本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于豬delta冠狀病毒(pdcov)檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

豬delta冠狀病毒(porcinedeltacoronavirus，pdcov)屬于冠狀病毒科(coronaviridae)冠狀病毒亞科(coronavirinae)丁型冠狀病毒屬，最先由香港大學(xué)的woo等于2012年從死亡鳥(niǎo)類、雞、哺乳動(dòng)物得到的7140個(gè)樣本中檢測(cè)到50多個(gè)冠狀病毒陽(yáng)性樣本，其中七種為新發(fā)現(xiàn)的丁型冠狀病毒(woo,patrickc.y.etal.“discoveryofsevennovelmammalianandaviancoronavirusesinthegenusdeltacoronavirussupportsbatcoronavirusesasthegenesourceofalphacoronavirusandbetacoronavirusandaviancoronavirusesasthegenesourceofgammacoronavirusanddeltacoronavirus.”journalofvirology86.7(2012):3995–4008.pmc.web.10apr.2017.)。pdcov是唯一一種感染非禽類的丁型冠狀病毒。此后，美國(guó)、韓國(guó)、中國(guó)大陸等許多國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)了pdcov。pdcov能夠引起豬的腸道疾病，導(dǎo)致腹瀉、嘔吐和脫水，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)50％～100％，尤以哺乳階段仔豬發(fā)病最為嚴(yán)重。

盡管woo等人在2012年就從臨床樣品中檢測(cè)到pdcov，但并沒(méi)有分離到病毒，也沒(méi)有對(duì)該病毒進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。2014年1-2月，在美國(guó)爆發(fā)仔豬腹瀉期間，研究人員從俄亥俄州、愛(ài)荷華州、伊利諾斯州發(fā)生腹瀉的豬場(chǎng)檢測(cè)到pdcov，而且這些豬場(chǎng)的豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒等幾種常見(jiàn)的引起腹瀉的病毒均為陰性，提示pdcov具有較強(qiáng)的致病性。全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，與2012年香港檢測(cè)到的兩株pdcov(huk15-44和huk15-155)同源性高達(dá)99％。隨后，在美國(guó)的明尼蘇達(dá)、南達(dá)科他等9個(gè)州均檢測(cè)到pdcov感染。目前，美國(guó)有近19個(gè)州發(fā)生pdcov感染，表明pdcov在美國(guó)主要養(yǎng)豬地區(qū)普遍流行。

2014年4月，在韓國(guó)、加拿大發(fā)生腹瀉的仔豬糞便中也檢測(cè)到pdcov，與美國(guó)分離株同源性達(dá)99.7％以上(lees,leec.completegenomecharacterizationofkoreanporcinedeltacoronavirusstrainkor/knu14-04/2014.genomeannouncements.2014,2.)。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肖少波課題組對(duì)2013-2014年間采自湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等省市規(guī)模化豬場(chǎng)的258份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到21份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為14.3％，首次證實(shí)pdcov在我國(guó)豬場(chǎng)中存在。對(duì)檢測(cè)的部分陽(yáng)性樣品進(jìn)行全基因組分析，發(fā)現(xiàn)我國(guó)大陸豬場(chǎng)中的pdcov同樣與2012年香港檢測(cè)到的pdcovhuk15-155株具有較高的同源性(dongn,fangl,zengs,etal.porcinedeltacoronavirusinmainlandchina[j].emerginginfectiousdiseases,2015,21(12):2254-5.)。最近，國(guó)內(nèi)學(xué)者song等采用建立的巢式rt-pcr檢測(cè)了2012-2015年間從江西省采集的356份臨床樣品，pdcov的陽(yáng)性率高達(dá)33.71％(songd,zhoux,pengq,etal.newlyemergedporcinedeltacoronavirusassociatedwithdiarrhoeainswineinchina:identification,prevalenceandfull-lengthgenomesequenceanalysis.[j].transboundaryandemergingdiseases,2015,62(6):575.)。迄今為止，genbank中共收錄了25條來(lái)源于美國(guó)、中國(guó)、韓國(guó)的pdcov全基因組序列，進(jìn)化系統(tǒng)樹(shù)分析顯示這些毒株的同源性很高。

