本發(fā)明涉及生物技術(shù)，分子生物學(xué)領(lǐng)域特別是指一種檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)及其在制備基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

錦鯉皰疹病毒病，是被列為《中華人民共和國進(jìn)境動物一、二類傳染病、寄生蟲病名錄》的二類動物疫病，同時也是世界衛(wèi)生組織（oie）必須申報的疾病。

該病病原鯉皰疹病毒3型（cyprinidherpesvirus3,cyhv-3），又稱為錦鯉皰疹病毒（koiherpesvirus,khv），能引起鯉魚和錦鯉發(fā)生高度傳染性病毒病，并能感染多種鯉科魚類。在亞洲、歐洲、北美洲等多個國家流行，死亡率高達(dá)80%~100%?？赏ㄟ^魚體、水、糞便等途徑進(jìn)行傳播，對鯉魚及錦鯉養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的打擊。

因細(xì)胞培養(yǎng)病毒分離技術(shù)操作本身的繁雜耗時及血清學(xué)方法靈敏度有限的缺陷，無法達(dá)到對cyhv-3快速診斷的目的。因此有必要建立一種適用于出入境口岸診斷的高通量、自動化、快速的cyhv-3檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何鑒定鯉皰疹病毒3型。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)，。

本發(fā)明所提供的檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)，所述鯉皰疹病毒3型指紋序列為序列表中seqidno.1的第2355-2389位核苷酸。

進(jìn)一步，所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)包括鯉皰疹病毒3型指紋序列的測序引物和/或鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對。

進(jìn)一步，所述測序引物為序列表中seqidno.4所示的單鏈dna，其名稱為cyhv-3-s；所述擴(kuò)增鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對（cyhv-3-p）由序列表中seqidno.2所示的單鏈dna（cyhv-3-p-f）和seqidno.3所示的單鏈dna（cyhv-3-p-r）組成。

進(jìn)一步，所述seqidno.2所示的單鏈dna和/或seqidno.3所示的單鏈dna用生物素標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，seqidno.3所示的單鏈dna的5′端有生物素標(biāo)記。

所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)可只由所述cyhv-3-s及所述cyhv-3-p組成，也可只由所述cyhv-3-p組成，也可只由所述cyhv-3-s組成。

上文中，所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)，還可包括檢測所述鯉皰疹病毒3型指紋序列所需要的其他試劑和/或儀器，如通過焦磷酸測序檢測所述鯉皰疹病毒3型指紋序列所需的試劑和儀器。

具體來說，進(jìn)行焦磷酸測序所需要的其它試劑和儀器可為5×buffer、dntp和/或rtaq酶和/或變性緩沖液（pyromarkdenaturationsolution）和/或沖洗緩沖液（pyromarkwashbuffer）和/或鏈霉親和素包被的磁珠和/或pcr儀和/或pyromarkid儀器。

其中，所述5×buffer、dntp和所述rrtaq酶均可為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，貨號為dr001b；

所述鏈霉親和素包被的磁珠可為美國gehealthcare的產(chǎn)品，貨號為17-5113-01。

所述變性緩沖液（pyromarkdenaturationsolution）可為為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979007。

所述沖洗緩沖液（pyromarkwashbuffer）可為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979008。

所述退火緩沖液（pyromarkannealingbuffer）可為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979009。

上述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)均可獨(dú)立包裝。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提出了所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)在制備基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒。

本發(fā)明所提供的基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒，包括了所述檢測鯉皰疹病毒3型指紋序列的物質(zhì)

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒的制備方法。

所述基于焦磷酸測序的鯉皰疹病毒3型檢測試劑或試劑盒的制備方法，包括將所述測序引物和/或所述引物對的兩條單鏈dna獨(dú)立包裝的步驟。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鯉皰疹病毒3型的檢測方法1。

本發(fā)明所提供的鯉皰疹病毒3型的檢測方法1，包括下述h1）和h2）的步驟：

h1）以待測生物樣品的核酸（rna或dna）為模板，選用58℃的退火溫度，用所述cyhv-3-p進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物；

h2）檢測步驟h1）得到的pcr產(chǎn)物的大小，如果所述pcr產(chǎn)物中含有254bp的dna片段，所述待測樣品含有鯉皰疹病毒3型或候選含有鯉皰疹病毒3型；如果所述pcr產(chǎn)物中不含254bp的dna片段，所述待測樣品不含鯉皰疹病毒3型或候選不含鯉皰疹病毒3型。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了鯉皰疹病毒3型的檢測方法2。

