本發(fā)明涉及內(nèi)生真菌菌株提取多糖領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株及其產(chǎn)生的胞外多糖以及該胞外多糖的提取方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物內(nèi)生真菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的真菌，與菌根真菌只存在于植物根系不同，內(nèi)生真菌在植株的地下和地上部分的任何組織器官都能存在。研究發(fā)現(xiàn)：植物內(nèi)生真菌不僅包括了互惠共利的和中性的內(nèi)共生真菌，也包括了那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原菌；有的內(nèi)生真菌能促進(jìn)宿主植物的生長、增強(qiáng)宿主的抗逆性、促進(jìn)宿主植物活性成分的合成和積累，在提高植物產(chǎn)量和質(zhì)量中可以起到積極作用。因此，利用植物內(nèi)生真菌這一尚未深入挖掘的寶庫，同時植物內(nèi)生真菌在篩選活性物質(zhì)方面，表現(xiàn)出的巨大潛力，合成的次生代謝產(chǎn)物不但化學(xué)成分豐富，而且也具有多種多樣的生物活性的特點(diǎn)，選取傳統(tǒng)藥用植物鐵皮石斛(dendrobiumofficinale)作為宿主植物分離內(nèi)生真菌及真菌活性研究具有重要的意義。

鐵皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)屬蘭科附生草本植物，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺明目、抗癌防老等功效，位列“中華九大仙草”之首，廣泛運(yùn)用于慢性咽炎、閉塞性周圍血管病、白內(nèi)障、青光眼等疾病的治療藥方及各種保健品中，市場需求量很大，長期無制的采挖造成其資源枯竭，已無野生資源可用。至1987年，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物，在《中國植物紅皮書》中被列為瀕危種，現(xiàn)己成為國家二級保護(hù)植物。2010年版《中華人民共和國藥典》將鐵皮石斛從石斛類藥材中劃出，單獨(dú)收錄。

近二十年來，由于相關(guān)研究包括膜的化學(xué)功能、免疫物質(zhì)的研究以及對新藥物資源的尋找等，人們發(fā)現(xiàn)多糖在生物體中不僅作為能量資源或結(jié)構(gòu)材料，更重要的是它參與生命科學(xué)中細(xì)胞的各種活動，體現(xiàn)多種多樣的生物學(xué)及活性功能，如降血糖、血脂作用，心腦血管作用，抗腫瘤、抗菌、抗病毒作用，免疫增強(qiáng)或調(diào)節(jié)作用，肝、腸、胃保護(hù)作用，抗炎、抗氧化、抗衰老作用等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株，該菌株屬于腐皮鐮刀霉菌(fusariumsolani)，是采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)從鐵皮石斛植物活體中分離、純化得到。

本發(fā)明的目的還在于提供所述的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖，該胞外多糖具有良好的抑制病原菌的效果。

本發(fā)明的目的還在于提供一種提取所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖的方法，該方法包括如下流程：菌株活化-種子液培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng)-發(fā)酵液真空抽濾-抽濾液真空濃縮-濃縮液醇沉-沉淀離心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷凍干燥-獲得凍干粉，即為所述胞外多糖。

本發(fā)明的目的還在于提供所述的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖在抑制病原菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株，屬于腐皮鐮刀霉菌，命名為fusariumsolanid07，于2017年3月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武昌路珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏號為cctccno.m2017145。

一種由上述所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖的提取方法，包括如下步驟：

(1)將所述鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株活化培養(yǎng)后，進(jìn)行種子液培養(yǎng)，再將得到的種子液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

(2)將步驟(1)發(fā)酵培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液真空抽濾，得到的抽濾液進(jìn)行真空濃縮、醇沉、離心，將離心得到的沉淀脫水處理、干燥后，溶于去離子水中進(jìn)行透析，對透析液進(jìn)行真空冷凍干燥，得到所述鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述活化培養(yǎng)是采用試管斜面培養(yǎng)方法，于28±1℃活化培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(固體pda)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述種子液培養(yǎng)是采用馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(pdb)，于28±1℃、120rpm搖床培養(yǎng)48～72小時。