由于pdcov與pedv、tgev等其它豬腸道冠狀病毒感染引起的臨床癥狀非常相似并且存在混合感染，對(duì)該病毒的診斷主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。pdcov是近幾年才發(fā)現(xiàn)的病毒，到目前為止的研究報(bào)道較少，目前已經(jīng)建立的pdcov普通rt-pcr、巢式rt-pcr等，其靈敏度相對(duì)較低。逄鳳嬌等(逄鳳嬌,張柏猛,何孔旺,等.豬δ冠狀病毒m基因rt-pcr檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[j].畜牧與獸醫(yī),2016,48(9):50-53.)針對(duì)pdcovm蛋白基因片段設(shè)計(jì)特異性引物建立的rt-pcr方法，最低可檢出量為6.33×10⁴拷貝/μl。國(guó)內(nèi)尚未有熒光rt-pcr應(yīng)用于pdcov檢測(cè)的報(bào)道。雖然各研究小組已建立了不同的pdcov實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，也成功得到了部分國(guó)家地區(qū)的pdcov流行情況數(shù)據(jù)，但到目前為止并沒(méi)有穩(wěn)定的商品化檢測(cè)試劑盒可供使用，大范圍的臨床檢測(cè)仍有困難，且除中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)外，其他國(guó)家pdcov的流行情況依然未知。基于此，需要建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)的熒光定量pcr檢測(cè)方法，并使其成為掌握pdcov流行病學(xué)資料的一個(gè)重要手段顯得尤其必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服目前對(duì)pdcov的檢測(cè)基本都采用普通rt-pcr、巢式rt-pcr方法所具有的靈敏度低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)的缺陷，而提供一種檢測(cè)豬delta冠狀病毒的試劑盒、引物對(duì)以及檢測(cè)方法。該方法采用taqman探針?lè)?，在閉管狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而致的假陽(yáng)性；探針雜交特異性更強(qiáng)、靈敏度更高；pcr后無(wú)需后續(xù)處理，操作更簡(jiǎn)單快速，安全無(wú)污染；對(duì)樣品中含微量pdcov基因組的檢測(cè)效果良好，可用于pdcov的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查。

熒光taqman技術(shù)的基本原理是利用taq酶的5’外切酶活性，合成一個(gè)能與pcr產(chǎn)物雜交的探針，該探針的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(r)，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)。探針在無(wú)特異性pcr發(fā)生時(shí)，3’端熒光淬滅基團(tuán)能夠吸收或抑制5’端熒光報(bào)告基團(tuán)(r)發(fā)出的熒光，熒光信號(hào)不改變；當(dāng)有特異性pcr發(fā)生時(shí)，探針會(huì)在pcr過(guò)程中被taq酶的5’—>3’的外切酶活性作用切斷(切口平移效應(yīng))，淬滅基團(tuán)的抑制作用消失，從而引起報(bào)告基團(tuán)熒光信號(hào)的增長(zhǎng)。切出的熒光報(bào)告基團(tuán)與pcr產(chǎn)物的數(shù)目是一對(duì)一的，隨著擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來(lái)的熒光基團(tuán)不斷積累。利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)pcr進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。一般來(lái)說(shuō)，實(shí)時(shí)熒光定量pcr法的靈敏度比普通rt-pcr高100倍。本發(fā)明中，發(fā)明人創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)了特異性極強(qiáng)的引物和探針，結(jié)合rt-pcr的優(yōu)勢(shì)，將檢測(cè)病毒的靈敏度較現(xiàn)有技術(shù)中靈敏度大大提高。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一是：一種用于檢測(cè)豬delta冠狀病毒(pdcov)的試劑盒，其包括rt-pcr反應(yīng)體系，所述rt-pcr反應(yīng)體系包括引物探針混合液，所述引物探針混合液包括一引物對(duì)和一探針，所述引物對(duì)的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，所述探針的核苷酸序列如seqidno.3所示。

所述引物的濃度較佳地為200～400nm，更佳地為200nm。所述探針的濃度較佳地為200～400nm，更佳地為400nm。

較佳地，所述rt-pcr反應(yīng)體系還包括rt-pcr反應(yīng)液和酶混合液，所述rt-pcr反應(yīng)液包括mg²⁺、dntp以及pcr反應(yīng)緩沖液，所述酶混合液由逆轉(zhuǎn)錄酶(rt酶)、熱啟動(dòng)taq酶以及rna酶抑制劑(rnasin)組成；

其中，所述mg²⁺的濃度優(yōu)選為1～2.5mmol/l，更優(yōu)選為2.0mmol/l；所述dntp的濃度優(yōu)選為0.1～0.25mmol/l，更優(yōu)選為0.2mmol/l；所述pcr緩沖液優(yōu)選為2×一步法rt-pcr緩沖液(onesteprt-pcrbuffer)(無(wú)mg²⁺)；所述逆轉(zhuǎn)錄酶的用量?jī)?yōu)選為0.5～2u/反應(yīng)，所述熱啟動(dòng)taq酶的用量?jī)?yōu)選為0.1～0.5u/反應(yīng)，所述rna酶抑制劑的用量?jī)?yōu)選為1～3u/反應(yīng)。

