一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 錦鯉作為觀賞魚的一個(gè)大類，體型優(yōu)美、色彩艷麗，在國內(nèi)已大量養(yǎng)殖，是目前休 閑漁業(yè)的主要品種。隨著養(yǎng)殖環(huán)境越來越惡劣，錦鯉的各種傳染性疾病例如鯉春病毒血癥、 皰疹病毒性乳頭瘤、錦鯉皰疹病毒病等開始廣泛傳播，亟需各種疫病檢測方法的建立，而抗 錦鯉免疫球蛋白IgM單克隆抗體的成功制備將為錦鯉各種疫病的免疫學(xué)診斷提供重要材 料。
[0003] 抗體是脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)在抗原的刺激下，由淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)的抗 原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白，哺乳動(dòng)物中已經(jīng)報(bào)道的免疫球蛋白包括:免疫球蛋白Μ (IgM)，免疫球蛋白D(IgD)，免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)，魚 類雖然是低等的脊椎動(dòng)物，但是其免疫系統(tǒng)同樣可以產(chǎn)生不同類型的免疫球蛋白，硬骨魚 類中已經(jīng)報(bào)道的免疫球蛋白包括IgM、IgD、IgZ和IgT，IgM是一類存在于所有有頌類脊椎動(dòng) 物中的抗體。
[0004] 當(dāng)前，對(duì)于錦鯉皰疹病毒的檢測，最為常用的方法是基于PCR擴(kuò)增技術(shù)的各種分子 生物學(xué)檢測方法，具有較高的敏感性和特異性。但這些分子生物學(xué)方法都是檢測病毒的核 酸存在與否，方法單一，經(jīng)常導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果，難于對(duì)該病做到定量檢測與確診。 因此，急需其它方法來彌補(bǔ)分子生物學(xué)檢測方法的不足，如各種免疫學(xué)(血清學(xué))檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一株雜交瘤細(xì)胞株A5-E10,已于2016年1月14日保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC N0:C2015218。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種由上述保藏編號(hào)為CCTCC N0:C2015218的雜交瘤 細(xì)胞株分泌產(chǎn)生的抗錦鯉免疫球蛋白IgM單克隆抗體。
[0007] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體，其可特異性識(shí)別錦鯉免疫球蛋白IgM，效價(jià) 高于1:10000。所述單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2015218的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn) 生。
[0009] 一株雜交瘤細(xì)胞株，已于2016年1月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CHINA CENTER FOR TYPE CULTURE C0LLECTI0N，CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC N0:C2015218,保藏地 址為：中國，武漢，武漢大學(xué)。
[0010] 上述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉免疫球蛋白IgM的免疫檢測工具中的應(yīng) 用。
[0011] 上述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉皰疹病毒的免疫檢測工具中的應(yīng)用。
[0012] 所述免疫檢測工具包括試劑、試劑盒、芯片或試紙。
[0013] 一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測試劑盒，其包括上述的抗錦鯉免疫球蛋白IgM的 單克隆抗體。
[0014] 所述試劑盒中還包括:包被液、標(biāo)準(zhǔn)血清、洗滌液、HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體、TMB顯色液 和終止液。
[0015] 一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法，包括如下步驟： (1) 加樣:將待檢樣品加入包被有KHV病毒的酶標(biāo)板中； (2) 溫育：用封板膜封板后置36~38°C溫箱中孵育 (3) 洗滌:將樣品從每個(gè)孔中吸出，用PBST洗滌； (4) 加入鼠抗錦鯉IgM抗體:將稀釋好的抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體加入上述 步驟(3)洗滌好的酶標(biāo)板中； (5) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (6) 加入二抗:將稀釋好的HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體加入上述步驟(5)中洗滌好的酶標(biāo)板中； (7) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (8) 顯色:往反應(yīng)孔中加入TMB顯色劑，36~38°C避光顯色； (9) 測定及結(jié)果判斷。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株及所分泌的抗錦鯉IgM單克隆抗體具有以下優(yōu)點(diǎn)： 1) 本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株由SP2/0細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞與免疫了錦鯉免疫球蛋白IGM的小 鼠脾細(xì)胞融合而獲得； 2) 該雜交瘤細(xì)胞株能夠無限增殖并持續(xù)產(chǎn)生抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體； 3) 本發(fā)明的抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體可以特異性識(shí)別錦鯉免疫球蛋白IGM; 4) 本發(fā)明的抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體特異性強(qiáng)效價(jià)高。
【附圖說明】
