本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及小動物肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法以及轉(zhuǎn)基因動物模型的構(gòu)建方法，特別是涉及一種以眼底靜脈叢注射技術(shù)和靜脈高壓轉(zhuǎn)染技術(shù)(水動力法)為基礎(chǔ)的小動物肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法及其在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
眼底靜脈叢注射技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)實驗中的一種常規(guī)技術(shù)。該技術(shù)作為一種常規(guī)的實驗手段，可以將一系列外源物質(zhì)遞送到活體動物靜脈血管內(nèi)。通常，在生物實驗中，該技術(shù)可以作為治療性細(xì)胞輸注、藥物靜脈內(nèi)遞送和外源基因轉(zhuǎn)染的方法。與其它靜脈注射方法相比，該方法有操作簡單方便、適于重復(fù)進(jìn)行和對實驗動物損傷小等優(yōu)點(diǎn)。更為重要的是，該技術(shù)適用于某些無法通過其他靜脈途徑進(jìn)行外源物質(zhì)遞送的實驗動物身上，這樣就克服了尾靜脈注射技術(shù)等傳統(tǒng)注射技術(shù)無法逾越的技術(shù)鴻溝。靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法(水動力法)是一種較新的活體動物基因轉(zhuǎn)染方法。該方法可以被定義為，通過將大劑量的含有目的基因重組質(zhì)粒的生理鹽水溶液快速注入實驗動物靜脈內(nèi)，進(jìn)而使目的基因特異性的高效表達(dá)于實驗動物的肝組織細(xì)胞中的活體動物基因轉(zhuǎn)染方法。其中，在該類型的基因轉(zhuǎn)染方法中，應(yīng)用最為廣泛的是尾靜脈水動力轉(zhuǎn)染法，在動物實驗和實驗動物造模過程中常?？梢砸姷皆摲椒ǖ膽?yīng)用。然而，這種經(jīng)典的活體動物轉(zhuǎn)染技術(shù)也有其難以克服的局限性，如僅僅適用于某些尾靜脈明顯且容易穿刺的實驗動物身上(如小鼠、大鼠)，而其他一些尾靜脈不明顯或根本沒有尾靜脈的動物則無法使用(如新生鼠)。因此，該方法被局限的應(yīng)用在大、小鼠的動物實驗當(dāng)中，如果希望該方法在其他類型的實驗動物身上使用，就必須對其進(jìn)行改進(jìn)。因此，迫切需要一種簡單方便、適于重復(fù)進(jìn)行和對實驗動物損傷小，且適用范圍廣泛(可用于多種實驗動物)的活體動物體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有的實驗動物靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法(水動力法)適用范圍較小、重復(fù)操作困難等問題，本發(fā)明的目的是提供一種簡單方便、適于重復(fù)操作和對實驗動物損傷小、適用范圍廣泛(可用于多種實驗動物)，以眼底靜脈叢注射技術(shù)和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法為基礎(chǔ)的小動物肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法。本發(fā)明所提供的基因轉(zhuǎn)染方法，是將超過2μg的攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于實驗動物體重4-10％的生理鹽水，以5-25秒的速度注射入實驗動物的眼底靜脈叢內(nèi)，8-36小時后目的基因在實驗動物肝臟處獲得表達(dá)。在上述基因轉(zhuǎn)染方法中，所述攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的注射量優(yōu)選為5-50μg，尤其優(yōu)選為10μg；所述生理鹽水的注射量優(yōu)選為相當(dāng)于實驗動物體重6-10％，尤其優(yōu)選為10％；所述注射速度優(yōu)選為5-12秒，尤其優(yōu)選為8秒；所述目的基因的表達(dá)時間優(yōu)選為8-24小時。所述目的基因的選擇是廣泛的，可根據(jù)需要構(gòu)建的實驗動物模型進(jìn)行選擇，外源基因既可以是只表達(dá)指示作用的報告基因，如螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因、分泌型Gissass熒光素酶(Gluc)基因、β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因等，還可以是具有治療作用、模擬疾病感染或有其他應(yīng)用前景的目的基因，如HBV基因或HCV基因等；用于構(gòu)建攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)粒可為任意一種表達(dá)外源基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，如pCI-neo、pcDNA、pGL、pVAX或pNFkB-Luc等；以pCI-neo為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶Gluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCI-Gluc，以pGL3為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶Fluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCMV-Fluc，以pcDNA為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶lacZ基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCMV-β-Gal。所述實驗動物的選擇也是廣泛的，可根據(jù)需要構(gòu)建的實驗動物模型進(jìn)行選擇，如成年鼠、新生鼠、乳鼠、樹鼩等，優(yōu)選為6-8周齡的成年鼠、新生24小時內(nèi)的新生鼠、新生1-7天的乳鼠、成年或新生樹鼩。