(yùn)送，導(dǎo)致試劑盒的檢測(cè)性能有所降低；5)常規(guī)的檢測(cè)試劑產(chǎn)品還不能準(zhǔn)確地對(duì)外周血中的結(jié)核dna進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及其方法，該方法從根本上解決現(xiàn)有結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒敏感性低，穩(wěn)定性差、檢測(cè)樣本單一和對(duì)運(yùn)輸溫度要求高等問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的核酸提取試劑，其包括裂解液，所述裂解液含有seqidno：1-seqidno：2所示序列的捕獲引物。

優(yōu)選地，所述核酸提取試劑還包括液化液、蛋白酶k、磁珠液、洗滌液和洗脫液。

優(yōu)選地，所述捕獲引物5’端采用生物素標(biāo)記。

優(yōu)選地，所述裂解液含有：50～200mm氯化鈉、30～60mm三羥甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸鈉、1～5mm乙二胺四乙酸、1～5mm氯化鈣和1～10nm捕獲引物。

本發(fā)明還提供一種包含如上所述的核酸提取試劑的用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品。

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括熒光pcr反應(yīng)體系，所述熒光pcr反應(yīng)體系為凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系，其包括如seqidno：3-seqidno：4所示序列的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增引物和如seqidno：5所示序列的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增探針；

其中，所述探針的5’端連接有熒光基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)為fam、rox、hex、cy5、cy3、tet、alex或calflour；所述探針的3’端連接有淬滅基團(tuán)，所述淬滅基團(tuán)為bhq1、bhq2或dabcyl；更優(yōu)選地，所述探針的5’端連接熒光基團(tuán)fam，所述探針的3’端連接淬滅基團(tuán)bhq1。

優(yōu)選地，所述熒光pcr反應(yīng)體系還包括凍干骨架、凍干保護(hù)劑、dntps和酶混合液。

優(yōu)選地，所述熒光pcr反應(yīng)體系為30～100μl。

優(yōu)選地，所述凍干骨架包括0.3％～2.5％甲基纖維素和/或羥甲基纖維素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮。

優(yōu)選地，所述凍干保護(hù)劑包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖。

優(yōu)選地，所述dntps包括0.1～0.5mm的dntp和dut。

優(yōu)選地，所述酶混合液包括1.5～5utaqdna聚合酶、ung酶和緩沖液。

上述引物及探針的核苷酸序列如表1所示。

表1引物及探針核苷酸序列表

最后，本發(fā)明提供一種用于非診斷和治療目的的采用上述試劑盒來(lái)來(lái)檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的方法，其包括如下所述的核酸提取步驟：采用核酸提取試劑對(duì)樣本進(jìn)行酶促消化、寡核苷酸雜交和捕獲、結(jié)核dna富集、洗滌和洗脫。

為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：

優(yōu)選地，所述樣本為痰液、灌洗液、外周血和腦脊液，當(dāng)樣本為痰液或灌洗液時(shí)，所述酶促消化之前先對(duì)樣本進(jìn)行液化。

優(yōu)選地，所述液化方法選自4％氫氧化鈉(naoh)、5-10％二硫代蘇糖醇(ddt)、1.45％n-乙酰-l-半胱氨酸(nalc)、2％氫氧化鈉(naoh)、saccomanno法、二硫蘇糖醇(dtt)法、0.5％n-乙酸-l半胱氨酸、1.45％枸櫞酸鈉、2％氫氧化鈉、0.25％胰蛋白酶(trypsin)、400u/ml的胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、高壓液化法及其組合；更優(yōu)選地，所述液化方法為1.45％n-乙酰-l-半胱氨酸及2％氫氧化鈉(nalc-naoh)的聯(lián)合應(yīng)用、saccomanno法和二硫蘇糖醇(dtt)法的聯(lián)合應(yīng)用、0.5％n-乙酸-l半胱氨酸和1.45％枸櫞酸鈉和2％氫氧化鈉的液化劑振搖液化、4％氫氧化鈉(naoh)和5％二硫代蘇糖醇(ddt)的聯(lián)合應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述核酸提取步驟的具體過(guò)程如下：