更佳地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照優(yōu)選為含有pdcovm基因序列的重組質(zhì)粒，質(zhì)粒由上下游引物擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物通過(guò)市售的載體克隆構(gòu)建而成，所使用的上下游引物序列seqidno.1和seqidno.2，所述陽(yáng)性對(duì)照的濃度優(yōu)選為2.6×10⁶拷貝/μl；所述陰性對(duì)照優(yōu)選為去離子水，更優(yōu)選為depc-h2o。

本發(fā)明所述的試劑盒優(yōu)選為實(shí)時(shí)熒光定量pcr(fq-pcr)試劑盒。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二是：一種用于檢測(cè)豬delta冠狀病毒的引物對(duì)，所述引物對(duì)的一條是如seqidno.1所示序列的核酸，另一條是如seqidno.2所示序列的核酸。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三是：一種檢測(cè)豬delta冠狀病毒的探針，所述探針的核苷酸序列如seqidno.3所示。

較佳地，上述探針為適用實(shí)時(shí)熒光定量pcr的熒光探針，其上述序列的兩端連接的均為常規(guī)的熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。其中，熒光報(bào)告基團(tuán)優(yōu)選為fam，淬滅基團(tuán)優(yōu)選為tamra。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之四是：所述的引物或者所述的探針在制備檢測(cè)豬delta冠狀病毒的試劑盒中的應(yīng)用。較佳地，所述試劑盒為實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案之五是：一種非診斷目的的檢測(cè)豬delta冠狀病毒的方法，其包括如下步驟：

(1)使用rna提取試劑提取待檢樣品中的總rna；

(2)以步驟(1)提取的總rna為模板，利用權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述試劑盒中的rt-pcr反應(yīng)體系進(jìn)行rt-pcr反應(yīng)。

(3)分析檢測(cè)結(jié)果。

其中，所述的rna提取試劑可以是本領(lǐng)域常規(guī)的提取動(dòng)物病毒總rna的試劑，較佳地，所述的rna提取試劑包括樣品裂解液、氯仿、depc-乙醇、異丙醇和depc-h2o中的一種或多種；所述的樣品裂解液優(yōu)選trizol，所述的depc-乙醇優(yōu)選質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為75％的depc-乙醇。

較佳地，步驟(2)中所述rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)條件為：

①42～50℃逆轉(zhuǎn)錄10～15min；②94～95℃10～15min；③94～95℃10～15s；④55～60℃35～60s；③-④循環(huán)40～45次；

步驟(2)所述的熒光rt-pcr反應(yīng)的反應(yīng)過(guò)程為：分別取引物探針混合液1～3μl、rt-pcr反應(yīng)液14～16μl、酶混合液(enzymemix)2～4μl配制成17～22μl反應(yīng)體系，再加入2～8μl步驟(1)所得的rna。將pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照樣品，depc-h2o作為陰性對(duì)照樣品，與待檢樣品rna同時(shí)進(jìn)行熒光rt-pcr反應(yīng)；

步驟(3)所述的分析檢測(cè)結(jié)果的操作過(guò)程為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地，所述的分析檢測(cè)結(jié)果的操作過(guò)程如下：反應(yīng)結(jié)束后，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照呈典型的s型擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線時(shí)，判定檢測(cè)反應(yīng)成立；若檢測(cè)樣品也出現(xiàn)s型擴(kuò)增曲線或擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為檢測(cè)陽(yáng)性，否則判定為陰性。

本發(fā)明的一較佳實(shí)例為：一種用于檢測(cè)pdcov的試劑盒，其包括：

(1)rna提取試劑，包括：

樣品裂解液管：trizol750μl；氯仿管：氯仿200μl；75％乙醇管：75％depc-乙醇800μl；異丙醇管：異丙醇600μl；depc-h2o管：11μl；以上為適合提取1個(gè)樣本的總rna的試劑用量；所述的rna提取試劑需要4℃保存；

(2)rt-pcr反應(yīng)體系，包括：

引物探針混合液管：10μm上、下游引物各0.5μl，10μm探針1μl，合計(jì)2μl；

rt-pcr反應(yīng)液管：2×一步法rt-pcr緩沖液(onesteprt-pcrbuffer)(無(wú)mg²⁺)10μl，25mmmgcl22μl，10mmdntp1μl，depc-h2o2μl，合計(jì)15μl；

