專利名稱：防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及防治禽類疾病的疫苗及其制備，特別是防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗及其制備方法。
目前，使用的防治雞新城疫(ND)、傳染性支氣法氏囊炎(IBD)三聯(lián)油乳劑滅活苗，國(guó)內(nèi)外均采用病毒培養(yǎng)、提取、濃縮的方法制備，一般是采用將每一種雞病的病毒進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)的方法，在雞胚或細(xì)胞中進(jìn)行，然后按一定比例提取濃縮制備成疫苗，在使用時(shí)單獨(dú)使用或按一定比例混合使用，缺點(diǎn)是制備工藝復(fù)雜、浪費(fèi)原材料，給使用者帶來(lái)不便。
本發(fā)明的目的是，針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足進(jìn)行改進(jìn)，提出防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是，采用含有雞新城疫病毒(NewcastleDlseaseVlrcrs，簡(jiǎn)稱NDV)，傳染性支氣管炎病毒(InfectlonsBronchltlsVlrus，簡(jiǎn)稱IDV)、傳染性法氏囊炎病毒(InfectlonsBursalDlseaseVlrus，簡(jiǎn)稱IBDV)三種病毒抗原體疫苗，疫苗系滅活疫苗，其特征在于，疫苗是采用同一雞胚中培養(yǎng)提取的含有雞新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊炎病毒(IBDV)的三種疫苗病毒抗原的混合液，該混合液經(jīng)滅合處理制備而成。
滅活疫苗的成品為白色油乳劑。
防治雞病的三病油乳劑滅活疫苗的制備方法，采用雞新城疫病毒毒株，傳染性支氣管炎病毒毒株和傳染性法氏囊炎病毒毒株作毒種種源，選用符合制備疫苗病毒抗原用的未經(jīng)雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊炎三種疫苗免疫的健康雞群所產(chǎn)的受精蛋作制備用毒的培養(yǎng)體，其特征在于，采用同胚培養(yǎng)法取替單獨(dú)培養(yǎng)法，將取自各毒種種源的雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒采用一次接種于培養(yǎng)體中，使它們?cè)谕浑u胚中培養(yǎng)，經(jīng)孵化、冷卻、消毒多道工序，從雞胚中收取胚液，經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)合格，再作毒價(jià)檢測(cè)，隨即將毒價(jià)檢測(cè)合格的雞胚液進(jìn)行滅活處理，用作疫苗抗原劑，再分別進(jìn)行水相和油相制備，將油相和水相按比例攪拌混合均勻制得滅活疫苗成品。
毒種接種的具體步驟是，先將雞新城疫苗毒毒株種毒以100倍、傳染性法氏囊炎病毒毒株種毒以10倍稀釋，傳染性支氣管炎病毒毒株種毒以10-3-10-5的濃度稀釋，然后各取1ml，加入100ml生理鹽水中配成混合毒液，將混合毒液接種于孵育9-10日發(fā)育良好的雞胚尿囊中，每胚按0.1ml混合毒液接種，接種孔用蠟封好。
接種后，培養(yǎng)基置于37℃-39℃條件下繼續(xù)孵化到96小時(shí)，經(jīng)照蛋，棄去死胚，活胚經(jīng)冷卻無(wú)菌操作，從中收獲胚液。
三種毒的毒價(jià)檢測(cè)的合格指標(biāo)，其雞胚半數(shù)感染量EID50≥106/0.1ml。
將經(jīng)過(guò)毒價(jià)檢測(cè)合格的雞胚液按先計(jì)量后加入終濃度0.1%甲醛溶液方式進(jìn)行病毒抗原滅活處理。
油相制備是取94%10號(hào)白油加6%司本80混合后再加入2%的硬脂酸鋁，邊加熱邊攪拌至透明止，高壓消毒備用。
水相制備是將滅活處理后的雞胚液置于容器中，加入4%吐溫80，用力搖動(dòng)使吐溫80充分混勻于雞胚液中。