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟：1)構(gòu)建攜帶目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于實驗動物體重4-10％的生理鹽水，以5-25秒的速度注射入實驗動物的眼底靜脈叢內(nèi)，8-36小時后目的基因在實驗動物肝臟處獲得表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因小鼠模型。所述目的基因為HBV或HCV全基因組基因。以pGL3(購自美國Promega公司)為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶HBV1.2倍基因組的重組真核表達(dá)質(zhì)粒為pGL-CP-Fluc-HBV1.2；以pCI-neo(購自美國Promega公司)為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶HCV全基因組的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV。本發(fā)明公開了一種高效、簡單、重復(fù)性好、可廣泛應(yīng)用的小動物肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法(以下簡稱眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法)。該方法將眼底靜脈叢注射技術(shù)和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法巧妙地結(jié)合在一起，通過該方法可以使外源基因特異性地在動物肝臟中表達(dá)，且其對肝臟組織所造成的損傷作用是短暫的、有限的。通過該方法可使含有不同目的基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白。該技術(shù)可以用于多種動物模型的建立和基因治療的效果評價，例如，通過轉(zhuǎn)染常見的報告指示基因—-分泌型Gissass熒光素酶Gluc、螢火蟲熒光素酶Fluc和β-半乳糖苷酶β-Gal基因?qū)Τ赡晷∈?、新生鼠和成年樹鼩進(jìn)行活體基因轉(zhuǎn)染。檢測結(jié)果表明該方法不僅可用于構(gòu)建常規(guī)實驗動物如成年大、小鼠轉(zhuǎn)基因動物模型，還可用于構(gòu)建特殊實驗動物如新生鼠和非人靈長類動物如樹鼩的轉(zhuǎn)基因動物模型。此外，應(yīng)用該技術(shù)通過將含有乙型肝炎病毒(HBV)基因組或丙型肝炎病毒(HCV)全基因組的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到新生24小時內(nèi)的新生鼠肝臟細(xì)胞中，可以建立模擬嬰幼兒垂直感染HBV或HCV的動物模型。用本發(fā)明的方法可以評價不同外源基因在實驗動物體內(nèi)表達(dá)所引起的生物學(xué)反應(yīng)，也可作為建立動物模型的一種手段，可廣泛應(yīng)用于各個門類的生物醫(yī)學(xué)動物實驗當(dāng)中，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。附圖說明圖1為眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法對基因轉(zhuǎn)染效率的影響圖，其中：A為眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法中注射溶液體積對基因轉(zhuǎn)染效率的影響；B為眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法中注射速度對基因轉(zhuǎn)染效率的影響；C為眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法中注射質(zhì)粒用量對基因轉(zhuǎn)染效率的影響。圖2為實施例2實驗結(jié)果圖片，其中：A為活體熒光成像結(jié)果顯示眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pCMV-Fluc質(zhì)粒24小時后，外源基因螢火蟲熒光素酶在小鼠臟器組織中的表達(dá)情況；B為應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法對研磨后提取的組織蛋白中螢火蟲熒光素酶活性的測量，測量的組織為心、肝、脾、肺、腎、腦，測量時間點(diǎn)為8小時和24小時；C為眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pCMV-β-Gal質(zhì)粒后24小時，通過冰凍切片觀測各種組織細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶的染色結(jié)果。圖3為實施例3實驗結(jié)果圖片，其中：A為眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染后0、1、2、3、5、7天，通過血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的檢測發(fā)現(xiàn)血清生物化學(xué)指標(biāo)的變化。B為眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染后0、1、2、5天，通過組織石蠟切片HE染色觀測組織學(xué)變化的結(jié)果。圖4為實施例4實驗結(jié)果圖片，其中：A為使用螢火蟲熒光素酶重組表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-Fluc)應(yīng)用眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染新生24小時內(nèi)的新生鼠，外源基因在新生鼠肝臟內(nèi)持續(xù)表達(dá)，活體熒光成像的檢測結(jié)果及正常生長過程的照相圖片；B為使用螢火蟲熒光素酶重組表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-Fluc)應(yīng)用眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染新生24小時內(nèi)的新生鼠，外源基因在新生鼠肝臟內(nèi)持續(xù)表達(dá)的熒光素酶激活程度的定量結(jié)果；C為使用螢火蟲熒光素酶重組表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-Fluc)應(yīng)用眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染新生24小時內(nèi)的新生鼠，外源基因在新生鼠各組織內(nèi)的表達(dá)分布情況。