加入到酶標(biāo)板上， 37°C作用45min;用PBST以200ul/孔清洗3遍； 顯色：每孔加入l〇〇ul的TMB顯色液(臨用前配）；37°C孵育15min; 終止反應(yīng):每孔加入l〇〇ul的2M H2S〇4以終止反應(yīng)； 讀數(shù):在酶標(biāo)儀上測定〇D450nm讀數(shù);分析所得數(shù)據(jù)，一般ELSIAM). 3認(rèn)為是陽性，如果 陽性值較多的，則會從高挑選，一般會選ELSIA> 1.0的陽性值。結(jié)果篩選出46個陽性細(xì)胞株； 對其中8個利用WesternBlot檢測方法進(jìn)一步篩選多克隆細(xì)胞株，根據(jù)結(jié)果選擇條帶最亮的 6個細(xì)胞株進(jìn)行挑選單克隆細(xì)胞株。
[0027] 4單細(xì)胞克隆株的篩選 4.1單克隆細(xì)胞株的ELSIA檢測 ELISA檢測方法同3.2。
[0028]結(jié)果篩選出31個陽性細(xì)胞株;對其中9個利用Western Blot檢測方法進(jìn)一步篩選 單克隆細(xì)胞株，根據(jù)結(jié)果選擇條帶最亮兩個單克隆細(xì)胞株制備腹水。
[0029] 4.2單細(xì)胞克隆株的亞型分析 包板：用Coating buffer稀釋抗原至lug/ml，以50ul/孔的量鋪到酶標(biāo)板上，輕輕振搖 使包被液鋪滿孔底，4°C包被過夜;次日棄去包被液，用TOST以200ul/孔洗1遍，在吸水紙上 拍干;封閉：以60ul/孔加入1%BSA，37°C封閉lh;將稀釋好的羊抗鼠分型二抗以50ul/孔加 入到酶標(biāo)板上，37°C作用lh;用PBST以200ul/孔清洗2遍;加二抗：用1%BSA稀釋羊抗鼠 HRP 二抗1:10000稀釋，以50ul/孔加入到酶標(biāo)板上，37°C作用45min;用TOST以200ul/孔清洗3 遍；顯色：每孔加入100ul的TMB顯色液（臨用前配）；37°C孵育15min;終止反應(yīng):每孔加入 100ul的2M H2S〇4以終止反應(yīng);讀數(shù):在酶標(biāo)儀上測定0D450nm讀數(shù);結(jié)果發(fā)現(xiàn)A5-E10單克隆 細(xì)胞株為 IgG2a，icchain。
[0030] 雜交瘤細(xì)胞株A5-E10，已于2016年1月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號為CCTCC N0:C2015218。
[0031] 4.3單細(xì)胞克隆株的腹水效價分析 ELISA檢測方法同3.2。
[0032]結(jié)果發(fā)現(xiàn)將腹水稀釋比例為1:240000時的吸光值都大于1。
[0033] 5單抗純化 取4只BALB/C小鼠，每只注射0.5ml石蠟油，7天后取雜交瘤細(xì)胞(效價較高同時細(xì)胞狀 態(tài)好)重懸于無血清培養(yǎng)基中，按1 X 1〇6個細(xì)胞/0.5ml/只量注射石蠟小鼠，注射細(xì)胞約7-14d后收集腹水。用50mM PBS預(yù)處理protein G親和層析柱;將腹水樣品上柱，收集流穿液； 加入PH3.0、0.1M甘氨酸-HC1洗脫，通過SDS-PAGE膠檢測純化后抗體的純度。結(jié)果表明，通 過protein G親和柱純化的抗體，其效價高于1:10000(表1)。
[0034]表1單抗效價分析
實施例2錦鯉皰疹病毒間接ELI SA檢測方法的建立 1.抗原工作濃度的確定 將純化的錦鯉皰疹病毒用包被液(PH8.6)稀釋為50yg/mL、30yg/mL、10yg/mL濃度梯 度，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100uL，4°C濕盒包被過夜。每孔加入300 yL 10%的脫脂乳進(jìn) 行封閉，37°C溫箱中孵育1 h，用TOST洗滌3次，每次3-5 min。將抗KHV陽性血清、錦鯉陰 性血清進(jìn)行1:300倍稀釋，每孔加入100 uL進(jìn)行ELISA方陣試驗，37°C溫箱中孵育1 h，用 PBST洗滌3次，每次3-5 min。將上述制備的鼠抗錦鯉IgM抗體1:2000，每孔100此，37°(：溫 箱中孵育lh，用PBST洗滌3次，每次3-5 min。加入50 yL顯色底物(TMB)，37°C避光顯色10 min。用50 yL 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。測定各孔OD45〇nm值，確定抗原工作濃度。
[0035]方陣滴定結(jié)果表明，當(dāng)抗原包被濃度為50yg/mL P/N值最大，陽性血清0D45Qnm值高 于1. 〇，陰性血清〇D45〇nm值小于0.2。因此，確定抗原的最適包被濃度為50 yg/mL。
[0036] 2.最佳封閉液和封閉時間的確定 分別選擇1%脫脂奶粉、2.5%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉和1% BSA為封閉液進(jìn) 行封閉試驗。選擇最佳封閉液在37°C溫箱中分別封閉30min、60min、90min、120min，確定最 佳封閉時間。
[0037]結(jié)果表明，用10%脫脂奶粉作為封閉液的P/N值最高，而且陽性血清0D45Qnm值大于 1.0，陰性血清0D45Q?值小于0.2，封閉效果最好。在37°C條件下封閉60min時P/N值最高。 [0038] 3.錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法的建立 (1)包被:采用包被液將純化的KHV病毒稀釋到50yg/mL，包被96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 yL，4°C濕盒包被過夜。
[0039] (2)封閉：每孔加入300 yL 10%的脫脂乳進(jìn)行封閉 (3)樣品準(zhǔn)備：用一次性注射器采取錦鯉血液，置于離心管中，于室溫下凝固，先于37°C 下放置2h，再于4°C放置過夜，待血清充分析出后，3000g/min離心10min,取其上清，作為 檢測樣品。