酶混合液(enzymemix)管：40u/μlrnasin1μl，25u/μlrt酶1μl，5u/μltaq酶1μl，合計(jì)3μl；

以上為單次反應(yīng)的試劑用量，所述的反應(yīng)體系需要-20℃保存；

(3)陽(yáng)性對(duì)照管：濃度為2.6×10⁶拷貝/μl的pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒5μl；

(4)陰性對(duì)照管：depc-h2o5μl。

上述較佳實(shí)例中，所述的2×一步法rt-pcr緩沖液(onesteprt-pcrbuffer)(無(wú)mg²⁺)、25mmmgcl2、2.5mmdntp混合物和taq酶也可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的試劑盒產(chǎn)品，如可以使用一步法熒光rt-pcr試劑盒(onesteprealtimert-pcrkit)替代上述幾種試劑，優(yōu)選takara公司產(chǎn)品一步法熒光rt-pcr試劑盒(onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime))。

本發(fā)明的一較佳實(shí)例為：一種非診斷目的的用于檢測(cè)pdcov的方法，其是一種采用熒光定量rt-pcr檢測(cè)pdcov的方法，其包括如下步驟：

(1)樣品總rna的提取；

(2)pcr反應(yīng)與結(jié)果分析：分別取引物探針混合液2μl、rt-pcr反應(yīng)液15μl、酶混合液(enzymemix)3μl配制成反應(yīng)體系。

取陰性對(duì)照、標(biāo)本和陽(yáng)性對(duì)照的核酸各5μl，分別加入反應(yīng)體系中使用市售的熒光定量pcr儀(如abi7500)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件為：①42℃逆轉(zhuǎn)錄10min；②94℃15min；③95℃15s；④60℃45s，③-④循環(huán)40次(收集熒光信號(hào))。

反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。

在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明提供的檢測(cè)pdcov的方法采用taqman探針?lè)?，在閉管狀態(tài)下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以及產(chǎn)物檢測(cè)，避免了擴(kuò)增產(chǎn)物污染而致的假陽(yáng)性，探針雜交特異性更強(qiáng)、靈敏度更高，最低檢測(cè)限約為1.3×10¹拷貝/μl，其靈敏度是現(xiàn)有技術(shù)(可檢出量為6.33×10⁴拷貝/μl)的4869倍，對(duì)樣品中含微量pdcov基因組的檢測(cè)效果良好；同時(shí)其操作簡(jiǎn)單、成本低且結(jié)果易于判定，可用于pdcov的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和大規(guī)模的分子流行病學(xué)調(diào)查研究。因此，本發(fā)明的試劑盒、引物對(duì)以及檢測(cè)方法具有很好的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為以引物(f1和r1)和探針p1組合的組合1的熒光rt-pcr的擴(kuò)增曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯。

圖2為以引物(f1和r1)和探針p1組合的組合1的熒光rt-pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增，3個(gè)重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，斜率接近-3.04，相關(guān)系數(shù)r²為0.994。

圖3為以引物(f2和r2)和探針p2組合的組合2的熒光rt-pcr的擴(kuò)增曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯。

圖4為以引物(f2和r2)和探針p2組合的組合2的熒光rt-pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增，3個(gè)重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，斜率接近-2.95，相關(guān)系數(shù)r²為0.983。

圖5為以引物(f3和r3)和探針p3組合的組合3的熒光rt-pcr的擴(kuò)增曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增后出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯。

圖6為以引物(f3和r3)和探針p3組合的組合3的熒光rt-pcr的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl進(jìn)行擴(kuò)增，3個(gè)重復(fù)，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，斜率接近-2.96，相關(guān)系數(shù)r²為0.985。

圖7為本發(fā)明組合1熒光rt-pcr的特異性試驗(yàn)結(jié)果，7份特異性參考品中，僅pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線，其他6份特異性參考品的擴(kuò)增曲線為平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有ct值，可明確判定為陰性；6份特異性參考品分別為pedv疫苗株、tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、kobu病毒陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)等其他豬易造成腹瀉的病原體。

圖8為本發(fā)明組合2熒光rt-pcr的特異性試驗(yàn)結(jié)果，4份特異性參考品(輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、kobu病毒陽(yáng)性樣品、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)的擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有ct值，可明確判定為陰性；其中有3份特異性參考品分別為pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒、pedv疫苗株和tgev疫苗株出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且與基線交叉，有ct值，可判為陽(yáng)性。