本發(fā)明所提供的鯉皰疹病毒3型的檢測方法2，包括下述h3）和h4）的步驟：

h3）以待測生物樣品的核酸（rna或dna）為模板，選用58℃的退火溫度，用所述cyhv-3-p進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到pcr產(chǎn)物；

h4）檢測步驟h3）得到的pcr產(chǎn)物，如果所述pcr產(chǎn)物中含有所述鯉皰疹病毒3型指紋序列，所述待測樣品含有鯉皰疹病毒3型或候選含有鯉皰疹病毒3型；如果所述pcr產(chǎn)物中不含所述鯉皰疹病毒3型指紋序列，所述待測樣品不含鯉皰疹病毒3型或候選不含鯉皰疹病毒3型。

上述鯉皰疹病毒3型的檢測方法2中，所述檢測步驟h3）得到的pcr產(chǎn)物為以所述cyhv-3-s為測序引物進(jìn)行焦磷酸測序。

上文中，

實(shí)驗(yàn)證明，鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列，可利用本發(fā)明的檢測鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列的物質(zhì)通過焦磷酸測序法對鯉皰疹病毒3型進(jìn)行鑒定，其中cyhv-3-p可擴(kuò)增出含有cyhv-3指紋序列的dna片段，cyhv-3-s可通過焦磷酸測序法測定cyhv-3指紋序列的序列；本發(fā)明的cyhv-3-p和cyhv-3-s可特異識別鯉皰疹病毒3型的核酸序列；本發(fā)明的cyhv-3-p具有較高的靈敏度，可識別濃度為100拷貝/μl的鯉皰疹病毒3型，說明cyhv-3-p最低能檢測到濃度為100個cyhv-3基因組拷貝數(shù)/μl（即0.8fgcyhv-3基因組/μl）。常規(guī)的dna測序技術(shù)對大片段的dna進(jìn)行序列測定速度慢、消耗大，更不易于進(jìn)行大規(guī)模樣本的檢測，而依賴于本發(fā)明的cyhv-3-p與cyhv-3-s的鑒定cyhv-3的焦磷酸測序法則可克服這一缺點(diǎn)，可快速檢測大規(guī)模樣本，在4小時內(nèi)即可完成檢測過程。實(shí)驗(yàn)證明，與普通pcr鑒定cyhv-3相比，依賴于本發(fā)明的cyhv-3指紋序列及cyhv-3-p與cyhv-3-s的鑒定cyhv-3的焦磷酸測序法具有高通量、自動化程度高、準(zhǔn)確性高、靈敏度高、可靠性好、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、方便快捷等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，泳道m(xù)為dl1000marker；泳道1和泳道2為用cyhv-3-p以cyhv-3的dna為模板的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；

圖2為cyhv-3測序結(jié)果。

圖3為cyhv-3-p的特異性檢測結(jié)果。其中，泳道m(xù)為dl1000marker；泳道1的模板為cyhv-3；泳道2的模板為陰性對照；泳道3的模板為cyhv-2；泳道4的模板為svcv；泳道5的模板為lmbv；泳道6的模板為gcrv；泳道7的模板為isknv；

圖4為cyhv-3-p的靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，泳道m(xù)為dl1000marker；泳道1的模板為10⁷拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道2的模板為10⁶拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道3的模板為10⁵拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道4的模板為10⁴拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道5的模板為10³拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道6的模板為10²拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道7的模板為10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道8的模板為1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3；泳道9為陰性對照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的鯉皰疹病毒3型（cyhv-3)（李瑩瑩,王慶,曾偉偉,等.錦鯉皰疹病毒gz1301株的分離與鑒定[j].水產(chǎn)學(xué)報,2014,38(8):1159-1166.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的鯉皰疹病毒2型（cyhv-2）（徐進(jìn),曾令兵,楊德國,等.鯉皰疹病毒2型武漢株的分離與鑒定[j].中國水產(chǎn)科學(xué),2013,20(6):1303-1309.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）（王慶,曾偉偉,劉春,等.大口黑鱸虹彩病毒雙重pcr檢測方法的建立[j].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013(4):106-110.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的傳染性脾腎壞死病毒（isknv）（付小哲,李寧求,林強(qiáng),等.鱖傳染性脾腎壞死病毒主衣殼蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[j].水產(chǎn)學(xué)報,2016(3):363-370.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）（王慶,曾偉偉,劉春,等.大口黑鱸虹彩病毒雙重pcr檢測方法的建立[j].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013(4):106-110.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的鯉春病毒血癥病毒(svcv)（徐進(jìn),周勇,陳倩,等.鯉春病毒血癥病毒糖蛋白的截短表達(dá)及其免疫原性分析[j].中國水產(chǎn)科學(xué),2016,23(2):352-358.）公眾可從中華人民共和國中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的pmd18-t載體為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品，貨號d101a。