圖5為實施例5實驗結(jié)果圖片，其中：A為成年樹鼩圖片及使用螢火蟲熒光素酶重組表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-Fluc)應(yīng)用眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染成年樹鼩后24小時活體熒光成像結(jié)果；B為對成年樹鼩進(jìn)行眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pCMV-β-Gal質(zhì)粒24小時，通過冰凍切片觀測各種組織細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶的染色結(jié)果。圖6為實施例6實驗結(jié)果圖片，其中：A為對新生鼠進(jìn)行眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pGL-CP-Fluc-HBV1.2后24小時觀測到新生鼠肝臟部位標(biāo)記HBV1.2倍基因組的報告基因螢火蟲熒光素酶的表達(dá)情況；B為Western-blotting方法檢測眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc和pGL-CP-Fluc-HBV1.2后24小時的新生鼠的肝臟組織HBVHBcAg、Fluc和GAPDH的表達(dá)情況；C為對新生鼠進(jìn)行眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV后24小時觀測到新生鼠肝臟部位標(biāo)記HCV全基因組的報告基因螢火蟲熒光素酶的表達(dá)情況；D為免疫組織化學(xué)方法對眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV后24小時的新生鼠的肝臟組織切片做HCVNS4A抗原的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果，深染處即為染色陽性結(jié)果。具體實施方式針對現(xiàn)有動物基因轉(zhuǎn)染方法和靜脈高壓基因轉(zhuǎn)染技術(shù)中存在適用范圍較小(僅適用于部分常規(guī)實驗動物)等問題，本發(fā)明的目的是提供一種簡單方便、適于重復(fù)進(jìn)行和對實驗動物損傷小、適用范圍廣泛(可用于多種實驗動物)，以眼底靜脈叢注射技術(shù)和靜脈高壓注射轉(zhuǎn)染法為基礎(chǔ)的小動物肝臟特異性基因轉(zhuǎn)染方法。本發(fā)明所提供的基因轉(zhuǎn)染方法，是將超過2μg的攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于實驗動物體重4-10％的生理鹽水，以5-25秒的速度注射入實驗動物的眼底靜脈叢內(nèi)，8-36小時后目的基因在實驗動物肝臟處獲得表達(dá)。在上述基因轉(zhuǎn)染方法中，所述攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的注射量優(yōu)選為5-50μg，尤其優(yōu)選為10μg；所述生理鹽水的注射量優(yōu)選為相當(dāng)于實驗動物體重6-10％，尤其優(yōu)選為10％；所述注射速度優(yōu)選為5-12秒，尤其優(yōu)選為8秒；所述目的基因的表達(dá)時間優(yōu)選為8-24小時。所述目的基因的選擇是廣泛的，可根據(jù)需要構(gòu)建的實驗動物模型進(jìn)行選擇，外源基因既可以是只表達(dá)指示作用的報告基因，如螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因、分泌型Gissass熒光素酶(Gluc)基因、β-半乳糖苷酶(β-Gal)基因等，還可以是具有治療作用、模擬疾病感染或有其他應(yīng)用前景的目的基因，如HBV基因或HCV基因等；用于構(gòu)建攜帶有目的基因的重組質(zhì)粒的出發(fā)質(zhì)?？蔀槿我庖环N表達(dá)外源基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，如pCI-neo、pcDNA、pGL、pVAX或pNFkB-Luc等；以pCI-neo為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶Gluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCI-Gluc，以pGL3為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶Fluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCMV-Fluc，以pcDNA為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建的攜帶lacZ基因的重組表達(dá)質(zhì)粒為pCMV-β-Gal。所述實驗動物的選擇也是廣泛的，可根據(jù)需要構(gòu)建的實驗動物模型進(jìn)行選擇，如成年鼠、新生鼠、乳鼠、樹鼩等，優(yōu)選為6-8周齡的成年鼠、新生24小時內(nèi)的新生鼠、新生1-7天的乳鼠、成年或新生樹鼩。本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟：1)構(gòu)建攜帶目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2)將攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于實驗動物體重4-10％的生理鹽水，以5-25秒的速度注射入實驗動物的眼底靜脈叢內(nèi)，8-36小時后目的基因在實驗動物肝臟處獲得表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因小鼠模型。所述目的基因為HBV或HCV全基因組基因。以pGL3出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶HBV1.2倍基因組的重組真核表達(dá)質(zhì)粒為pGL-CP-Fluc-HBV1.2；以pCI-neo為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶HCV全基因組的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV。實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、本發(fā)明眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法的建立，及其轉(zhuǎn)染條件在成年小鼠身上的優(yōu)化本發(fā)明眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法的建立，及其轉(zhuǎn)染條件在成年小鼠身上的優(yōu)化方法具體包括以下步驟：一、重組質(zhì)粒pCI-Gluc的構(gòu)建使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對質(zhì)粒extGluc[E.B.Santos，R.Yeh，J.Lee，Y.Nikhamin，B.Punzalan，B.Punzalan，K.L.Perle，S.M.Larson，M.Sadelain，R.J.Brentjens，SensitiveinvivoimagingofTcellsusingamembrane-boundGaussiaprincepsluciferase，NatureMedicine，15(2009)338-344.]和pCI-neo載體(購自美國Promega公司)分別進(jìn)行雙酶切，雙酶切體系為：extGluc或pCI-neo載體7μl、EcoRI和NotI(購自美國NewEnglandBiolabs公司)各2.5μl、10×Buffer5μl、ddH2O33μl，總體積50μl，酶切條件為：37℃酶切8h，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果表明獲得了500bp的分泌型Gissass熒光素酶Gluc基因片段和5000bp的pCI-neo載體酶切片段，用凝膠回收試劑盒(購自大連寶生物工程TakaRa公司)回收并純化兩個基因片段，然后，將回收獲得的分泌性Gluc片段(500bp)與pCI-neo載體片段(5000bp)進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為：pCI-neo載體片段1μl、分泌型Gluc基因片段5μl、10×T4DNALigaseBuffer1μl、T4DNALigase1μl(購自美國NewEnglandBiolabs公司)、ddH2O2μl，共10μl，連接反應(yīng)條件為：4℃連接過夜，得到攜帶Gluc基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pCI-Gluc。二、本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法中注射溶液體積對轉(zhuǎn)染效率的影響將步驟一中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCI-Gluc用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑盒(購自德國Qiagen公司)進(jìn)行質(zhì)粒純化，然后選6-8周齡的雄性BALB/c小鼠20只(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，將10μgpCI-Gluc質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于小鼠體重4％、6％、8％、10％的生理鹽水中，以8秒的速度注射入小鼠眼底靜脈叢內(nèi)。24小時后通過尾靜脈采血法，采血80-150μl。血樣在4℃中放置4小時，待血清析出后，4500rpm離心20分鐘以分取血清，-70℃保存。生物發(fā)光檢測Gluc表達(dá)量時，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(購自美國Promega公司)生物發(fā)光測試儀，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(購自美國Promega公司)試劑盒，參數(shù)設(shè)置為延遲10秒，自動加入底物100μl，通過電腦獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1A所示(橫坐標(biāo)為生理鹽水注射體積(百分比體重)，縱坐標(biāo)為相對基因表達(dá)水平，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明不同劑量的含有質(zhì)粒的生理鹽水快速注入小鼠眼底靜脈叢后，外源基因可以表達(dá)。當(dāng)注射液體量為小鼠體重10％時，外源基因的表達(dá)水平最高，且與其他注射劑量相比都有明顯差別(p＜0.01)，因此，將本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法中生理鹽水的注射量定為相當(dāng)于實驗動物體重4-10％，優(yōu)選為相當(dāng)于實驗動物體重6-10％，尤其優(yōu)選為相當(dāng)于實驗動物體重10％。三、眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法中注射速度對轉(zhuǎn)染效率的影響將重組質(zhì)粒pCI-Gluc用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒純化。然后選6-8周齡的雄性BALB/c小鼠20只，將pCI-Gluc10μg溶解于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，分別以5、8、12和25秒的速度注射入小鼠眼底靜脈叢內(nèi)。24小時后通過尾靜脈采血法，采血80-150μl。血清分離方法同步驟二。生物發(fā)光檢測Gluc表達(dá)量時，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(購自美國Promega公司)生物發(fā)光測試儀，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(購自美國Promega公司)試劑盒，參數(shù)設(shè)置為延遲10秒，自動加入底物100μl，通過電腦獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1B所示(橫坐標(biāo)為注射時間(s)，縱坐標(biāo)為相對基因表達(dá)水平，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明當(dāng)小鼠體重10％的含有質(zhì)粒DNA的生理鹽水以5-25秒的速度注入小鼠眼底靜脈蟲后外源基因可以高效的表達(dá)，且5-8秒內(nèi)注射完成時外源基因表達(dá)最高，但注射速度過快小鼠可能死亡。