圖9為本發(fā)明組合3熒光rt-pcr的特異性試驗(yàn)結(jié)果，5份特異性參考品(tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、kobu病毒陽(yáng)性樣品、大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)的擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有ct值，可明確判定為陰性；其中有2份特異性參考品為pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒、pedv疫苗株出現(xiàn)擴(kuò)增曲線且與基線交叉，有ct值，可判為陽(yáng)性。

圖10為本發(fā)明組合1熒光rt-pcr的敏感性試驗(yàn)結(jié)果，8份靈敏度參考品中濃度為1.3×10⁰拷貝/μl的樣本擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有ct值，可明確判定為陰性。濃度為1.3×10¹拷貝/μl的樣本擴(kuò)增曲線的30≤ct≤35，判為可疑，復(fù)檢后ct值仍為30≤ct≤35，判為陽(yáng)性；其余樣本均可明確判定為陽(yáng)性。

圖11為本發(fā)明組合2熒光rt-pcr的敏感性試驗(yàn)結(jié)果，8份靈敏度參考品中濃度為1.3×10¹拷貝/μl和1.3×10⁰拷貝/μl的樣本擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無(wú)交叉，沒(méi)有ct值，可明確判定為陰性；其余樣本均可明確判定為陽(yáng)性。

圖12為本發(fā)明組合3熒光rt-pcr的敏感性試驗(yàn)結(jié)果，8份靈敏度參考品中濃度為1.3×10¹拷貝/μl和1.3×10⁰拷貝/μl的樣本擴(kuò)增曲線平直且ct值>35，可判定為陰性；其余樣本均可明確判定為陽(yáng)性。

圖13為某豬場(chǎng)pdcov熒光rt-pcr檢測(cè)圖，其中，p為陽(yáng)性對(duì)照；n為陰性對(duì)照；s1～s3為3份豬腸道樣品。

圖14為某豬場(chǎng)pdcov普通rt-pcr電泳圖，其中，m為dl2000marker；p為陽(yáng)性對(duì)照；n為陰性對(duì)照；s1～s3為3份豬腸道樣品。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

下述實(shí)施例中所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

部分試劑和儀器來(lái)源如下：

2×一步法rt-pcr緩沖液(onesteprt-pcrbuffer)(無(wú)mg²⁺)、25mmmgcl2、10mmdntp混合物、40u/μlrna酶抑制劑(rnasin)、5u/μltaq酶、25u/μlrt酶、primescript^tmonesteprt-pcrkitver2.0(dyeplus)、以及一步法熒光rt-pcr試劑盒(onestepprimescript^tmrt-pcrkit(perfectrealtime))均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；

abi7500為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；

pedv疫苗株、tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株均購(gòu)自中牧實(shí)業(yè)股份有限公司。

實(shí)施例1特異性引物和探針的設(shè)計(jì)

針對(duì)genbank中pdcov的保守序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物和探針，如下表1所示，按照以下序列，合成特異性熒光rt-pcr引物和探針。以depc-h2o稀釋引物至10μm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1引物和探針組合

其中f1的核苷酸序列如序列表中seqidno.1所示，r1的核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示，p1的核苷酸序列如序列表中seqidno.3所示。

實(shí)施例2反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化

1、樣品的準(zhǔn)備：構(gòu)建1個(gè)含有目的擴(kuò)增區(qū)域的質(zhì)粒作為pdcov檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照；以pedv疫苗株、tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、kobu病毒陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)(取自上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心上海獸醫(yī)疾病診斷中心實(shí)驗(yàn)室)作為特異性參考品；以去離子水作為陰性對(duì)照，分別用trizol提取上述陽(yáng)性對(duì)照與特異性參考品的rna，陰性對(duì)照待用。

2、引物探針的篩選：以實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的引物對(duì)探針?lè)謩e檢測(cè)上述的陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照的rna，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出特異性、靈敏度和重復(fù)性好的最佳引物探針組合(如seqidno.1～seqidno.3所示)。

3、引物探針濃度的優(yōu)化：在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從100nm/反應(yīng)至400nm/反應(yīng)梯度的引物和探針進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)引物和探針濃度在200～400nm/反應(yīng)之間均可，其中最佳的引物濃度為200nm/反應(yīng)、探針濃度為400nm/反應(yīng)。

4、鎂離子濃度的優(yōu)化：在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1mmol/l至2.5mmol/l濃度梯度的鎂離子進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的鎂離子濃度為2.0mmol/l。

5、dntp濃度的優(yōu)化：在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.1mmol/l至0.25mmol/l濃度梯度的dntps進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的dntp濃度為0.2mmol/l。