1)痰液和灌洗液樣本需采用上述的液化方法進(jìn)行預(yù)先液化，而外周血、腦脊液樣本直接進(jìn)入步驟2)。

2)取0.5～1ml步驟1)處理后的樣本，加入0.5～1倍體積裂解液和20mg/ml蛋白酶k，其中裂解液含有：50～200mm氯化鈉、30～60mm三羥甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸鈉、1～5mm乙二胺四乙酸、1～5mm氯化鈣和1～10nm捕獲引物，所述的捕獲引物的序列為seqidno1和seqidno2，捕獲引物5’端采用生物素(biotin)標(biāo)記；

3)充分混勻后56℃消化30min；

4)消化結(jié)束后95℃孵育10min，將蛋白酶k失活，隨后將溫℃維持在55℃孵育10min；

5)加入10～50mg1～10μm鏈霉親和素標(biāo)記的超順磁珠，充分混勻，孵育10min；

6)將樣本放置磁力架上，靜置2～5min，吸去液體；

7)加入200～500μl洗滌液，洗滌1～2次，所述的洗滌液中含有：10mm三羥甲基氨基甲烷和0.1～0.5mm乙二胺四乙酸，ph為8.0；

8)加入30～100μl洗脫液，所述洗脫液即為pcr擴(kuò)增模板dna，混勻后備用，若不及時(shí)檢測(cè)，保存于-20℃；

9)陰性質(zhì)控品和陽(yáng)性質(zhì)控品參照上述同樣的方法進(jìn)行處理。

優(yōu)選地，上述檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的方法還包括如下所述的熒光pcr擴(kuò)增程度：

1)將上述所獲得的30～100μl含pcr擴(kuò)增模板dna的洗脫液直接加入到凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系中，蓋好管蓋，上機(jī)反應(yīng)；

2)pcr擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為：ung酶反應(yīng)55℃2min，1個(gè)循環(huán)；taq酶活化95℃10min，1個(gè)循環(huán)；變性95℃15s，退火、延伸、熒光采集55℃45s，45個(gè)循環(huán)；儀器冷卻37℃2min，1個(gè)循環(huán)。

優(yōu)選地，上述檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的方法還包括上述熒光pcr反應(yīng)的結(jié)果判讀：熒光基團(tuán)信號(hào)通路ct值<42循環(huán)，且擴(kuò)增曲線為“s”型，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

優(yōu)選地，凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系的制備方法如下：

1)將預(yù)先配置的熒光pcr反應(yīng)體系按30～100μl分裝到八聯(lián)排管中；

2)-60℃預(yù)凍4h；

3)-45℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時(shí)間為20h；

4)25℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時(shí)間為2h；

經(jīng)過(guò)上述處理獲得凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系。

在本發(fā)明中，檢測(cè)樣本是經(jīng)過(guò)核酸提取的dna模板，可選地，dna提取的方法包括本發(fā)明上述的核酸提取步驟，也可采用本領(lǐng)域常用的超聲破碎法、煮沸法或苯酚氯仿抽提法進(jìn)行核酸提取。

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中液體試劑盒上樣量為5到10μl而不能保證檢測(cè)體系中含有分枝桿菌dna的問(wèn)題，通過(guò)將結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)體系凍成干粉狀，在擴(kuò)增檢測(cè)過(guò)程中，直接加入提取的dna進(jìn)行反應(yīng)，最大程度上增加熒光pcr的上樣量，極大的增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)出率；同時(shí)優(yōu)化樣本中結(jié)核dna提取過(guò)程，盡量減少熒光pcr干擾物質(zhì)。

本發(fā)明的要點(diǎn)在于一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及其方法。其基本原理是：首先對(duì)待檢樣本進(jìn)行預(yù)處理，通過(guò)優(yōu)化結(jié)核分枝桿菌核酸的提取過(guò)程，盡量減少對(duì)熒光pcr產(chǎn)生的干擾物質(zhì)，以多種樣本中的結(jié)核分枝桿菌dna作為擴(kuò)增模板，應(yīng)用熒光pcr技術(shù)完成對(duì)低拷貝結(jié)核分枝桿菌核酸的檢測(cè)。同時(shí)將結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)體系凍成干粉狀，便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，最大程度的保持了檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，也簡(jiǎn)化了操作步驟、降低了污染的風(fēng)險(xiǎn)，只需將提取的dna加入其中便可上機(jī)進(jìn)行反應(yīng)，可以最大程度上增加上樣量，極大的增強(qiáng)了結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)出率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明結(jié)合磁珠法進(jìn)行核酸的提取，不需要高速離心和煮沸等操作步驟，可以最大程度的保持核酸的完整性，同時(shí)避免了氣溶膠所帶來(lái)的生物風(fēng)險(xiǎn)。

