本發(fā)明涉及dna分子標記技術領域，具體是一種篩選紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法。
背景技術：
富、高度雜合且穩(wěn)定性好、遵循孟德爾分離定律共顯性遺傳、易于pcr擴增等特點，已成為近年來廣泛應用的dna標記，常應用于生物資源的家系譜系認證、基因連鎖分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)鑒定、種群遺傳多樣性等許多研究領域。
在自然環(huán)境中，紫背浮萍基本以無性生殖進行繁殖，當環(huán)境條件適宜時2天即可克隆出一代，種群遺傳多樣性水平較低。
現(xiàn)有技術提供多種衛(wèi)星標記的檢測方法，例如，中國發(fā)明授權(quán)專利文獻一種銹斑蟳微衛(wèi)星標記的快速檢測方法授權(quán)公告號cn103305611b該發(fā)明涉及一種銹斑蟳微衛(wèi)星標記的快速檢測方法，包括：（1）銹斑蟳基因組dna的提??；（2）根據(jù)genebank數(shù)據(jù)庫中銹斑蟳的功能基因序列，獲得含有微衛(wèi)星重復的基因序列；（3）微衛(wèi)星標記引物的設計；（4）銹斑蟳不同個體的基因組dna的pcr擴增；（5）pcr產(chǎn)物的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。該發(fā)明的檢測方法具有快速、準確、靈敏等優(yōu)點，能夠直觀地檢測出銹斑蟳不同個體的基因型，從而快速獲得銹斑蟳在功能基因微衛(wèi)星位點遺傳變異的多態(tài)性圖譜，該微衛(wèi)星標記可應用于銹斑蟳遺傳變異與種群遺傳多樣性分析等領域，但微衛(wèi)星標記檢測速度還有提升空間。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種快速篩選與紫背浮萍根生長相關的分子標記方法，清晰紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片與相關dna位點的關系。
本發(fā)明針對背景技術中提到的問題，采取的技術方案為：篩選紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
作為優(yōu)選，植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
作為優(yōu)選，植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強，生長速度快。
作為優(yōu)選，微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
作為優(yōu)選，pcr擴增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul；在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為92~96℃預變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的紫背浮萍的dna序列。
作為優(yōu)選，數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進行統(tǒng)計描述，應用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點的關聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的紫背浮萍的dna序列，微衛(wèi)星標記檢測速度快，可快速獲得紫背浮萍sp25、sp30、sp47和sp53遺傳標記基因座呈現(xiàn)高度遺傳變異的多態(tài)性圖譜。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。了解基因型差異對紫萍生長以及污染物凈化能力的影響，提高廢水的生物治理效率。
具體實施例
下面通過實施例對本發(fā)明方案作進一步說明：
實施例1：
篩選紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.3~0.4g/l、磷酐0.1~0.15g/l、氧化鉀0.16~0.23g/l、氧化鎂0.01~0.015g/l和硫0.012~0.02g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)50~70d，培養(yǎng)條件為22.5~23.5℃，濕度73~83%，光照強度為1800~2200lux，光暗時間14~16:10~8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴增體系為18~22ul，其中包括3.4~4.2utaqdna聚合酶（sangon）、1.6~2.2ul10×pcrbuffer、0.7~0.9mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50~100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul；在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為92~96℃預變性4.5~5.6min；93~96℃變性28~33s，52~56℃復性33~37s，70~75℃延伸36~43s，共33~38個循環(huán)；最終70~75℃延伸2.5~3.4min。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的紫背浮萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進行統(tǒng)計描述，應用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點的關聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。
實施例2：
篩選紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.19g/l、氧化鎂0.012g/l和硫0.016g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
植株克隆體在光照培養(yǎng)箱中進行室內(nèi)培養(yǎng)60d，培養(yǎng)條件為23℃，濕度78%，光照強度為2000lux，光暗時間16:8h。上述培養(yǎng)條件下，紫背浮萍的光合作用強，生長速度快。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
pcr擴增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul。在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃復性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進行毛細管電泳檢測。上述pcr擴增可快速得到大量的經(jīng)微衛(wèi)星引物標記的紫背浮萍的dna序列。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進行統(tǒng)計描述，應用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應用一般線性模型過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片與微衛(wèi)星位點的關聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。
實施例3：
篩選紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法，包括克隆體培養(yǎng)、基因組dna提取、設計微衛(wèi)星引物、pcr擴增和數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。
植株克隆體培養(yǎng)的營養(yǎng)液成份及其濃度為：氮0.32g/l、磷酐0.12g/l、氧化鉀0.2g/l、氧化鎂0.013g/l和硫0.017g/l。上述營養(yǎng)液能全面提供紫背浮萍生長所需的大量元素和微量元素，無性繁殖速度快，基因突變的概率低，可得到大量基因相同的植株，樣本量足。
對不同培養(yǎng)系中的每一植株（葉片相連）計數(shù)根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片。
微衛(wèi)星引物為：sp25：f:ggcagagacagaaagatcatc；r:cctagttccctagagcgagag；sp30：f:cgcctataagtaaccccctac；r:atcatatctgctcgaaccatc；sp47：f:tgggcctatggcgattagggg；r:gcggcatccacggagaaaatg；sp53：f:aggacgacgacctctactgcc；r:tacgagttctgcggaccatca。
采用改良的ctab方法提取紫背浮萍和少根紫萍基因組dna。pcr擴增體系為20ul，其中包括4utaqdna聚合酶（sangon）、2ul10×pcrbuffer、0.8mmdntp、上游、下游引物各0.3mm、50-100ngdna模板，ddh2o補至終體積20ul。在bio-radpcr擴增儀上進行擴增，擴增程序為94℃預變性5min；94℃變性30s，54℃復性35s，72℃延伸40s，共35個循環(huán)；最終72℃延伸3min。pcr擴增產(chǎn)物在3730xl測序儀上進行毛細管電泳檢測。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析為采用spss19.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。對浮萍克隆的根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片進行統(tǒng)計描述，應用單因素方差分析（one-wayanova）和最小顯著差數(shù)法（least-significantdifference，lsd）或dunnettt3非參數(shù)多重比較兩兩基因型生長性狀特征之間的差異性；應用一般線性模型（generallinearmodels,glm）過程對根數(shù)/片、總根長/片和平均根長/片性狀與微衛(wèi)星位點的關聯(lián)性進行最小二乘分析,并對同一位點的各基因型進行多重比較。紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。
微衛(wèi)星標記掃描：
用毛細管電泳檢測4個微衛(wèi)星標記的紫背浮萍。結(jié)果顯示，3個紫背浮萍克隆為3個不同的mlgs。
表1紫背浮萍3個克隆在2個微衛(wèi)星位點的基因型
表2四個微衛(wèi)星位點不同基因型在紫背浮萍根生長性狀的多重比
紫背浮萍3個克隆在實驗室內(nèi)分別培養(yǎng)得到155~162個分株，3個mlgs的紫背浮萍的總根長/片為23.93±1.29mm，平均根長為2.73±0.11mm（p均小于0.001）。紫背浮萍最大根長出現(xiàn)在mlgsⅰ，為13.25mm；mlgsⅲ的平均根長/片為3.53±0.17mm，顯著大于其它2個紫背浮萍克?。╬<0.001）。由此可看出紫背浮萍的根數(shù)/片、總根長/片及平均根長/片與sp25、sp30、sp47和sp53位點顯著相關（p均小于0.01）。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。
以上所述的實施例對本發(fā)明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
sequencelisting
<110>浙江海洋大學
<120>篩選與紫背浮萍根生長相關的分子標記的方法
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