油包水滅活疫苗的制備是，取3份油相放入膠磨或乳劑缸內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速攪拌，同時(shí)加入1份水相，加完后，再以10000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌2分鐘，制成油乳劑滅活疫苗的成品。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，采用同胚混合培養(yǎng)，使得雞胚尿囊液中三種病毒滴度同時(shí)達(dá)到高峰，按此方法培養(yǎng)的混合毒不需濃縮即可制備油乳劑滅活疫苗，其效果可以達(dá)到單一培養(yǎng)后再按比例混合制得的三聯(lián)油乳劑滅活苗，工藝上省時(shí)省工、節(jié)約原材料，降低了生產(chǎn)成本，給使用者帶來(lái)了方便，一針可以防治三種雞病。
下面根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)解決方案詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。
1、選擇NDV Lasota弱毒株，IBV M41毒株，由中國(guó)獸藥監(jiān)察所保管、鑒定、供應(yīng)。
制備疫苗用的IBDV HB91系進(jìn)口毒株經(jīng)雞胚適應(yīng)3代獲得，由湖北省畜牧獸醫(yī)研究所分離和保存。
NDV Lasota、IBV M41毒株的性能標(biāo)準(zhǔn)、保存、繼代、無(wú)菌檢驗(yàn)等均按《部頒規(guī)程》中有關(guān)上述三種毒保存、檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行。
IBDV HB913代適應(yīng)株，其含毒滴度為106-7EID50/0.1ml，濕毒(50%甘油保護(hù)劑)-25℃可保存12個(gè)月。
2、同胚培養(yǎng)NDV、IBV、IBDV三種毒。
選擇符合制備疫苗要求用的未經(jīng)雞新城疫(ND)、傳染性支氣管炎(IB)和傳染性法氏囊炎(IBD)三種疫苗免疫雞群所產(chǎn)的新鮮受精雞蛋作為培養(yǎng)基，清除受精蛋表面的污物，用消毒藥擦拭干凈，然后置于38-39℃的孵化箱內(nèi)孵化，相對(duì)濕度保持在60-70%。
進(jìn)行一次毒種接種，接種的具體步驟是，先將NDV，Lasotca株以100倍，IBDV HB91以10倍稀釋，IBV M41以10-3-10-5的濃度稀釋，然后各取1ml加入100ml無(wú)菌生理鹽水中，制成混合毒液，再將混合毒液接種于作為培養(yǎng)基的已孵育了9-10日發(fā)育良好的雞胚尿囊內(nèi)，每胚按0.1ml接種，接種后將蛋殼上的接種孔用蠟封好，將其置于37℃的條件下繼續(xù)孵化96小時(shí)，照蛋、棄去死胎，在4℃冷卻24小時(shí)。
雞胚液的提取，將冷卻的雞胚取出，放入空氣干燥室內(nèi)，以避免過(guò)多凝結(jié)水造成對(duì)培養(yǎng)基基體的污染，將蛋殼的氣室部位用碘酊消毒后，以無(wú)菌手術(shù)剝?nèi)馐也课坏牡皻?，將蛋殼膜，用尖頭小攝子將絨毛尿囊膜及羊膜撕破，抽取收集胚液，注意每個(gè)雞胚提取雞胚液之前均應(yīng)檢查，凡胎兒腐敗者，胚液混濁及有任何污染可疑的雞胚，都應(yīng)棄去。
3、進(jìn)行檢測(cè)對(duì)收集的雞胚液，作無(wú)菌檢測(cè)，按《部頒規(guī)程》進(jìn)行，觀察3天應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。
對(duì)經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后合格的雞胚液再進(jìn)行毒價(jià)檢測(cè)。雞胚液混合毒價(jià)檢測(cè)均用無(wú)ND、IB、IBD抗體的雞胚，測(cè)定雞胚半數(shù)感染量(EID50)，用抗NDV、IBV和IBDV特異性高免血清封閉相應(yīng)病毒。具體操作如下，將含毒胚液用生理鹽水稀釋10-3分別放入三支無(wú)菌管中，每管1ml，第一管加入IB和IBD高免血清各0.5ml，第二管加入ND和IBD高免血清各0.5ml，第三管加入ND和IB高免血清各0.5ml，在25℃下中和1小時(shí)后，將每管稀釋為10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、五個(gè)組，每組接種9-10日齡雞胚5-6個(gè)，每種毒同時(shí)設(shè)6個(gè)正常的雞胚對(duì)照在37-39℃培養(yǎng)箱中孵化。
NDV毒價(jià)判定，第一排管測(cè)NDV毒價(jià)，將10-5-10-8每組接種5-6胚，每胚0.1ml，48小時(shí)前死亡的雞胚不計(jì)，隨時(shí)取出48-96小時(shí)死亡的雞胚。收獲雞胚液，同組等量混合至96小時(shí)，取出活胎，逐個(gè)收獲胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，1∶80上為感染，計(jì)算其半數(shù)感染量(EID50)EID50≥107/0.1ml判定為合格。