(2)本發(fā)明可以對(duì)低拷貝的結(jié)核分枝桿菌核酸進(jìn)行檢測(cè)，所以既可以結(jié)合臨床上常用的4％naoh進(jìn)行液化的常規(guī)步驟，又可以與其他形式的液化方法很好的融合，可以很大程度的降低假陰性結(jié)果。

(3)本發(fā)明具有極高的靈敏度和良好的重復(fù)性，相比于常規(guī)的核酸檢測(cè)，具有更好的檢出率和穩(wěn)定性，同時(shí)簡(jiǎn)化了提取和檢測(cè)的操作步驟，極大地縮短了檢測(cè)時(shí)間，最大程度的降低了檢測(cè)成本，為自動(dòng)化檢測(cè)和大樣本量的檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明所述的用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及其方法相比于現(xiàn)有的檢測(cè)方法和產(chǎn)品，操作簡(jiǎn)便快速、成本降低、易于開(kāi)發(fā)成為自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)和裝置，檢測(cè)的靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，能夠針對(duì)多種樣本進(jìn)行檢測(cè)，可廣泛的應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)臨床診療領(lǐng)域中。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的核酸提取試劑，其包括液化液、裂解液、蛋白酶k、磁珠液、洗滌液和洗脫液；其中，所述裂解液中含有seqidno：1-seqidno：2所示序列的捕獲引物，所述捕獲引物5’端采用生物素標(biāo)記；本發(fā)明還提供一種含有上述核酸提取試劑的用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及其檢測(cè)方法，所述試劑盒包括熒光pcr反應(yīng)體系，其包括如seqidno：3-seqidno：4所示序列的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增引物和如seqidno：5所示的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增探針。

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例僅用于更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不能以此來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1-凍干粉型pcr反應(yīng)體系的制備

制備凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系的步驟如下：

(1)在預(yù)先配置的熒光pcr反應(yīng)體系按30～100μl分裝到八聯(lián)排管中；

(2)-60℃預(yù)凍4h；

(3)-45℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時(shí)間為20h；

(4)25℃抽真空大氣壓小于100mtorr，作用時(shí)間為2h。

通過(guò)上述處理，經(jīng)過(guò)上述處理獲得凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系。

上述熒光pcr反應(yīng)體系的組成如下：

包括如seqidno：3(5’-ctactacgaccacatca-3’)和seqidno：4(5’-ccgtaaacaccgtagttg-3’)所示序列的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增引物和如seqidno：5(5’-ctgatgtgctccttgagttcgcca-3’)所示序列的結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增探針，其中所述探針的5’端連接有熒光基團(tuán)fam，所述探針的3’端連接有淬滅基團(tuán)bhq1；

凍干骨架，所述凍干骨架包括0.3％～2.5％甲基纖維素和/或羥甲基纖維素，和/或含有1％～5％聚乙烯吡咯烷酮；

凍干保護(hù)劑，所述凍干保護(hù)劑包括2％～5％海藻糖和/或1％～10％蔗糖；

dntps，所述dntps包括0.1～0.5mm的dntp和dut；以及

酶混合液，所述酶混合液包括1.5～5utaqdna聚合酶、ung酶和緩沖液。

實(shí)施例2-凍干粉結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)痰液中結(jié)核分枝桿菌的實(shí)例

1)樣本選取

選取痰液中含100菌/ml、50菌/ml和20菌/ml各20人份。取2ml痰液樣本等分兩份：一份加入2倍體積的10％dtt充分混勻液化30min后采用捕獲提取法進(jìn)行核酸提取，另一份加入2倍體積4％naoh充分混勻液化30min后超聲裂解細(xì)胞。

