一種快速鑒別1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛糠椒?br> 【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛縍T-PCR特異性引物，是對GenBank上已發(fā)表的DHAV-1、DHAV-3的序列進(jìn)行比對，在兩種病毒基因序列的保守但相互之間差異又較大的區(qū)域，分別設(shè)計一對針對DHAV-1的特異性檢測引物SEQ1、SEQ2，一條Taqman探針Probe1；一對針對DHAV-3的特異性檢測引物SEQ3、SEQ4，一條Taqman探針Probe2；確定了針對DHAV-1和DHAV-3的雙重?zé)晒舛縍T-PCR的特異性引物及Taqman探針濃度；利用該組引物建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法，特異性好、靈敏度高，可以用于1型和3型鴨甲肝病毒的快速血清型鑒定和實時定量分析。
【專利說明】-種快速鑒別1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛糠椒?(一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明所涉及一種快速鑒別1型鴨甲肝病毒和3型鴨甲肝病毒混合感染的雙重?zé)?光定量RT-PCR方法，屬于病毒分子生物學(xué)領(lǐng)域。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨肝炎病毒包括鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV)、鴨星狀病毒（Duck astrovirus，DAstV)l型（DAstV-1)和2型（DAstV_2)3個不同的血清型，相互之間無抗原交 叉性。DHAV作為小RNA病毒科禽肝病毒屬的唯一成員，目前又分為三個基因型和血清型 ： DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3,三個血清型之間幾乎無交叉保護，我國主要流行的是DHAV-1和 DHAV-3。近年來，DHAV-1和DHAV-3混合感染情況日益嚴(yán)重，導(dǎo)致許多地區(qū)針對某型鴨病毒 性肝炎采取主動或被動免疫后仍不能有效控制鴨病毒性肝炎的發(fā)生和流行，給養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn) 造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。
[0003] 目前鴨病毒性肝炎的鑒定主要依靠流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀和病理變化，但不同 鴨肝炎病毒引起的鴨病毒性肝炎在流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化方面極為相似，特別是 兩種或多種病毒混合感染時，依靠上述方法和手段難以確定病毒類型。有效控制鴨病毒性 肝炎的前提是要明確鴨肝炎病毒的血清型并確定其在體內(nèi)的分布和含量，因此，加強鴨病 毒性肝炎病毒不同血清型鑒定和定量技術(shù)的研究對預(yù)防和控制鴨病毒性肝炎具有重要的 現(xiàn)實意義。傳統(tǒng)的病毒血清型鑒定需要分離培養(yǎng)獲得純化的病毒，通過單因子血清進(jìn)行鑒 定，這種方法費事費力，且無法對病毒進(jìn)行定量分析，對于雙重感染難以進(jìn)行鑒定。熒光 定量PCR方法在以其快速、精確、高靈敏度、特異的優(yōu)點，已在多種病毒的鑒定與檢測中得 到了廣泛應(yīng)用，與常規(guī)RT-PCR技術(shù)相比，該方法不僅可以對病毒基因型進(jìn)行鑒定，還可對 病毒在體內(nèi)的分布進(jìn)行精確定量。PCR方法鑒定的基礎(chǔ)是依據(jù)病原的基因型來進(jìn)行的，目 前的研究表明，不同鴨病毒性肝炎病毒的基因型與血清型相對應(yīng)，因此可以通過基因型的 檢測來完成對鴨肝炎病毒血清型的鑒定。目前我國鴨群中1型鴨甲肝病毒DHAV-1 (Duck hepatitis A virus typel, DHAV-l)，3 型鴨甲肝病毒 DHAV_3(Duck hepatitis A virus type3, DHAV-3)的單重及混合感染現(xiàn)象非常普遍，這給實際生產(chǎn)中的防治帶來了極大不便， 而且對二者混合感染后在鴨體內(nèi)的含量及動態(tài)分布尚未見報道。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種快速鑒定1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)?光定量RT-PCR方法，主要是設(shè)計并篩選了新的特異性引物和探針，優(yōu)化了反應(yīng)過程中的各 種參數(shù)，確定了針對DHAV-1和DHAV-3的雙重?zé)晒舛縍T-PCR的特異性引物及Taqman探 針濃度，能夠快速準(zhǔn)確地進(jìn)行DHAV-1和DHAV-3的血清型鑒定和定量分析。
[0005] -種檢測1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛縍T-PCR特異性引物，是對 GenBank上已發(fā)表的DHAV-1、DHAV-3的序列進(jìn)行比對，在兩種病毒基因序列的保守但相互 之間差異又較大的區(qū)域，分別設(shè)計一對針對DHAV-1的特異性檢測引物SEQ1、SEQ2, 一條 Taqman探針Probel ; -對針對DHAV-3的特異性檢測引物SEQ3、SEQ4, 一條Taqman探針 Probe2,引物序列如下：
[0006] SEQ1 :5, -AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3，，
[0007] SEQ2 :5' -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3'，
[0008] SEQ3 :5 ' -CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3 '，