下述實(shí)施例中的鏈霉親和素包被的磁珠為streptavidinsepharose^?highperformance為gehealthcare產(chǎn)品，貨號為17-5113-01。

下述實(shí)施例中的變性緩沖液（pyromarkdenaturationsolution）為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979007。

下述實(shí)施例中的沖洗緩沖液（pyromarkwashbuffer）為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979008。

下述實(shí)施例中的退火緩沖液（pyromarkannealingbuffer）可為德國qiagen產(chǎn)品，貨號為979009。

實(shí)施例1、用于檢測鯉皰疹病毒3型引物的制備

檢測鯉皰疹病毒3型（cyhv-3）指紋序列的物質(zhì)包括鯉皰疹病毒3型指紋序列的測序引物cyhv-3-s和擴(kuò)增鯉皰疹病毒3型指紋序列的引物對cyhv-3-p。鯉皰疹病毒3型指紋序列為序列表中seqidno.1的第2355-2389位核苷酸。cyhv-3-s為序列表中seqidno.4所示的單鏈dna；cyhv-3-p為由序列表中seqidno.2所示的單鏈dna（cyhv-3-p-f）和seqidno.3所示的單鏈dna（cyhv-3-p-r）組成的引物對，cyhv-3-p-r的5′端有生物素標(biāo)記，cyhv-3-p的擴(kuò)增產(chǎn)物為序列表中seqidno.1的第2265-2518位核苷酸所示的dna分子，擴(kuò)增產(chǎn)物為254bp。其中，seqidno.1為鯉皰疹病毒3型dna聚合酶基因的dna序列（ncbi中的登錄號為dq657948.1）。

表1、cyhv-3的指紋序列和引物

實(shí)施例2、cyhv-3-p擴(kuò)增條件的優(yōu)化

1、重組載體的構(gòu)建

將pmd18-t載體與seqidno.1的第2265-2518位核苷酸所示的dna分子所示的核苷酸序列進(jìn)行連接，保持pmd18-t載體的其他序列不變，得到重組載體，將該重載載體命名為pmd18-t-cyhv-3。

2、cyhv-3-p擴(kuò)增條件的優(yōu)化

以下述pcr擴(kuò)增體系對cyhv-3-p的擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化：濃度為50ng/μl的pmd18-t-cyhv-3載體4μl，5×buffer5μl，2.5mmdntp4ul，5u/μlrtaq酶0.5μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2μl，depc水補(bǔ)足體積至50μl。

優(yōu)化的cyhv-3-p擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環(huán)；72℃延伸7min，4℃結(jié)束。

實(shí)施例3、焦磷酸測序法鑒定cyhv-3

提取cyhv-3的dna，分別得到濃度均為50ng/μl的cyhv-3dna。

1、焦磷酸測序法鑒定cyhv-3

1.1pcr擴(kuò)增

50μlpcr擴(kuò)增體系：濃度為50ng/μl的的cyhv-3dna4μl，5×buffer5μl，2.5mmdntp4ul，5u/μlrtaq酶0.5μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2μl，depc水補(bǔ)足體積至50μl。

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環(huán)；72℃延伸7min，4℃結(jié)束。

將得到的pcr產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結(jié)果表明，pcr擴(kuò)增得到了254bp的pcr產(chǎn)物。

1.2焦磷酸測序

將50μl步驟1.1的pcr產(chǎn)物與2μl的鏈霉親和素包被的磁珠混合后，在室溫充分混勻10分鐘。，開啟真空泵吸取結(jié)合珠及pcr產(chǎn)物混懸液，然后依次在70%乙醇、變性緩沖液（pyromarkdenaturationsolution）和沖洗緩沖液（pyromarkwashbuffer）中清洗5s。關(guān)閉真空泵，后將探頭上結(jié)合珠及pcr產(chǎn)物置入40ul退火緩沖液（pyromarkannealingbuffer）(含測序引物10umol/l1.5ul)，85℃變性2min，冷卻至室溫，使引物與模板退火雜交。

根據(jù)pyrosequencing軟件序列設(shè)計信息所計算出劑量，在試劑艙中依次加入底物混合物、酶混合物及四種dntp(qiagen)，將試劑艙及96孔反應(yīng)板放入pyrosequencing檢測儀(pyromarkq96id，qiagen)進(jìn)行反應(yīng)，讀取dna序列，所測序列包含cyhv-3指紋序列“ccgcttcgagacctacacggcgtctagcctcaacc”，結(jié)果表明，cyhv-3指紋序列、cyhv-3-p及cyhv-3-s可用來鑒定cyhv-3。