6、熱啟動(dòng)taq酶用量的優(yōu)化：在25μl反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1u(酶單位)至8u濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的熱啟動(dòng)taq酶用量為0.1～0.5u/反應(yīng)。

7、rt酶用量的優(yōu)化：在25μl反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1u(酶單位)至8u濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的rt酶用量為0.5～2u/反應(yīng)。

8、rnasin用量的優(yōu)化：在25μl反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5u(酶單位)至40u濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行pcr反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的rnasin用量為1～3u/反應(yīng)。

9、反應(yīng)溫度的優(yōu)化：根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長(zhǎng)度，主要對(duì)退火溫度和延伸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定pcr反應(yīng)條件為：(1)50℃逆轉(zhuǎn)錄10min；(2)94℃15min；(3)95℃15s；(4)55～60℃45s，(3)-(4)循環(huán)45次(收集熒光信號(hào))。

實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒dna用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁷、1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³拷貝/μl，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，利用abi7500熒光定量pcr分析軟件自動(dòng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：

以引物(f1和r1)和探針p1組合的組合1建立的熒光rt-pcr方法，出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)具有良好的線性范圍，斜率接近-3.04，相關(guān)系數(shù)r²為0.994(見(jiàn)圖1、2)。

根據(jù)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

實(shí)施例4特異性和敏感性試驗(yàn)

(1)特異性試驗(yàn)

采用實(shí)施例2中所述優(yōu)化的體系及擴(kuò)增條件，取7份特異性參考品分別為pedv疫苗株、tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒、捷申病毒、豬kobu病毒(pkv)陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)陽(yáng)性樣品等7個(gè)樣本，提取rna，采用熒光rt-pcr進(jìn)行試劑盒的特異性試驗(yàn)。

其中，樣品總rna提取的步驟如下：①于750μltrizol裂解液中加入待測(cè)樣品200μl，混勻，15～25℃靜置5min；②加入200μl氯仿，振蕩混勻，于4℃、12000r/min離心15min；③取水相上清，加入600μl于-20℃預(yù)冷的異丙醇，混勻后，12000r/min離心10min；④棄上清，加入800μl75％depc-乙醇，12000r/min離心10min；⑤棄上清并于15～25℃干燥后加入11μldepc-h2o溶解，得樣品rna，備用。

熒光rt-pcr反應(yīng)體系：引物探針混合液2μl、rt-pcr反應(yīng)液15μl以及酶混合液(enzymemix)3μl。

熒光rt-pcr的反應(yīng)條件如下：

(1)42℃逆轉(zhuǎn)錄10min；(2)94℃15min；(3)95℃15s；(4)60℃45s；(3)-(4)循環(huán)40次(收集熒光信號(hào))。

結(jié)果顯示：

組合1的熒光rt-pcr結(jié)果表明僅pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線。而pedv疫苗株、tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、豬kobu病毒(pkv)陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)陽(yáng)性樣品均沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(見(jiàn)圖7)，說(shuō)明本組合的特異性很高。

(2)敏感性試驗(yàn)

分別將3個(gè)pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒dna用分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，用depc-h2o對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品做10倍系列稀釋，使每5μl檢測(cè)用量中的拷貝數(shù)分別為1.3×10⁶、1.3×10⁵、1.3×10⁴、1.3×10³、1.3×10²、1.3×10¹、1.3×10⁰拷貝/μl進(jìn)行熒光rt-pcr擴(kuò)增。熒光rt-pcr反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件同(1)特異性試驗(yàn)中所示。

結(jié)果表明：

組合1的熒光rt-pcr方法的最低檢測(cè)限約為1.3×10¹拷貝/μl(見(jiàn)圖10)。而逄鳳嬌(逄鳳嬌,張柏猛,何孔旺,等.豬δ冠狀病毒m基因rt-pcr檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[j].畜牧與獸醫(yī),2016,48(9):50-53.)等針對(duì)pdcovm蛋白基因片段設(shè)計(jì)特異性引物建立的rt-pcr方法，最低可檢出量為6.33×10⁴拷貝/μl。而組合1的敏感性是現(xiàn)有技術(shù)(可檢出量為6.33×10⁴拷貝/μl)的4869倍。本發(fā)明同樣針對(duì)pdcovm蛋白基因片段設(shè)計(jì)一對(duì)更特異的引物和探針，經(jīng)過(guò)優(yōu)化組合，大大提高了實(shí)驗(yàn)的敏感性。由此可見(jiàn)，本發(fā)明的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通rt-pcr。