因此，將本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法中注射速度定為5-25秒，優(yōu)選為5-12秒，尤其優(yōu)選為8秒。四、眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法中質(zhì)粒用量對轉(zhuǎn)染效率的影響將重組質(zhì)粒pCI-Gluc用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒純化。然后選6-8周齡的雄性BALB/c小鼠20只，將質(zhì)粒pCI-Gluc2、5、10、50μg溶解于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，分別以8秒的速度注射入小鼠眼底靜脈叢內(nèi)。24小時后通過尾靜脈采血法，采血80-150μl。血清分離方法同上。生物發(fā)光檢測Gluc表達(dá)量時，吸取20μl血清于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(購自美國Promega公司)生物發(fā)光測試儀，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(購自美國Promega公司)試劑盒，參數(shù)設(shè)置為延遲10秒，自動加入底物100μl。通過電腦獲得相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖1C所示(橫坐標(biāo)為質(zhì)粒用量(微克)，縱坐標(biāo)為基因表達(dá)量，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，表明不同劑量的質(zhì)粒DNA注入小鼠體內(nèi)后，外源基因均有表達(dá)。從實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在成年小鼠實驗當(dāng)中，10μg質(zhì)粒已經(jīng)可以使外源基因的表達(dá)達(dá)到飽和，即使增加質(zhì)粒用量(如50μg)外源基因的表達(dá)也不會增加。因此，將本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法中攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒的注射量應(yīng)大于2μg，優(yōu)選為5-10μg，尤其優(yōu)選為10μg。綜上所述，本發(fā)明所提供的眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染法，是將超過2μg的攜帶有目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒溶解于相當(dāng)于實驗動物體重4-10％的生理鹽水，以5-25秒的速度注射入實驗動物的眼底靜脈叢內(nèi)，8-36小時后目的基因在實驗動物肝臟處獲得表達(dá)。實施例2、本發(fā)明眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染后外源基因表達(dá)靶器官的確認(rèn)用下述方法驗證實施例1建立的眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染后外源基因表達(dá)的靶器官：一、螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因表達(dá)靶器官的檢測首先用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑盒(購自德國Qiagen公司)對攜帶有螢火蟲熒光素酶(Fluc)基因的重組質(zhì)粒pCMV-Fluc[FuQX，JiaSZ，SunZD，TianFM，DuJ，ZhouY，WangYL，WangLH，ZhanLS.phiC31integraseandliver-specificregulatoryelementsconferhigh-level，long-termexpressionoffireflyluciferaseinmouseliver.BiotechnologyLetters.2009，31：1151-1157.]進(jìn)行質(zhì)粒純化，然后選6-8周齡的雄性BALB/c小鼠10只，將pCMV-Fluc10μg溶解于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)。在轉(zhuǎn)染后24小時按150mg/kg的用量小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(購自美國Promega公司)，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活體熒光成像儀進(jìn)行檢測。通過活體成像技術(shù)可以觀測到小鼠腹部有強(qiáng)烈的發(fā)光。迅速短頸處死小鼠將小鼠解剖，十分鐘內(nèi)將該小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腦取出繼續(xù)進(jìn)行活體成像。結(jié)果如圖2-A所示(1為心，2為肝，3為脾，4為肺，5為腎，6為腦)，可以發(fā)現(xiàn)小鼠腹部的生物發(fā)光基本上來自于肝臟，其他組織未見明顯的生物發(fā)光信號。為進(jìn)一步確認(rèn)眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染后外源基因表達(dá)的靶器官，用組織蛋白抽提液(康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京，中國)將心、肝、脾、肺、腎、腦各組織裂解，并分離組織蛋白，方法為：取20μl組織蛋白于微孔板中，使用GloMaxTM96luminometer(購自美國Promega公司)生物發(fā)光測試儀，Dual-LuciferaseReporterAssaySystem(購自美國Promega公司)試劑盒，參數(shù)設(shè)置為延遲10秒，加入100μl的Fluc底物。