[0009] SEQ4 :5 ' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3，，
[0010] SEQ5 :Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2，
[0011] SEQ6: Probe2 :5，F(xiàn)AM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3，TAMRA，
[0012] 所有引物以無菌ddH20(Rnase free)配成lOpmol/μ 1的濃度備用。
[0013] 上述引物、探針的使用方法為：
[0014] A、常規(guī)方法提取待測鴨肝組織總RNA作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)體系為：模 板 RNA4 μ 1，SEQ2/SEQ4 引物各 0· 5 μ 1，5XM-MLV Buffer2 μ 1，dNTPs (10. OmM) 2 μ 1，Rnase InhibitionO. 25μ 1，RTase M-MLV(5U/y 1)0. 5μ 1，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反應(yīng)程序 為：42°C反應(yīng) 50min，70°C 15min，獲得病毒 cDNA。
[0015] B、以病毒cDNA為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為：3. 45yL ddH20(Rnase free)，12. 5μ L Premix Ex Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ 1，R0X Reference Dye ΙΙ0· 25 μ 1，ProbelO. 5 μ 1 和 Probe20. 3 μ 1，2 μ 1 cDNA 模板。
[0016] PCR 反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 45s，40 個循環(huán)；于 60°C時收集熒光。
[0017] C、用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出測得Ct值所對應(yīng)的樣品濃度：反應(yīng)最終輸出的Ct值可用標(biāo) 準(zhǔn)曲線換算出對應(yīng)的樣品濃度，縱坐標(biāo)為所得Ct值，橫坐標(biāo)為樣品濃度的對數(shù)值。（見圖 1)。
[0018] 利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物及探針進(jìn)行雙重實時熒光定量RT-PCR檢測DHAV-1 和DHAV-3,最低可檢測到7拷貝/ μ 1的DHAV-lcDNA和11拷貝/ μ 1的DHAV-3cDNA，表明 本方法具有很高的靈敏性。
[0019] 用本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法對山東、河南、四川、廣東四個省12個 鴨場送檢的50只病死雛鴨的肝組織中分離到DHAV-1、DHAV-3進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣 品的檢測結(jié)果與常規(guī)RT-PCR的檢測結(jié)果符合率為100%，說明本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛?RT-PCR方法適合于1型和3型鴨甲肝病毒的血清型鑒定。本方法可以通過一次熒光定量 RT-PCR在同一反應(yīng)體系中完成對DHAV-1和DHAV-3的血清型鑒定和定量，因此可用于快速 鑒定鴨甲肝病毒的血清型并對其進(jìn)行定量檢測。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1雙重?zé)晒舛縍T-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0021] 縱坐標(biāo)（Ct值）代表PCR循環(huán)數(shù)；橫坐標(biāo)（2-7)，分別為102?10 7拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品 模板。反應(yīng)最終所輸出的Ct值可用標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的模板濃度。
[0022] 圖2雙重?zé)晒舛縍T-PCR針對DHAV-1和DHAV-3的擴增結(jié)果
[0023] 縱坐標(biāo)（Delta Rn)代表熒光強度；橫坐標(biāo)（1-40)，分別為1?40個PCR循環(huán)數(shù)。 該圖顯示了雙重?zé)晒舛縍T-PCR的擴增曲線，曲線與橫坐標(biāo)交點即為Ct值，Ct值是指在熒 光PCR擴增過程中，當(dāng)擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。在 熒光信號指數(shù)擴增起始階段（即熒光信號達(dá)到閾值之前），PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板 量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。
[0024] 圖3雙重?zé)晒舛縍T-PCR針對DHAV-1和DHAV-3擴增的重復(fù)性檢測結(jié)果
[0025] 縱坐標(biāo)（Delta Rn)代表熒光強度；橫坐標(biāo)（1-40)分別為1?40個循環(huán)數(shù)。該圖 顯示該雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法重復(fù)性良好。 (五）【具體實施方式】
[0026] 1引物設(shè)計