2)捕獲提取法步驟

a、取1mldtt液化痰液加入到1.5ml無(wú)菌離心管中，加入0.5倍體積的裂解液和30mg蛋白酶k混勻后，56℃孵育30min，所述裂解液組成為50～200mm氯化鈉、30～60mm三羥甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸鈉、1～5mm乙二胺四乙酸、1～5mm氯化鈣和1～10nm捕獲引物，所述的捕獲引物1序列為：5’-aaaaactactacgaccacatca-3’和捕獲引物2序列為5’-aaaaaccgtaaacaccgtagttg-3，捕獲引物5’端采用生物素(biotin)標(biāo)記；

b、95℃孵育5min以后，55℃孵育10min；

c、加入50mg6μm鏈霉親和素標(biāo)記的超順磁珠，充分混勻后孵育10min。孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，靜置2min，盡量吸干、棄掉上清液；

d、加入洗滌液，用移液器反復(fù)吹打混勻后，將離心管放在磁力架上吸附2min，吸棄上清，重復(fù)洗滌1次，所述的洗滌液組成為10mm三羥甲基氨基甲烷和0.1～0.5mm乙二胺四乙酸，ph為8.0；

e、加入100μl洗脫液，充分振蕩混勻后，將離心管放在磁力架上吸附2min，吸取上清備用，若不及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，需保存于-20℃條件下。

3)超聲破碎提取法步驟

a、取1ml4％naoh液化后的痰液，12000rpm離心5min；

b、去上清加入1ml生理鹽水洗滌1次，12000rpm離心5min；

c、去掉上清后加入100μl洗脫液，懸浮細(xì)菌；

d、300w超聲15min后，8000rpm離心5min備用。

4)加樣

每個(gè)提取的dna所需的熒光pcr反應(yīng)體系為1管50μl凍干的結(jié)核分枝桿菌熒光pcr反應(yīng)體系和2管新配置的液體熒光pcr反應(yīng)體系。其中液體熒光pcr體系1加入5μl提取的dna，液體熒光pcr體系2加入20μl提取的dna，凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系加入50μl提取的dna。

5)熒光pcr擴(kuò)增條件

cutoff值：fam信號(hào)通路ct值<42循環(huán)為陽(yáng)性。

6)結(jié)果分析：

a、采用naoh液化結(jié)合超聲破碎提取的方法

液體熒光pcr體系1加入了5μl提取的dna，其敏感性為100菌/ml，檢出率為95％；對(duì)50菌/ml參考品檢出率為35％；20菌/ml參考品檢出率為5％。

液體熒光pcr體系2加入了20μl提取的dna，其對(duì)50菌/ml檢出率為74％，對(duì)20菌/ml參考品檢出率為25％。

凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系加入了50μl提取的dna，對(duì)50菌/ml檢出率為100％，對(duì)20菌/ml檢出率為82％。

因此，通過(guò)加大提取dna的上樣量，可以顯著提高結(jié)核分枝桿菌核酸的檢出率，同時(shí)凍干粉型試劑的敏感性高于液體試劑。

b、捕獲法提取dna：

液體熒光pcr體系1加入了5μl提取的dna，其對(duì)50菌/ml參考品檢出率為95％，20菌/ml參考品檢測(cè)率為32％。

液體熒光pcr體系2加入了20μl提取的dna，其對(duì)50菌/ml參考品檢出率為100％，20菌/ml參考品檢測(cè)率為75％。

凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系加入了50μl提取的dna，對(duì)50菌/ml參考品檢出率為100％，20菌/ml參考品檢測(cè)率為100％。

所述液體熒光pcr體系1、液體熒光pcr體系2和凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系具有相同的成分。

綜合上述，1)采用捕獲法提取的痰液結(jié)核分枝桿菌dna具有更高的檢出率和敏感性；2)通過(guò)增加提取的痰液結(jié)核分枝桿菌dna的上樣量可以有效提高檢出率，同時(shí)凍干粉型試劑的敏感性高于液體試劑；3)捕獲方法提取dna結(jié)合凍干粉型試劑進(jìn)行檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測(cè)。

實(shí)施例3-外周血結(jié)核分枝桿菌dna檢測(cè)