進(jìn)一步地，步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)是按5v％～15v％的接種量將種子液接種于馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，于28±1℃、120rpm搖床發(fā)酵培養(yǎng)7～14天。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述真空濃縮是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于45℃將抽濾液濃縮為原液的1/10體積。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述醇沉是采用濃縮液：95vol％乙醇＝1：4的體積比混合均勻，4℃靜置12～24小時。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述離心是在8000rpm離心15分鐘。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述脫水處理是依次采用無水乙醇、丙酮和石油醚洗滌進(jìn)行脫水處理。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述干燥是在溫度50～55℃下進(jìn)行干燥。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，經(jīng)脫水處理、干燥后的沉淀在溶于去離子水后的濃度為0.05～0.2g/ml。

進(jìn)一步地，步驟(2)中，所述透析是采用截留分子量3500da透析袋蒸餾水透析24～72小時。

由上述任一項(xiàng)所述的提取方法提取得到的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖。

提取得到的胞外多糖具有良好的抑菌活性，對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的病原菌具有明顯的抑制作用，將所述的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖應(yīng)用于抑制病原菌中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的病原菌具有明顯的抑制活性作用，能很好地應(yīng)用于抑制病原菌中；

(2)本發(fā)明的提取方法工藝簡單易行，條件溫和、易于控制，為大規(guī)模提取鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖提供了新路徑，同時為通過改進(jìn)內(nèi)生真菌與宿主植物的相互作用提高胞外多糖產(chǎn)量提供新的思路。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天于100倍顯微鏡下觀察到的菌絲形態(tài)圖。

圖2a和圖2b為實(shí)施例1中的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天于不同倍率下掃描電鏡下觀察到的菌絲形態(tài)圖。

圖3a和圖3b為實(shí)施例1中的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07于pda培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天于不同倍率下掃描電鏡下觀察到的孢子形態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例以及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。

以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件、實(shí)驗(yàn)室手冊中所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明具體實(shí)施例的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株，屬于腐皮鐮刀霉菌，命名為fusariumsolanid07，于2017年3月27日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(湖北省武漢市武昌路珞珈山武漢大學(xué)，郵編430072)，保藏號為cctccno.m2017145；

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(its)和5.8s核糖體rna編碼基因如seqidno.1所示。

本發(fā)明具體實(shí)施例的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖，通過如下方法流程提取得到：

菌株活化-種子液培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng)-將發(fā)酵液真空抽濾-將抽濾液真空濃縮-將濃縮液醇沉-沉淀離心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷凍干燥-凍干粉，即為所述胞外多糖；

將得到的胞外多糖用蒸餾水溶解后，胞外多糖含量參照《2010版中國藥典一部》中的苯酚—硫酸比色法測定。

本發(fā)明具體實(shí)施例的一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的病原菌具有明顯的抑制作用，抑菌活性評價包括如下方法流程：

病原菌菌株活化-種子液培養(yǎng)-平板涂布-含所述菌株胞外多糖濾紙片接種-培養(yǎng)-抗菌結(jié)果觀察；

具體抑菌活性評價，包括如下步驟：

(1)病原菌菌株采用試管斜面培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(固態(tài)lb培養(yǎng)基)，于37±1℃活化培養(yǎng)24小時；

(2)活化培養(yǎng)后的菌種轉(zhuǎn)移至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(液態(tài)lb培養(yǎng)基)中，于37±1℃搖床160rpm種子液培養(yǎng)24小時，得到種子液；

(3)將得到的種子液接種于涂布平板培養(yǎng)基(以牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基為涂布平板培養(yǎng)基)中，凝結(jié)后于37±1℃培養(yǎng)24小時；

(4)濾紙片采用6mm直徑打孔器獲取，濾紙片滅菌后浸泡在濃度0.05g/l的胞外多糖溶液中，風(fēng)干后，置于培養(yǎng)好測試菌株的培養(yǎng)皿中，平板37℃倒置培養(yǎng)24～48小時。

實(shí)施例1

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07的固體培養(yǎng)特征為：

在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基上于28±1℃培養(yǎng)4～7天，最初其生菌絲為無色，漸變?yōu)榧t色；菌落呈淺白絨毛狀，邊緣不整齊；菌絲體白色，發(fā)達(dá)，背面最初白色，漸變?yōu)榧t色。

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07的液體培養(yǎng)特征為：

(1)培養(yǎng)基pdb，搖瓶培養(yǎng)7天，培養(yǎng)溫度為28±1℃；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)特征：培養(yǎng)第1-2天，未見明顯生長現(xiàn)象；培養(yǎng)第三天，有深紅色菌絲出現(xiàn)；

