專利名稱：一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種甲肝病毒的生產(chǎn)方法。
技術(shù)背景
甲型肝炎簡稱甲肝，是由甲型肝炎病毒引起的傳染病，本病傳播以糞-口途徑為主，甲肝病毒隨糞便排出體外，可通過日常生活接觸、經(jīng)水、食物等方式經(jīng)口傳播，發(fā)達(dá)國家主要通過人與人接觸傳播，經(jīng)污染水源、食物傳播常發(fā)生在發(fā)展中國家和地區(qū)，最突出的例子是上海兩次甲型肝炎大爆發(fā)，均因食用未經(jīng)煮熟的毛蚶引起，1983年第一次爆發(fā)時有2 萬人發(fā)病，1988年春季，患者近30萬，給國家經(jīng)濟(jì)和人民健康造成嚴(yán)重?fù)p失。
目前國內(nèi)主要采取的生產(chǎn)方式是采取的轉(zhuǎn)瓶式和細(xì)胞工廠等容器靜態(tài)低密度培養(yǎng)方式培養(yǎng)病毒抗原，再通過純化等工藝制備甲肝疫苗，該生產(chǎn)工藝存在著生產(chǎn)水平低下， 工藝參數(shù)不夠穩(wěn)定，同時操作復(fù)雜，生產(chǎn)強(qiáng)度大，易發(fā)生污染等缺點。同時由于傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝批量較小，從而導(dǎo)致疫苗產(chǎn)品批間差異大，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性不夠好。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案
一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO6個/ml以上時，棄培養(yǎng)液，按照 0. 001 0. 01M0I的比例混合接種甲肝病毒種子；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲肝病毒的細(xì)胞用維持液維持培養(yǎng)感染甲肝病毒的細(xì)胞，每天更換維持液，維持培養(yǎng)14 觀天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用無菌注射用水或低滲溶液溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從微載體上剝離，篩網(wǎng)分離微載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟一的細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞株，傳代細(xì)胞系和原代培養(yǎng)細(xì)胞中的任一種。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述人二倍體細(xì)胞株為WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一種。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述傳代細(xì)胞系為Vero細(xì)胞。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟一的微載體為顆粒狀實心微球載體、多孔性微球載體、網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體和片狀纖維結(jié)構(gòu)載體中的任一種。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟二的甲肝疫苗生產(chǎn)用病毒種子為甲型肝炎病毒 HM175 株。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述步驟三維持液為MEM維持液。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)本發(fā)明采用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞，實現(xiàn)了基質(zhì)細(xì)胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)，提高了甲肝疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量穩(wěn)定性。
(2)本發(fā)明避免了常規(guī)生產(chǎn)工藝中由于人工操作帶來的污染。
(3)本發(fā)明在線檢測保證了所收獲的病毒培養(yǎng)物的高表達(dá)，保證了生產(chǎn)質(zhì)量。
(4)本發(fā)明操作簡單，生產(chǎn)強(qiáng)度不大。
具體實施方式
實施例1
一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用顆粒狀實心微球載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO6個/ml時，棄培養(yǎng)液，按照0. 001M0I 的比例混合接種甲型肝炎病毒HM175株；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞用MEM維持液維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞，每天更換MEM維持液，維持培養(yǎng)14天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄MEM維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用無菌注射用水溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從顆粒狀實心微球載體上剝離，篩網(wǎng)分離顆粒狀實心微球載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞株WI-38。
實施例2
一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用多孔性微球載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO7個/ml時，棄培養(yǎng)液，按照0. 01M0I 的比例混合接種甲型肝炎病毒HM175株；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞用MEM維持液維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞，每天更換MEM維持液，維持培養(yǎng)28天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄MEM維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用無菌注射用水溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從多孔性微球載體上剝離，篩網(wǎng)分離多孔性微球載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞株KMB17。
實施例3