IBV毒價(jià)判定，第二排管測(cè)IBV毒價(jià)，將10-4-10-8五個(gè)組，每組接種9-10日齡雞胚5-6個(gè)，每胚尿囊接種0.1ml，觀察6天，接種胚應(yīng)在2-6天死亡或至6天時(shí)，有活的雞胚中部分出現(xiàn)胎兒無(wú)水，蜷縮、發(fā)育小(接種胎兒比對(duì)照中未接種中最輕胎兒重量低2克以上)，根據(jù)死胎兒數(shù)和胎兒出現(xiàn)特異性病痕數(shù)測(cè)定其EID50，EID50應(yīng)≥106/0.1ml以上判定合格。
IBDV毒價(jià)的判定，第三排管測(cè)IBDV毒價(jià)，在10-4-10-8五組中各接種8-9日齡雞胚5-6個(gè)，每胚尿囊膜(CAM)接種0.1ml，觀察4天24小時(shí)死胚棄出，48小時(shí)死亡胎及96小時(shí)活胎逐個(gè)檢查，觀察雞胚IBD特異病變，腿胸肌條狀，點(diǎn)狀出血、斑駁樣肝臟和蒸熟樣心臟，根據(jù)特異性病變胎兒數(shù)計(jì)算其EID50，EID50≥106/0.1ml應(yīng)判定合格。
4、疫苗制備病毒抗原滅活。將測(cè)毒價(jià)合格的雞胚液倒入玻璃瓶?jī)?nèi)，計(jì)量后加入終濃度0.1%甲醛溶液，隨加隨搖再傾斜倒入另一瓶中，以避免瓶口壁附近粘附的病毒未能接觸到滅活劑，然后放37℃，滅活16-20小時(shí)，從瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)37℃開(kāi)始計(jì)時(shí)，在滅活期間搖蕩3-4次，至?xí)r取出，4℃左右保存?zhèn)溆谩?br> 油相制備，取94份10號(hào)白油和6份司本80混合后，再加入2份硬脂酸鋁，隨加隨攪拌，至透明為止，高壓消毒備用。
水相制備，將經(jīng)滅活處理的雞胚液裝入在玻璃瓶中，加入4%吐溫80，用力搖動(dòng)，使吐溫80充分溶解于雞胚液中。
油包水(W/O)滅活疫苗的制備，取3份油相放入膠體磨或者乳劑缸內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，加入1份水相，加完后再以10000轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌2分鐘，并加入1/萬(wàn)硫酸柳汞溶液，制成油乳劑滅活疫苗。
將孵化好的疫苗分裝，貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽應(yīng)標(biāo)明制品的名稱、批號(hào)、裝量、用法、保存方法，制造日期、制造單位。
該滅活疫苗的成品為白色乳劑、油乳型，有較好的穩(wěn)定性。
根據(jù)上述制備方法制備的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗，含有雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊炎三種病毒的抗原成份，疫苗系滅活疫苗，該三聯(lián)疫苗中的三種病毒抗原是采用同一雞胚中培養(yǎng)提取的含有雞新城疫病毒NDV、傳染性支氣管炎病毒IBV、傳染性法氏囊炎病毒IBDV的三種毒后經(jīng)毒價(jià)測(cè)定滅活處理制備的病毒抗原。其系混合毒液，一針可以防治三種雞病，進(jìn)行防治雞病的免疫十分方便。
權(quán)利要求
1.防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗，含有雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒，傳染性法氏囊炎病毒抗原，疫苗系滅活疫苗，其特征在于，疫苗中的三種病毒抗原是同一雞胚中培養(yǎng)提取的含有雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性法氏囊炎病毒的三種疫苗病毒抗原的混合液，該混合液經(jīng)滅活處理制備而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗，其特征在于，滅活疫苗的成品為白色油乳劑。