培養(yǎng)第4-5天，菌絲增多，培養(yǎng)5天于100倍顯微鏡下觀察到的菌絲形態(tài)圖如圖1所示，培養(yǎng)5天于不同倍率下掃描電鏡下觀察到的菌絲形態(tài)圖如圖2a和圖2b所示，而培養(yǎng)5天于不同倍率下掃描電鏡下觀察到的孢子形態(tài)圖如圖3a和圖3b所示；

培養(yǎng)第6天，培養(yǎng)瓶瓶壁黏附有深紅色菌絲，培養(yǎng)液中有1-2mm深紅色菌絲球；

培養(yǎng)地7天，菌絲球增大到2-4mm。

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07的形態(tài)特征為：

(1)無性繁殖，菌絲體密集，成樹枝狀，側(cè)生大量帶梗孢子囊，孢子囊中最多可含22個孢子；

(2)有性世代，未發(fā)現(xiàn)。

實(shí)施例2

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖的提取，包括如下方法流程：

菌株活化-種子液培養(yǎng)-發(fā)酵培養(yǎng)-將發(fā)酵液真空抽濾-將抽濾液真空濃縮-將濃縮液醇沉-沉淀離心-沉淀水溶后透析-透析液真空冷凍干燥-凍干粉，即為所述胞外多糖；

具體提取過程包括如下步驟：

(1)取鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體pda培養(yǎng)基試管，于28±1℃活化培養(yǎng)72小時；

(2)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體pdb種子培養(yǎng)基中，于28±1℃、120rpm搖床培養(yǎng)72小時，得種子液；

(3)在無菌條件下，將種子液按10v％(體積百分比)接種量接入500ml液體培養(yǎng)基中，于28±1℃、120rpm搖床培養(yǎng)7天；

(4)將發(fā)酵液真空抽濾，抽濾液于45℃下旋蒸濃縮至1/10體積，然后添加4倍體積于濃縮液的95vol％乙醇，劇烈震蕩后，4℃靜置24小時，得到醇沉液；

(5)將醇沉液8000rpm離心15分鐘，棄去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌脫水，50℃烘干后，采用去離子水溶解，溶解后的濃度為0.2g/ml；

(6)溶解于去離子水后的沉淀采用3500da截留分子量透析袋蒸餾水透析24小時，得到透析液；

(7)對得到的透析液進(jìn)行冷凍干燥，得到凍干粉，即為鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株fusariumsolanid07產(chǎn)生的胞外多糖。

獲取的胞外多糖產(chǎn)量為1.77g/l。

實(shí)施例3

鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖的抑菌效果測試

(1)取選用的4種常見病原菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌菌種，在無菌條件下，用接種針挑取少量病原菌菌落，接入已滅菌的固體lb培養(yǎng)基試管，于37±1℃活化24小時；

(2)取活化培養(yǎng)后的菌種，在無菌條件下，轉(zhuǎn)接入已滅菌的液體lb種子培養(yǎng)基中，于37±1℃、160rpm搖床培養(yǎng)24小時，得種子液；

(3)在無菌條件下，按2v％(體積百分比)接種量接入10ml液體lb平板培養(yǎng)基中，晃動平板，使種子液和lb液體培養(yǎng)基混合均勻，超凈工作臺中待其凝固后于37±1℃培養(yǎng)24小時；

(4)將實(shí)施例2獲取的鐵皮石斛內(nèi)生真菌胞外多糖凍干粉采用去離子水配成0.05g/l的胞外多糖溶液；

(5)實(shí)驗(yàn)組吸取0.05g/l的胞外多糖溶液20ul于濾紙片(φ＝0.6cm，已滅菌)上，而空白對照組則于無菌濾紙片上添加20ul無菌水，略微風(fēng)干后，置于含有測試菌的培養(yǎng)皿中，一種測試菌的培養(yǎng)皿中放3個濾紙片；

(6)將制好后的測試菌培養(yǎng)皿置于37℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h后觀察，測其抑菌圈的大小。

抑菌圈的觀察結(jié)果如表1所示。

表1實(shí)施例2提取得到的菌株產(chǎn)生的胞外多糖的抗菌活性結(jié)果

由表1結(jié)果可見，鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖對包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的四種病原的抑菌圈半徑均大于空白對照組，說明鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的胞外多糖具有明顯的抑制常見致病菌的作用。

應(yīng)當(dāng)理解，以上實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)當(dāng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些各種改動或修改的等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。

sequencelisting

<110>華南理工大學(xué)

<120>一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株及其產(chǎn)生的胞外多糖以及該胞外多糖的提取方法與應(yīng)用

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