[0040] (4)加樣:將上述步驟(5)制備的檢測樣品用roST(pH7.4)按1:300進(jìn)行稀釋，將稀 釋好的樣品按?〇〇μL7孔的量加入上述步驟封閉好的酶標(biāo)板中。
[0041 ] (5 )溫育：用封板膜封板后置37 °C溫箱中孵育1 h。
[0042] (6)洗滌:將樣品從每個孔中吸出，用PBST洗滌3次，每次3-5 min。
[0043] (7)鼠抗錦鯉IgM抗體的稀釋:將鼠抗錦鯉IgM抗體用PBST(pH7.4)作1:2000稀 釋。
[0044] (8)加入鼠抗錦鯉IgM抗體:將稀釋好的鼠抗錦鯉IgM抗體按100 uL/孔的量加入 上述步驟(6)中洗滌好的酶標(biāo)板中。
[0045] (9)溫育：同步驟(5); (10) 洗滌：同步驟(6); (11) 酶標(biāo)二抗的稀釋:將酶標(biāo)二抗用roST(pH7.4)作1:5000稀釋。
[0046] (12)加入二抗:將稀釋好的酶標(biāo)二抗按lOOyL/孔的量加入上述步驟(10)中洗滌好 的酶標(biāo)板中。
[0047] (13)溫育：同步驟(5); (14) 洗滌：同步驟(6); (15) 顯色：加入新鮮配制的底物溶液(TMB: H2〇2=l: 1) 50μ!7孔，用封板膜封板后置37 °〇避光顯色lOmin。
[0048] (16)終止:加入50uL/孔2M的H2S〇4終止液，終止反應(yīng)。
[0049] (17 )測定:采用波長450nm的酶標(biāo)儀測定0D值。
[0050] ( 18)結(jié)果判斷:0D45Qr?2 0 · 20時判定為陽性 以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本發(fā)明 精神的范圍內(nèi)所進(jìn)行的任何顯而易見的變化和改進(jìn)，都應(yīng)被視為本發(fā)明的一部分。
【主權(quán)項】
1. 一種抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體，其可特異性識別錦鯉免疫球蛋白IgM，效 價高于1:10000。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗錦鯉免疫球蛋白IgM的單克隆抗體，其特征在于，所述單克 隆抗體由保藏編號為CCTCC N0:C2015218的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。3. -株雜交瘤細(xì)胞株，已于2016年1月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 為CCTCC N0:C2015218。4. 權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉免疫球蛋白IgM的免疫檢測工 具中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體在制備用于檢測錦鯉皰疹病毒的免疫檢測工具中 的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述免疫檢測工具包括試劑、試劑盒、 芯片或試紙。7. -種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測試劑盒，其包括權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑 盒中還包括:包被液、標(biāo)準(zhǔn)血清、洗滌液、HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體、TMB顯色液和終止液。9. 一種錦鯉皰疹病毒間接ELISA檢測方法，包括如下步驟： (1) 加樣:將待檢樣品加入包被有KHV病毒的酶標(biāo)板中； (2) 溫育：用封板膜封板后置36~38°C溫箱中孵育 (3) 洗滌:將樣品從每個孔中吸出，用PBST洗滌； (4) 加入鼠抗錦鯉IgM抗體:將稀釋好的權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體加入上述步 驟(3)洗滌好的酶標(biāo)板中； (5) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (6 )加入二抗:將稀釋好的HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體加入上述步驟(5 )中洗滌好的酶標(biāo)板中； (7) 溫育、洗滌，同步驟(2)和(3); (8) 顯色:往反應(yīng)孔中加入TMB顯色劑，36~38°C避光顯色； (9) 測定及結(jié)果判斷。
【專利摘要】本發(fā)明公開了抗錦鯉IgM的單克隆抗體、雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。所述抗錦鯉IgM的單克隆抗體是由保藏編號為？CCTCC？NO：C2015218？的雜交瘤細(xì)胞株A5-E10分泌產(chǎn)生的。利用所述的單克隆抗體可以用于錦鯉或普通鯉魚某病原或水產(chǎn)疫苗特異性抗體的檢測，從而進(jìn)行疾病的早期診斷和疫苗使用效果的評價，對錦鯉或普通鯉魚疾病流行病學(xué)調(diào)查、病原診斷具有較高的臨床使用及推廣價值，為其他養(yǎng)殖魚類疾病的防治提供參考。CCTCC NO: C201521820160114
【IPC分類】C07K16/42, C12R1/91, G01N33/569, G01N33/577, C12N5/20
【公開號】CN105646715
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】李瑩瑩, 王慶, 曾偉偉, 王英英, 劉春 , 鄭樹城, 石存斌, 宋新建, 黃琦雯
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2016年1月19日