實(shí)施例5試劑盒的組裝

按照總rna提取和熒光rt-pcr兩個(gè)部分完成試劑盒組分的配制，以下提供的數(shù)據(jù)及試劑組成為單次套式rt-pcr檢測(cè)所需試劑：

(1)總rna提取(4℃保存)

樣品裂解液管：trizol750μl；

氯仿管：氯仿200μl；

75％乙醇管：75％depc-乙醇800μl；

異丙醇管：異丙醇600μl；

depc-h2o管：11μl；

(2)熒光rt-pcr(-20℃保存)

引物探針混合液管：10μm上、下游引物各0.5μl，10μm探針1μl，合計(jì)2μl；

rt-pcr反應(yīng)液管：

2×一步法rt-pcr緩沖液(onesteprt-pcrbuffer)(無(wú)mg²⁺)10μl；25mmmgcl22μl；10mmdntp1μl；depc-h2o2μl；合計(jì)15μl；

酶混合液(enzymemix)管：40u/μlrnasin1μl，25u/μlrt酶1μl，5u/μltaq酶1μl；

陽(yáng)性對(duì)照管：濃度為2.6×10⁶拷貝/μl的pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒5μl；

其中，pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒的制備方法為：陽(yáng)性質(zhì)粒由上海佑隆生物科技有限公司構(gòu)建，具體為合成含有上下游引物序列(即為上述引物f1、r1，如seqidno.1～2所示)的pdcovm基因，并克隆至載體puc57-amp，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒。

陰性對(duì)照管：depc-h2o5μl。

按照48份檢測(cè)劑量為一個(gè)包裝，將上述配制好的試劑分別裝入10個(gè)無(wú)rnase酶的瓶或管中，并按照相應(yīng)的儲(chǔ)存溫度保存運(yùn)送。

實(shí)施例6試劑盒的應(yīng)用

采用本發(fā)明的pdcov熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑盒對(duì)上海某豬場(chǎng)送檢的3份腹瀉仔豬的腸道樣品(標(biāo)本s1、s2和s3)進(jìn)行檢測(cè)。

(1)樣品的預(yù)處理

用無(wú)菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品1.0g于研缽中充分研磨，再加1mlpbs混勻，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入1.5ml無(wú)菌離心管中，3000r/min離心10min，取上清轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌離心管中，編號(hào)備用。

(2)rna的提取

①于750μltrizol裂解液中加入待測(cè)樣品200μl，混勻，室溫靜置5min；②加入200μl氯仿，振蕩混勻，于4℃12000r/min離心15min；③取水相上清，加入600μl異丙醇(-20℃預(yù)冷)，混勻后，12000r/min離心10min；④棄上清，加入800μl75％depc-乙醇，12000r/min離心10min；⑤棄上清并于室溫干燥后加入11μldepc-h2o溶解，得標(biāo)本rna，備用。

(3)熒光rt-pcr反應(yīng)與結(jié)果分析

分別取引物探針混合液2μl、rt-pcr反應(yīng)液15μl、酶混合液(enzymemix)3μl配制成反應(yīng)體系。

取陰性對(duì)照(n)、標(biāo)本(s1、s2、s3)和陽(yáng)性對(duì)照(p)的核酸各5μl，分別加入反應(yīng)體系中使用市售的熒光定量pcr儀(如abi7500)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)條件：(1)42℃逆轉(zhuǎn)錄10min；(2)94℃15min；(3)95℃15s；(4)60℃45s；(3)-(4)循環(huán)40次(收集熒光信號(hào))，整個(gè)反應(yīng)共需85min。

反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)pcr擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如圖13所示。檢測(cè)結(jié)果表明，設(shè)定的對(duì)照全部成立，s1、s2、s3份樣品的ct值分別為14.86、18.12、21.53，均小于30，且出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，表明檢測(cè)樣品中有3份存在陽(yáng)性擴(kuò)增。

(4)與普通rt-pcr檢測(cè)方法比較

參照文獻(xiàn)(wangl,byrumb,zhangy.detectionandgeneticcharacterizationofdeltacoronavirusinpigs,ohio,usa,2014.emerginfectdis2014,20:1227–1230)合成pdcovn基因的引物，上游引物41f(5’-tttcaggtgctcaaagctca-3’)和下游引物735r(5’-gcgaaaagcatttcctgaac-3’)。