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，采用雞新城疫病毒毒株，傳染性支氣管炎病毒毒株和傳染性法氏病毒毒株作毒種種源，選用符合制備疫苗病毒抗原用的未經(jīng)雞新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊炎三種疫苗免疫的健康雞群所產(chǎn)的受精蛋作制備用毒的培養(yǎng)體，其特征在于，采用同胚培養(yǎng)法取替單獨(dú)培養(yǎng)法，將取自各毒種種源的雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒，傳染性法氏囊炎病毒采用一次接種于培養(yǎng)體中，使它們?cè)谕浑u胚中培養(yǎng)，經(jīng)孵化、冷卻、消毒多道工序，從雞胚中收取胚液，經(jīng)無(wú)菌檢測(cè)合格，再作毒價(jià)檢測(cè)，隨即將毒價(jià)檢測(cè)合格的雞胚液進(jìn)行滅活處理，用作疫苗抗原劑，再分別進(jìn)行水相和油相制備，將油相與水相按比例攪拌混合、均勻，制得滅活疫苗成品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，毒種接種的具體步驟是，先將雞新城疫病毒毒株種毒以100倍，傳染性法氏囊炎病毒毒株種毒以10倍稀釋，傳染性支氣管炎病毒毒株種毒以103-105的濃度稀釋，后各取1ml加入100ml無(wú)菌生理鹽水，配成混合毒液，將混合毒液接種于孵育9-10日的培養(yǎng)基中發(fā)育良好的雞胚尿囊中，每胚按0.1ml混合毒液接種，接種孔用蠟封好。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，接種后，培養(yǎng)基置于37℃-39℃條件下繼續(xù)孵化到96小時(shí)，經(jīng)照蛋、棄去死胚，活胚經(jīng)冷卻、無(wú)菌操作，從中收獲胚液。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑活性疫苗的制備方法，其特征在于，三種毒的毒價(jià)檢測(cè)的合格指標(biāo)，其雞胚半數(shù)感染量EID50≥106/0.1ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，將經(jīng)過(guò)毒價(jià)檢測(cè)合格的雞胚液按先計(jì)量后加入終濃度0.1%甲醛溶液方式進(jìn)行病毒抗原滅活處理。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，油相制備是取94%10號(hào)白油加6%司本80，混合后再加入2%的硬脂酸鋁，邊加熱邊攪拌至透明止，高壓消毒備用。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，水相制備是將滅活處理后的雞胚液置于容器中，加入4%吐溫80，用力搖動(dòng)使吐溫80充分混勻于雞胚液中。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種權(quán)利要求1所述的防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，油包水滅活疫苗的制備是，取3份油相放入膠磨或乳劑缸內(nèi)，開(kāi)動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)加入1份水相，加完后再以10000轉(zhuǎn)/分鐘，攪拌2分鐘，制成油乳劑滅活疫苗的成品。
全文摘要
本發(fā)明涉及防治雞病的三聯(lián)油乳劑滅活疫苗及其制備方法，其含有雞新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊炎病毒，三種病毒由同胚培養(yǎng)法獲得，其方法是用同胚培養(yǎng)取替單獨(dú)培養(yǎng)，一次接種使三種病毒在同一雞胚中培養(yǎng)，經(jīng)孵化、冷卻、消毒等工序從雞胚中收取胚液，對(duì)經(jīng)無(wú)菌、毒價(jià)檢測(cè)合格的雞胚胚液，通過(guò)制備水相和油相，按比例混合乳化制得成品，疫苗為白色油乳型，其優(yōu)點(diǎn)省工、省時(shí)、節(jié)約原材料，方便使用，一針預(yù)防三種雞病。
文檔編號(hào)A61K39/295GK1106700SQ9410948
公開(kāi)日1995年8月16日 申請(qǐng)日期1994年8月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月17日
發(fā)明者邵華斌, 楊峻, 陳守仁, 王文清, 黎秋華, 楊年娣, 甘伏生 申請(qǐng)人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所