實(shí)施例4、cyhv-3-p與cyhv-3-s的特異性實(shí)驗(yàn)

提取鯉皰疹病毒2型（cyhv-2）、大口黑鱸虹彩病毒（lmbv）和傳染性脾腎壞死病毒（isknv）的dna，得到濃度均為50ng/μl的cyhv-2、lmbv和isknv的總dna；提取草魚呼腸孤病毒（gcrv）和鯉春病毒血癥病毒（svcv）的rna，分別得到濃度均為50ng/μl的gcrv和svcv的總rna，反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈。

1、cyhv-3-p與cyhv-3-s的特異性

1.1pcr擴(kuò)增

50μlpcr擴(kuò)增體系：實(shí)施例3的cyhv-3總dna4μl，濃度為50ng/μl的pmd18-t-cyhv-3載體4μl，5×buffer5μl，2.5mmdntp4ul，5u/μlrtaq酶0.5μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2μl，depc水補(bǔ)足體積至50μl。

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環(huán)；72℃延伸7min，4℃結(jié)束。pcr擴(kuò)增結(jié)束后得到cyhv-3的pcr產(chǎn)物。

按照上述方法，將實(shí)施例3的cyhv-3總rna分別替換為上述cyhv-2總dna、lmbv總dna和isknv總dna，gcrvcdna和svcvcdna，其他步驟均不變，分別得到cyhv-2的pcr產(chǎn)物、lmbv的pcr產(chǎn)物、isknv的pcr產(chǎn)物、gcrv的pcr產(chǎn)物和svcv的pcr產(chǎn)物。

將上述pcr產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖3），結(jié)果表明，只有cyhv-3的pcr產(chǎn)物中有254bp的條帶，表明cyhv-3-p只有以cyhv-3的dna為模板才能擴(kuò)出目的條帶。

1.2焦磷酸測序

按照實(shí)施例3步驟1中1.2的焦磷酸測序的方法，分別以cyhv-3-s為測序引物對本實(shí)施例步驟1的1.1得到的cyhv-3的pcr產(chǎn)物、cyhv-2的pcr產(chǎn)物、lmbv的pcr產(chǎn)物、isknv的pcr產(chǎn)物、gcrv的pcr產(chǎn)物和gcrv的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，只有cyhv-3的pcr產(chǎn)物的測序結(jié)果有如圖2所示的測序峰型，其余的pcr產(chǎn)物均沒有圖2所示的測序峰型，表明只有cyhv-3的pcr產(chǎn)物含有cyhv-3指紋序列，其余的pcr產(chǎn)物均不含cyhv-3指紋序列。

結(jié)果表明，cyhv-3-p及cyhv-3-s可特異識別cyhv-3。

實(shí)施例5、cyhv-3-p的靈敏度實(shí)驗(yàn)

1、cyhv-3-p的靈敏度

將實(shí)施例2步驟1的重載載體pmd18-t-cyhv-3用depc水進(jìn)行稀釋，分別得到

10⁷拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10⁶拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10⁵拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10⁴拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10³拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10²拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3和1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3。。

50μlpcr擴(kuò)增體系：10⁷拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-34μl，5×buffer5μl，2.5mmdntp4ul，5u/μlrtaq酶0.5μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-f2μl，濃度為10mmol/l的cyhv-3-p-r2μl，depc水補(bǔ)足體積至50μl。

擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，50次循環(huán)；72℃延伸7min，4℃結(jié)束。pcr擴(kuò)增結(jié)束后得到cyhv-3的10⁷拷貝pcr產(chǎn)物。

按照上述方法，將10⁷拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3分別替換為10⁶拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10⁵拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10⁴拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10³拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10²拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、10拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3、1拷貝/μl的pmd18-t-cyhv-3和depc水，其他步驟均不變，分別得到cyhv-3的10⁶拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10⁵拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10⁴拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10³拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10²拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的1拷貝pcr產(chǎn)物和陰性對照pcr產(chǎn)物。

將上述pcr產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖4），結(jié)果顯示，cyhv-3的10⁷拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10⁶拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10⁵拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10⁴拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10³拷貝pcr產(chǎn)物、cyhv-3的10²拷貝pcr產(chǎn)物均有254bp的條帶，陰性對照pcr產(chǎn)物中無該條帶，表明，cyhv-3-p最低能檢測到濃度為10²拷貝/50μl的cyhv-3，說明cyhv-3-p最低能檢測到濃度為100個cyhv-3基因組拷貝數(shù)/μl（即0.8fgcyhv-3基因組/μl（請指明病毒核酸濃度））。