—種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用顆粒狀實心微球載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO6個/ml時，棄培養(yǎng)液，按照0. 001M0I 的比例混合接種甲型肝炎病毒HM175株；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞用MEM維持液維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞，每天更換MEM維持液，維持培養(yǎng)14天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄MEM維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用無菌注射用水溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從顆粒狀實心微球載體上剝離，篩網(wǎng)分離顆粒狀實心微球載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞株KMB17。
實施例4
一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO6個/ml時，棄培養(yǎng)液，按照0. 001M0I 的比例混合接種甲型肝炎病毒HM175株；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞用MEM維持液維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞，每天更換MEM維持液，維持培養(yǎng)14天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄MEM維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用低滲溶液溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體上剝離，篩網(wǎng)分離網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述細(xì)胞為Vero細(xì)胞系。
實施例5
一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟
步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用片狀纖維結(jié)構(gòu)載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞；
步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO8個/ml時，棄培養(yǎng)液，按照0. 01M0I 的比例混合接種甲型肝炎病毒HM175株；
步驟三維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞用MEM維持液維持培養(yǎng)感染甲型肝炎病毒HM175株的細(xì)胞，每天更換MEM維持液，維持培養(yǎng)28天；
步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；
步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄MEM維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；
步驟六收集細(xì)胞懸液采用低滲溶液溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從片狀纖維結(jié)構(gòu)載體上剝離，篩網(wǎng)分離片狀纖維結(jié)構(gòu)載體，收集細(xì)胞懸液；
步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
進(jìn)一步的技術(shù)方案是，所述細(xì)胞為原代培養(yǎng)細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于依次包括以下步驟 步驟一細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增將細(xì)胞復(fù)蘇，并采用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)細(xì)胞； 步驟二 接種甲肝病毒種子當(dāng)細(xì)胞濃度為IO6個/ml以上時，棄培養(yǎng)液，按照0. 001 0. 01M0I的比例混合接種甲肝病毒種子；步驟三維持培養(yǎng)感染甲肝病毒的細(xì)胞用維持液維持培養(yǎng)感染甲肝病毒的細(xì)胞，每天更換維持液，維持培養(yǎng)14 觀天；步驟四檢測病毒感染復(fù)制情況從第14天開始，每天抽樣，采用免疫熒光法測定細(xì)胞中的病毒抗原，檢測病毒感染復(fù)制情況；步驟五終止培養(yǎng)在病毒感染、復(fù)制高峰期終止培養(yǎng)，棄維持液，收獲培養(yǎng)的感染細(xì)胞；步驟六收集細(xì)胞懸液采用無菌注射用水或低滲溶液溶脹破裂細(xì)胞，并輔以攪拌，將細(xì)胞從微載體上剝離，篩網(wǎng)分離微載體，收集細(xì)胞懸液； 步驟七將細(xì)胞懸液提取、純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟一的細(xì)胞為人二倍體細(xì)胞株，傳代細(xì)胞系和原代培養(yǎng)細(xì)胞中的任一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述人二倍體細(xì)胞株為WI-38，MRC-5，2BS，KMB17中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述傳代細(xì)胞系為Vero細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟一的微載體為顆粒狀實心微球載體、多孔性微球載體、網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)載體和片狀纖維結(jié)構(gòu)載體中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟二的甲肝疫苗生產(chǎn)用病毒種子為甲型肝炎病毒HM175株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，其特征在于所述步驟三維持液為MEM維持液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種疫苗生產(chǎn)用甲肝病毒的生產(chǎn)方法，依次包括以下步驟細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代擴(kuò)增；接種甲肝病毒種子；維持培養(yǎng)感染甲肝病毒的細(xì)胞；檢測病毒感染復(fù)制情況；終止培養(yǎng)，棄維持液，收獲培養(yǎng)感染細(xì)胞；收集細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液提取、純化。本發(fā)明不僅操作簡單，生產(chǎn)強(qiáng)度不大；而且實現(xiàn)了基質(zhì)細(xì)胞的高密度大規(guī)模培養(yǎng)，提高了甲肝疫苗的產(chǎn)量和質(zhì)量穩(wěn)定性，避免了常規(guī)生產(chǎn)工藝中由于人工操作帶來的污染。
文檔編號C12N7/00GK102492659SQ20111035909
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者侯文禮, 趙志鵬 申請人:成都康華生物制品有限公司