[0017] 圖1為純化的錦鯉免疫球蛋白的SDS-PAGE膠檢測圖（1為Marker，2為錦鯉IgM)。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0019] 實(shí)施例1抗錦鯉免疫球蛋白IGM單克隆抗體的制備和純化 材料與方法 實(shí)驗(yàn)材料 試驗(yàn)錦鯉來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，體長20cm;其他化學(xué)試劑為分 析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。
[0020] 1錦鯉IgM純化 1.1斷尾采取錦鯉血液，置于玻璃管中，于室溫下凝固，先于37°C下放置2h，再于4°C放 置過夜，待血清充分析出后，3000g/min離心10min,取其上清。
[0021] 1.2純化:將魚血清12000rpm離心20 min，取上清;對(duì)上清液測量體積;邊攪拌邊慢 慢加入飽和硫酸銨溶液到上清液中，至最終飽和度為33%;將溶液放在磁力攪拌器上攪拌過 夜(4°C)，使蛋白質(zhì)充分沉淀;蛋白質(zhì)溶液10000 rpm離心30min(4°C)，將上清移至干凈管 中，沉淀用適量的1XTOS溶解，放入透析袋(8000-14000kd)在1XPBS透析24-48小時(shí)(4°C)， 每隔3-6小時(shí)換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸銨;透析后溶液5000rpm離心10min，上 清轉(zhuǎn)到干凈管中，并取小樣備用;在之前的硫酸銨沉淀離心上清溶液中，繼續(xù)緩慢添加飽和 硫酸銨至飽和度為50%;將溶液放在磁力攪拌器上攪拌過夜(4°C)，使蛋白質(zhì)充分沉淀;蛋白 質(zhì)溶液10000 rpm離心30min(4°C)，將上清移至干凈管中，沉淀備用；將沉淀溶于少量 1XPBS中，沉淀溶解后放入透析袋在lXroS透析24-48小時(shí)(4°C)，每隔3-6小時(shí)換透析緩 沖液一次，以徹底除去硫酸銨;透析之后的溶液5000rpm離心10min，取上清轉(zhuǎn)到干凈管中， 并取小樣備用;對(duì)兩次飽和度的留取小樣進(jìn)行電泳檢測;之后將50%硫酸銨沉淀的透析上清 過Protein A柱進(jìn)行純化(通過填料和上清混合后于搖床上搖晃反應(yīng)4h)。
[0022] 1.3純化后IgM的檢測:通過SDS-PAGE電泳檢測血清中IgM的純化效果，樣品與等體 積樣品緩沖液混合后后，100°C沸水水浴3-5min，經(jīng)離心后上樣。分離膠濃度為12%，電泳電 壓為100V，電泳時(shí)間為lh，電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色。
[0023] 檢測結(jié)果表明，經(jīng)Protein A親和層析柱純化的樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，得到大小 約為75kD與25kD的兩條帶，與預(yù)期的錦鯉IgM重鏈和輕鏈分子量相近。
[0024] 2動(dòng)物免疫 以上述純化的錦鯉IgM為特異性抗原免疫6周齡BALB/c小鼠，取6只6周齡雌性BALB/c小 鼠皮下注射抗原，第一次免疫將抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，l〇〇ug /只；兩周后進(jìn)行第 二次免疫，抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射，50ug /只；兩周后進(jìn)行第三次免疫， 免疫方法及劑量同第二次免疫。第三次免疫一周后，小鼠斷尾采血測其效價(jià)，第三次免疫兩 周后，選擇效價(jià)最高的小鼠，用不加佐劑的抗原加強(qiáng)免疫，3 d后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞 融合。
[0025] 3小鼠融合 3.1小鼠骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞融合 將生長狀態(tài)良好的SP2/0細(xì)胞，吹打下來后，lOOOrpm離心5min;棄去上清，用20-40ml預(yù) 熱的1640培養(yǎng)液重懸，lOOOrpm離心5min;重復(fù)上述步驟;棄去上清，加入適量預(yù)熱的1640培 養(yǎng)液重懸沉淀;取50ul細(xì)胞懸液與150ul臺(tái)盼藍(lán)混勻后，于顯微鏡下檢活計(jì)數(shù);每個(gè)融合取1 X107個(gè)細(xì)胞，與處理好的1X108個(gè)脾細(xì)胞在進(jìn)口的50ml離心管中混合均勻后，1350rpm離心 7min;用抽液栗抽干上清;有節(jié)奏的在超凈臺(tái)桌面上敲打離心管底部，使沉淀松動(dòng)呈糜狀； 沿著離心管底部的管壁，緩慢加入lml預(yù)熱的PEG，并用槍頭順時(shí)針方向攪拌，同時(shí)離心管保 持逆時(shí)針方向轉(zhuǎn)動(dòng)。該步驟需在60-90s內(nèi)完成;將離心管靜置30-60s;沿管壁緩慢滴加5ml 預(yù)熱的1640培養(yǎng)液，再逐漸加快速度，加入15ml預(yù)熱的1640培養(yǎng)液，再加入20ml SP2/0骨髓 瘤細(xì)胞培養(yǎng)液；1200rpm離心5min;棄去上清，將細(xì)胞重懸至100ml預(yù)熱的含15% FBS 1*HAT 的1640細(xì)胞培養(yǎng)液中，100ul/孔的量將混合細(xì)胞懸液鋪到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上。然后將培養(yǎng) 板置37°C 5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);5 d后用新鮮的HAT培養(yǎng)基換出一半培養(yǎng)基；10 d后用預(yù)熱 的HT換出HAT;觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其細(xì)胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積 的1/10以上時(shí)，吸取適量細(xì)胞上清進(jìn)行ELISA檢測，兩次檢測結(jié)果為陽性設(shè)為陽性克隆孔。 [0026] 3·2多克隆細(xì)胞株的ELSIA檢測 包板：用Coating buffer稀釋抗原至lug/ml，以50ul/孔的量鋪到酶標(biāo)板上，輕輕振搖 使包被液鋪滿孔底，4°C包被過夜;次日棄去包被液，用TOST以200ul/孔洗1遍，在吸水紙上 拍干； 封閉：以60ul/孔加入1% BSA，37°C封閉lh; 一抗(加樣）:將稀釋好的樣品以50ul/孔加入到酶標(biāo)板上，同時(shí)設(shè)置好陽性對(duì)照與陰性 對(duì)照(對(duì)照組需做復(fù)孔），37°C作用lh;用PBST以200ul/孔清洗2遍； 二抗：用1%BSA稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，1:10000稀釋，以50ul/孔