反應(yīng)體系：

2×primescript^tmonestepbuffer(dyeplus)25μl，primescript^tmenzymemix2μl，上下游引物各1μl，用depc-h2o補(bǔ)足至50μl。

pcr反應(yīng)條件：(1)50℃逆轉(zhuǎn)錄30min；(2)95℃15min；(3)95℃15s；(4)55℃45s；(5)72℃1min；(3)-(5)循環(huán)40次；(6)72℃7min。

取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.2％瓊脂糖凝膠在110v30min條件下進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果，pcr擴(kuò)增反應(yīng)以及電泳檢測(cè)共需要132min。

結(jié)果如圖14所示。檢測(cè)結(jié)果表明，設(shè)定的對(duì)照全部成立，檢測(cè)樣品中有3份存在陽(yáng)性擴(kuò)增，即s1、s2和s3。與熒光rt-pcr檢測(cè)結(jié)果一致。

由此可見(jiàn)，采用熒光rt-pcr大大節(jié)約了時(shí)間，節(jié)省勞力，操作更簡(jiǎn)單，安全無(wú)污染，適用于pdcov感染的快速診斷和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查研究，有非常好的應(yīng)用前景。

對(duì)比例

(1)特異性引物和探針的設(shè)計(jì)

針對(duì)genbank中pdcov的保守序列設(shè)計(jì)2對(duì)不同于上述實(shí)施例的特異性引物和探針，如下表2所示，按照以下序列，合成特異性熒光rt-pcr引物和探針。以depc-h2o稀釋引物至10μm，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表2引物和探針組合

上述f2～p3的核苷酸序列如序列表中seqidno:4～9所示。

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用實(shí)施例2建立和優(yōu)化的體系進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，建立方法同實(shí)施例3。結(jié)果顯示：

以引物(f2和r2)和探針p2組合的組合2建立的熒光rt-pcr方法，出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)具有較好的線性范圍，斜率接近-2.95，相關(guān)系數(shù)r²為0.983(見(jiàn)圖3、4)。

以引物(f3和r3)和探針p3組合的組合3建立的熒光rt-pcr方法，出現(xiàn)典型的s型擴(kuò)增曲線，指數(shù)區(qū)較明顯，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與ct值呈現(xiàn)具有較好的線性范圍，斜率接近-2.96，相關(guān)系數(shù)r²為0.985(見(jiàn)圖5、6)。

根據(jù)ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

(3)特異性和敏感性試驗(yàn)

①特異性試驗(yàn)

具體操作步驟同實(shí)施例4，結(jié)果顯示：

組合2的熒光rt-pcrpdcov陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線，pedv疫苗株和tgev疫苗株也均有擴(kuò)增曲線，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；而輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、豬kobu病毒(pkv)陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)陽(yáng)性樣品均沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(見(jiàn)圖8)，說(shuō)明本組合的特異性不好。

組合3的熒光rt-pcr結(jié)果表明pdcov陽(yáng)性質(zhì)粒擴(kuò)增曲線為s型擴(kuò)增曲線，pedv疫苗株有擴(kuò)增曲線，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。而tgev疫苗株、輪狀病毒疫苗株、捷申病毒、豬kobu病毒(pkv)陽(yáng)性樣品、大腸桿菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc25922)陽(yáng)性樣品均沒(méi)有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線(見(jiàn)圖9)，說(shuō)明本組合的特異性不好。

由此可見(jiàn)，組合2和組合3的熒光rt-pcr特異性均差于組合1的熒光rt-pcr特異性。

②敏感性試驗(yàn)

具體操作步驟同實(shí)施例4，結(jié)果顯示：

組合2的熒光rt-pcr方法的最低檢測(cè)限約為1.3×10²拷貝/μl(見(jiàn)圖11)，組合3的熒光rt-pcr方法的最低檢測(cè)限約為1.3×10²拷貝/μl(見(jiàn)圖12)；由此可見(jiàn)，組合2和組合3的熒光rt-pcr方法的檢測(cè)限遠(yuǎn)高于組合1。

sequencelisting

<110>上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

<120>一種用于豬delta冠狀病毒檢測(cè)的試劑盒及檢測(cè)方法

<130>p1710073c

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物f1

<400>1

gagagtagactccttgcagggattat26

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物r1

<400>2

gcttgccatgcttaacgactg21

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>探針p1

<400>3

aatgcacctccatgtacc18

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物f2

<400>4

cgaccacatggctccaatt19

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物r2

<400>5

cagctcttgcccatgtagc19

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>探針p2

<400>6

cacaccagtcgttaagcatggca23

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物f3

<400>7

tgagagtagactccttgcagg21

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>引物r3

<400>8

gagaattggagccatgtgg19

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>探針p3

<400>9

tgtacccattggatccataa20