結(jié)果如圖2-B所示(橫坐標(biāo)為組織名稱，縱坐標(biāo)為轉(zhuǎn)染后8h、24h后基因表達(dá)量，Con為陰性對照，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.001)，除在8小時時腎臟組織有極微弱的發(fā)光外，其他生物發(fā)光全部集中在肝臟組織中，且螢火蟲熒光素酶(Fluc)激活約為其陰性對照(只注射生理鹽水)的104倍。二、β-半乳糖苷酶(lacZ)基因表達(dá)靶器官的檢測通過將10μgβ-半乳糖苷酶表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β-Gal[周勇，閻少多，閻虎，等。樹鼩水動力轉(zhuǎn)染方法的建立及在HBV模型探索中的應(yīng)用，軍事醫(yī)學(xué)，2011，10(35)：742-745]溶解于相當(dāng)于小鼠體重10％的生理鹽水，以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至小鼠體內(nèi)。24小時后，取小鼠各臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦)，冰凍切片后進(jìn)行X-Gal染色。結(jié)果如圖2-C所示，可以發(fā)現(xiàn)外源基因的表達(dá)主要集中在肝細(xì)胞中。綜上所述，本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染后外源基因表達(dá)的靶器官為肝臟。實施例3、本發(fā)明眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染后對靶標(biāo)動物組織的損傷情況在基于實施例2所得的實驗結(jié)果，可以看出該技術(shù)可能對實驗動物的機(jī)體，尤其是肝組織產(chǎn)生一定的副作用，因此，用下述方法觀察本發(fā)明外源基因轉(zhuǎn)染方法對實驗動物(實施例2步驟一轉(zhuǎn)染pCMV-Fluc質(zhì)粒的小鼠)肝組織的損傷情況：首先分析眼底靜脈叢轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染后的小鼠血清中血清谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)等血清生化指標(biāo)的變化，具體方法為：通過眼球取血法從小鼠體內(nèi)取得約300μl的全血于1.5mL離心管中，4℃放置4小時待血清析出，然后4500rpm離心20分鐘，分離血清并保存于-70℃低溫冰箱中，待0、1、2、3、5、7天小鼠血清全部都獲得后，使用日立全自動臨床生化分析儀TBA-200FR對小鼠血清樣品進(jìn)行ALT、AST分析。檢測結(jié)果如圖3-A所示，可以發(fā)現(xiàn)，小鼠血清中的ALT在眼底靜脈叢轉(zhuǎn)染后1天明顯上升，高達(dá)500IU/L左右，然后隨即開始迅速下降，到第3天時僅有50-90IU/L，但此值仍高于小鼠生理水平，血清ALT水平約在第5天恢復(fù)正常水平，此后一直保持在正常水平。血清AST的結(jié)果與ALT的變化基本相同。此外，還通過石蠟包埋的HE組織切片觀察眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法對肝細(xì)胞的損傷情況，具體方法為：取適當(dāng)大小待檢測的肝臟組織置于10％福爾馬林溶液中固定24h以上；肝組織經(jīng)流水過夜沖洗完全水化后，再經(jīng)過由低濃度到高濃度的乙醇逐級脫水，二甲苯滲透，最后石蠟包埋成蠟塊并切成厚度為5μm切片，脫蠟后，浸入PBS中水化5min，將切片浸入蘇木精染液中染色10-30min后取出，用水沖洗去浮色；切片浸入0.1％鹽酸酒精中分色數(shù)秒；再用水沖洗反藍(lán)，直到切片顏色變藍(lán)；浸入I％伊紅染液中復(fù)染30sec-2min，水沖洗去殘余染料；按照順序?qū)⒃撉衅?jīng)過70％、80％、90％、95％的酒精脫色和分化伊紅顏色各1-2min；將該切片浸入100％酒精脫色15min，中間更換一次；浸入100％酒精+二甲笨(1∶1)中透明5-10min，再經(jīng)過二甲苯(I號缸)透明2-5min，二甲苯(II號缸)透明5min；中性樹脂固片。結(jié)果如圖3-B所示(Control表示陰性對照，只注射生理鹽水)，與血液生化指標(biāo)相同，在轉(zhuǎn)染后的1天，肝細(xì)胞腫脹變形，肝組織特有的組織形態(tài)受到破壞，視野下有壞死和凋亡細(xì)胞出現(xiàn)；第2天，肝細(xì)胞病變明顯減輕，肝組織結(jié)構(gòu)趨向正常，肝細(xì)胞腫脹現(xiàn)象消失，細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)；肝臟細(xì)胞可在第5天完全恢復(fù)正常的生理結(jié)構(gòu)。以上實驗結(jié)果充分說明了本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法對肝臟的損傷作用是瞬時的，基本在一周之內(nèi)恢復(fù)正常。實施例4、眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法在乳鼠身上的應(yīng)用一、外源基因在乳鼠體內(nèi)表達(dá)情況按照實施例1中眼底靜脈叢在成年鼠身上的優(yōu)化條件對乳鼠的眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染進(jìn)行初步應(yīng)用。用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量純化試劑盒對重組質(zhì)粒pCMV-Fluc進(jìn)行質(zhì)粒純化，然后選新生24小時內(nèi)的BALB/c新生鼠10只(購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)，將pCMV-Fluc10μg溶解于相當(dāng)于新生鼠體重10％的生理鹽水中，以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至新生鼠體內(nèi)。新生鼠保溫后放回母鼠籠中。分別于第1、2、3、5、8、12、18天通過IVIS活體成像儀對新生鼠進(jìn)行成像，觀察外源基因在新生鼠體內(nèi)的表達(dá)情況。新生一周內(nèi)的新生鼠通過固定四肢保證新生鼠在成像過程中保持靜止，一周以上的乳鼠通過氣體麻醉，活體成像的其他操作過程同前。結(jié)果如圖4-A和圖4-B所示，可以看出，新生鼠在轉(zhuǎn)染后一天，外源基因的表達(dá)水平達(dá)到頂峰，隨后逐步下降，但外源基因的表達(dá)基本可以維持約2周的時間。