取20份臨床外周血樣本，10份為健康人外周血，10份為痰液涂片呈陽(yáng)性患者的外周血。上述樣本收集后2小時(shí)內(nèi)離心獲得血漿，并將其置于-80℃冷凍2小時(shí)。

1)結(jié)核分枝桿菌dna提取

a、取1ml血漿充分混勻后分為兩等份；

b、1份加入采用凱杰公司外周血游離dna提取試劑盒提取，凱杰的提取方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，最后100μl洗脫液溶解備用；

c、1份采用捕獲方法提取，捕獲方法提取步驟：

i)0.5ml血漿加入0.5ml裂解液和20mg蛋白酶k，56℃消化30min，所述裂解液組成為50～200mm氯化鈉、30～60mm三羥甲基氨基甲烷、0.5～2％十二烷基磺酸鈉、1～5mm乙二胺四乙酸、1～5mm氯化鈣和1～10nm捕獲引物，所述的捕獲引物1序列為：5’-aaaaactactacgaccacatca-3’和捕獲引物2序列為5’-aaaaaccgtaaacaccgtagttg-3，捕獲引物5’端采用生物素(biotin)標(biāo)記；

ii)95℃孵育5min后，55℃孵育10min；

iii)加入20mg鏈霉親和素標(biāo)記的超順磁珠，充分混勻后孵育10min。孵育結(jié)束后，將離心管置于磁力架上，靜置2min，盡量吸干、棄掉上清液；

iv)加入洗滌液，用移液器反復(fù)吹打混勻后，將離心管放在磁力架上吸附2min，吸棄上清，重復(fù)洗滌1次，所述的洗滌液組成為10mm三羥甲基氨基甲烷和0.1～0.5mm乙二胺四乙酸，ph為8.0；

v)加入100μl洗脫液，充分振蕩混勻后，將離心管放在磁力架上吸附2min，吸取上清備用，若不及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，需保存于-20℃條件下。

2)加樣

每個(gè)提取的dna所需的熒光pcr反應(yīng)體系為1管50μl凍干的結(jié)核分枝桿菌熒光pcr反應(yīng)體系和2管新配置的液體熒光pcr反應(yīng)體系。其中液體熒光pcr體系1加入5μl提取的dna，液體熒光pcr體系2加入20μl提取的dna，凍干粉型熒光pcr反應(yīng)體系加入50μl提取的dna。

3)熒光pcr擴(kuò)增條件

cutoff值：fam信號(hào)通路ct值<42循環(huán)為陽(yáng)性。

3)結(jié)果分析：

a、采用凱杰外周血dna提取試劑盒提取dna

10例陽(yáng)性血清中，液體試劑1僅僅能檢測(cè)2例；液體試劑2能檢測(cè)出4例；凍干型試劑10均可以檢測(cè)出，且陰性血清均為陰性。

b、捕獲法提取dna

10例陽(yáng)性血清中，液體試劑1僅僅能檢測(cè)2例；液體試劑2能檢測(cè)出5例；凍干型試劑10均可以檢測(cè)出，且陰性血清均為陰性。

因此，在外周血結(jié)核分枝桿菌dna檢測(cè)中，捕獲法和凱杰試劑盒提取結(jié)果基本一致，但是凍干粉型試劑敏感性明顯高于液體試劑，同時(shí)加大提取的外周血結(jié)核分枝桿菌dna的量可以增加陽(yáng)性檢出率。

由上述實(shí)施例可知，在本發(fā)明實(shí)施例提供的一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的試劑盒及其方法，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的引物和探針靈敏度高且特異性好，該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、生物風(fēng)險(xiǎn)小、結(jié)果準(zhǔn)確度高，優(yōu)化的提取dna的捕獲法和凍干粉型試劑相結(jié)合，可以極大的提高結(jié)核分枝桿菌的檢出率，檢測(cè)出低拷貝分枝桿菌，具有非常廣的應(yīng)用前景。

以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)該實(shí)用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>上海默禮生物醫(yī)藥科技有限公司

<120>一種用于檢測(cè)低拷貝結(jié)核分枝桿菌的核酸提取試劑、試劑盒及其方法

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<223>捕獲引物1

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<223>結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增引物1

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<223>結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增探針

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