二、眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染新生鼠，轉(zhuǎn)染靶器官的確認(rèn)為了了解眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染后新生鼠外源基因的表達(dá)靶器官情況是否與成年鼠相同，將純化后的質(zhì)粒pCMV-Fluc10μg溶解于相當(dāng)于新生鼠體重10％的生理鹽水中，然后以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至新生24小時內(nèi)的小鼠體內(nèi)。1天后，新生鼠腹腔注射150mg/kg的螢火蟲熒光素酶底物，5分鐘后將新生鼠斷頸處死，分離心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，應(yīng)用IVIS活體成像儀以中靈敏度水平成像60秒。結(jié)果如圖4-C(1為心，2為肝，3為脾，4為肺，5為腎，6為腦)所示，可見新生鼠肝組織中表達(dá)了較強(qiáng)的熒光素酶活性，肺臟組織有相對較弱的熒光素酶激活，而其他組織沒有熒光素酶的激活。綜上所述，用本發(fā)明眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染方法向乳鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染外源基因后，基因表達(dá)水平與成年鼠體內(nèi)表達(dá)情況相近，外源基因主要表達(dá)于乳鼠的肝臟組織中，肺組織中也有少量的表達(dá)。實施例5、眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法在非人靈長類樹鼩身上的應(yīng)用在完成實施例1-4的內(nèi)容后，檢測本發(fā)明的眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染法是否可應(yīng)用于體積較大的實驗動物身上，如非人靈長類實驗動物樹鼩，實驗方法為：分別將純化后的重組質(zhì)粒pCMV-Fluc(與施例2之一同)和pCMV-β-Gal(與施例2之二同)各200μg溶解于相當(dāng)于樹鼩10％體重的生理鹽水中，然后以15秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至20-40周齡的樹鼩體內(nèi)。24小時后，使用3％的異氟烷氣體將樹鼩麻醉，并腹腔給予150mg/kg的螢火蟲熒光素酶底物，5分鐘后，活體成像樹鼩腹部部分。結(jié)果如圖5-A所示，可以發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)luc外源基因在樹鼩體內(nèi)可以高效的表達(dá)。同時，將轉(zhuǎn)染有重組質(zhì)粒pCMV-β-Gal24小時后的樹鼩斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦后迅速用液氮將組織速凍，使用冰凍切片機(jī)切取6μm厚的組織切片，固定后用X-Gal染色，觀察β-半乳糖苷酶的表達(dá)情況。眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染后β-半乳糖苷酶lacZ基因在實驗動物樹鼩的組織中的表達(dá)情況如圖5-B所示，肝組織細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)染的顆粒，與在其他實驗動物身上獲得的結(jié)果相似，表明lacZ外源基因僅在肝臟表達(dá)。實施例6、用本發(fā)明的眼底靜脈叢水動力基因轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建HBV及HCV新生動物模型及其檢測在完成實施例1-5的內(nèi)容后，將本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因方法實際應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)相關(guān)實踐當(dāng)中，即通過該方法可以構(gòu)建HBV及HCV全基因組在新生鼠肝臟中表達(dá)的肝炎病毒各蛋白的動物模型。一、重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGL-CP-Fluc-HBV1.2的構(gòu)建攜帶HBV1.2倍基因組(含有AAV的HBV1.2倍基因組(subtypeadw，genetypeA)重組表達(dá)載體pAAV/HBV1.2包括HBV基因組1400-3182bp+1-1987bp和兩個反向重復(fù)序列(ITR)，由國立臺灣大學(xué)陳培哲教授惠贈)[Li-RungHuang，Hui-LinWu，Pei-JerChen，andDing-ShinnChen，AnimmunocompetentmousemodelforthetoleranceofhumanchronichepatitisBvirusinfection，TheNationalAcademyofSciencesoftheUSA，2006，103：17862-17867.]的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pGL-CP-Fluc-HBV1.2具體構(gòu)建過程請參見文獻(xiàn)[梁聲強(qiáng)，報告基因標(biāo)記的HBV小鼠模型的建立及在疫苗評價中的應(yīng)用，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文，2010.5，第一章，第一節(jié)，14-17頁]。(2)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV的構(gòu)建攜帶HCV全基因組(GenBank號AJ238799.1)的重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV具體構(gòu)建過程請參見文獻(xiàn)[田粉梅，持續(xù)表達(dá)HCV全基因組小鼠模型的建立，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院碩士學(xué)位論文，2008.5，第一部分，第一節(jié)，11-17頁]。二、HBV蛋白在新生鼠肝臟中表達(dá)的動物模型的建立及其檢測將純化后的質(zhì)粒pGL-CP-Fluc-HBV1.210μg溶解于相當(dāng)于BALB/c新生鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)體重10％的生理鹽水中，然后以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至新生24小時內(nèi)的新生鼠體內(nèi)。(1)轉(zhuǎn)染24小時后，將新生鼠四肢固定，腹腔注射150mg/kg的熒光素酶底物(購自美國promega公司)，5分鐘后IVIS活體成像儀中靈敏度成像60秒。可以發(fā)現(xiàn)新生鼠的肝臟區(qū)域有生物發(fā)光信號，且信號較強(qiáng)(見圖6-A)，這可以間接證明HBV各組分蛋白同時也在新生鼠的肝臟區(qū)域表達(dá)。(2)Western-blotting方法檢測HBVHBcAg在BALB/c新生鼠肝臟中的表達(dá)。在眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染10μgpGL-CP-Fluc-HBV1.2到新生鼠肝臟后24小時，處死新生鼠，并將其肝臟取出迅速置于預(yù)冷的75％生理鹽水中，漂洗數(shù)次，剪碎，加入裂解液，裂解后12000轉(zhuǎn)/分離心收集上清，在上清液中加入4×loadingbuffer，樣品置100℃的水浴箱水浴加熱10min，10000g離心10min，取上清液備用。按常規(guī)膠配置方法配制不同濃度聚丙烯酰胺凝膠，電泳使樣品到達(dá)分離膠底部，斷開電源。電泳結(jié)束后，將凝膠轉(zhuǎn)移至盛有轉(zhuǎn)移緩沖液的器皿中，平衡5分鐘，剪1塊與凝膠大小相同的硝酸纖維膜和6張濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡5分鐘，在轉(zhuǎn)移盤中按陽極到陰極順序，將3張濾紙、轉(zhuǎn)移膜、凝膠重疊精確對齊，然后在其上再放置3張浸泡好的濾紙，各層之間應(yīng)避免留有氣泡，在轉(zhuǎn)移盤中夾好后，放在轉(zhuǎn)移槽緩沖液中，膠側(cè)置陰極，膜側(cè)置陽極，接通電源，電轉(zhuǎn)2h，100V，轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜與封閉液室溫振蕩孵育4℃封閉過夜，將膜與封閉液稀釋的一抗兔抗HBVHBcAg(1∶1000)(購自北京中杉金橋公司)室溫振蕩孵育2h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，將膜與用HRP標(biāo)記的抗兔二抗(1∶5000)(購自北京康維世紀(jì)生物公司)室溫振蕩孵育1h，用漂洗緩沖液洗膜3次，每次10min，將底物試劑A和試劑B等體積混合備用(購自美國MILLIPORE公司)，將底物工作液加到膜上后應(yīng)立即用保鮮膜包好，迅速放入暗盒中并將X光片壓到膜上進(jìn)行曝光，然后先在顯影液中沖洗至膠片上出現(xiàn)條帶，再放入定影液中漂洗十秒，即可觀察結(jié)果。結(jié)果如圖6-B顯示，眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pGL3-Fluc重組真核表達(dá)質(zhì)粒的新生鼠肝臟僅有熒光素酶的表達(dá)，而眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染pGL-CP-Fluc-HBV1.2重組真核表達(dá)質(zhì)粒的新生鼠肝臟Western-blotting方法檢測既可以發(fā)現(xiàn)Fluc的表達(dá)，同時有HBVHBcAg的表達(dá)，說明HBV各組分蛋白均在新生鼠的肝臟中表達(dá)。三、HCV蛋白在新生鼠肝臟中表達(dá)的動物模型的建立及其檢測將純化后的質(zhì)粒pCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV10μg溶解于相當(dāng)于BALB/c新生鼠(購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)體重10％的生理鹽水中，然后以8秒的速度通過眼底靜脈叢快速轉(zhuǎn)染至新生24小時內(nèi)的新生鼠體內(nèi)。(1)轉(zhuǎn)染24小時后，將新生鼠四肢固定，腹腔注射150mg/kg的熒光素酶底物(購自美國promega公司)，5分鐘后IVIS活體成像中靈敏度成像60秒?？梢园l(fā)現(xiàn)新生鼠的肝臟區(qū)域有生物發(fā)光信號，且信號較強(qiáng)(見圖6-C)，這可以間接證明HCV各組分蛋白同時也在新生鼠的肝臟區(qū)域表達(dá)。(2)免疫組織化學(xué)檢測HCVNS4A在BALB/c新生鼠肝臟中的表達(dá)在眼底靜脈叢水動力轉(zhuǎn)染10μgpCI-attB-AerApoEAATP-Fluc-ECMVIRES-HCV到新生鼠肝臟后24小時，處死新生鼠，并將其肝臟取出，固定24h以上。將固定后的組織精細(xì)取材后，于4℃下脫水、透明，52℃低熔點(diǎn)石蠟浸蠟包埋制成蠟塊。切片機(jī)對蠟塊進(jìn)行連續(xù)切片，片厚4μm，貼于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，56℃烘箱內(nèi)烤干，備用。免疫組織化學(xué)檢測采用SP法：制片后常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行微波抗原修復(fù)，PBS洗片3次，每次5min，放入濕盒中。0.3％H2O2孵育，室溫10min。PBS洗片3次，每次5min。正常血清(1∶10)孵育，室溫20min。除去多余血清滴加鼠抗HCVNS4A(1∶100稀釋)(購自英國abcam公司)第一抗體100μl于切片上，4℃，12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(購自北京中杉金橋公司)100μl于切片上，室溫30min。PBS洗3次，每次3min。鏈霉素抗生物素-過氧化物酶100μl，滴于切片上，室溫30min。PBS洗3次，每次5min。DAB顯色10min(購自北京中杉金橋公司)。充分水洗，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢、顯微攝影記錄結(jié)果。檢測結(jié)果如圖6-D所示，通過眼底靜脈叢水動力法轉(zhuǎn)染pCI-attB-AerApoEAATP-FLuc-ECMVIRES-HCV的新生鼠肝臟HCVNS4A免疫組織化學(xué)染色結(jié)果為陽性，而對照組(轉(zhuǎn)染pAA-Fluc真核表達(dá)質(zhì)粒)為陰性。