[0027] 本發(fā)明通過對參考GenBank上已發(fā)表的DHAV-1、DHAV-3的序列進(jìn)行比對，選擇在 這兩種病毒基因序列的保守區(qū)，分別設(shè)計一條針對DHAV-1的Taqman探針Probel、一對針對 DHAV-1的特異性檢測引物SEQ1/SEQ2 ;-條針對DHAV-3的Taqman探針Probe2、一對針對 DHAV-3的特異性檢測引物SEQ3/SEQ4。為了對建立的3雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法進(jìn)行靈 敏度測定，分別設(shè)計了一對DHAV-1的標(biāo)準(zhǔn)品引物SEQ5、SEQ6 (用以制備DHAV-1核酸模板標(biāo) 準(zhǔn)品以檢測建立方法的靈敏度）和一對DHAV-3的標(biāo)準(zhǔn)品引物SEQ7、SEQ8 (用以制備DHAV-3 核酸模板標(biāo)準(zhǔn)品以檢測建立方法的靈敏度）。
[0028] SEQ1 :5，-AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3，，
[0029] SEQ2 :5, -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3，，
[0030] SEQ3 :5，-CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3，，
[0031] SEQ4 :5 ' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3，，
[0032] SEQ5 :5，-AGACACATGTTGCTGAAAACT-3，，
[0033] SEQ6 :5' -CCTCTTCAAGAATTTGGGCACT-3，，
[0034] SEQ7 :5，-ACTTGTAGATGAGATC-3，，
[0035] SEQ8 :5, -CATACTTGCCACCAACTGCCA-3，，
[0036] SEQ9 :Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2，
[0037] SEQ10 :Probe2 :5, FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3, TAMRA，
[0038] DHAV-1檢測引物擴增片段位于DHAV-1基因組的6241?6391bp，大小為112bp， 標(biāo)準(zhǔn)品引物擴增片段位于6241?6732bp，大小為492bp。DHAV-3檢測引物擴增片段位于 DHAV-3基因組的5303?5449bp，大小為147bp，標(biāo)準(zhǔn)品引物擴增片段位于5058?5600bp， 大小為542bp。所有引物以無菌ddH 20(Rnase free)配成lOpmol/μ 1的濃度備用。
[0039] 2標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0040] 取實驗室所保存DHAV-1和DHAV-3鴨胚尿囊液，并分別對其提取DHAV-1和 DHAV-3基因組RNA,用DHAV-1和DHAV-3的檢測引物SEQ6、SEQ8分別對提取的DHAV-1RNA 和DHAV-3RNA做RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：模板RNA4 μ 1，SEQ6/SEQ8引物各0. 5 μ 1， 5XM-MLV Buffer2y 1, dNTPs(10. OmM) 2 μ 1, Rnase InhibitionO. 25 μ M, RTase M-MLV(5U/ μ 1)0. 5μ 1，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反轉(zhuǎn)錄條件：42°C 60min，72°C 15min，4°C保存； 以上述產(chǎn)物cDNA為模板，分別使用DHAV-1標(biāo)準(zhǔn)品引物SEQ5、SEQ6和DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)品引物 SEQ7、SEQ8對DHAV-1和DHAV-3的目的基因進(jìn)行PCR擴增，DHAV-1的PCR反應(yīng)體系為： ddH2016. 3μ 1，2· 5μ llOXTaq PCR Buffer(With Mg2.)，2μ 12. 5mM dNTP，1 μ 1 SEQ5 弓| 物， 1 μ 1SEQ6 引物，2 μ 1 DHAV-lcDNA模板，0· 2 μ 1 Taq DNA Polymerase (5U/ μ 1) ;DHAV-3 的PCR 反應(yīng)體系為：ddH2016. 3μ 1，2· 5μ llOXTaq PCR Buffer(With Mg2+)，2μ 12. 5mM dNTP，1 μ 1L SEQ7 引物，1 μ 1 SEQ8 引物，2μ 1 DHAV-3cDNA 模板，0· 2μ 1 Taq DNA Polymerase(5U/y 1)。 PCR擴增條件均為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30個循 環(huán)；72°C延伸lOmin，4°C保存。分別將PCR所得產(chǎn)物連接至pMD18-T構(gòu)建重組質(zhì)粒，對重組 質(zhì)粒用EcoR I單酶切線性化后進(jìn)行回收純化并測定其含量，得到含有DHAV-1和DHAV-3目 的基因片段的線性化質(zhì)粒作為檢測標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和靈敏度、重復(fù)性評價。
[0041] 3雙重?zé)晒舛縍T-PCR條件的優(yōu)化
[0042] 對引物、dNTPs、Buffer的濃度，及退火溫度等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到多重RT-PCR最 佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。
[0043] (1)分別將含有DHAV-1和DHAV-3目的基因片段的線性化質(zhì)粒作為檢測標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn) 行十倍梯度稀釋（1〇 7?1〇2拷貝/ μ 1)，以各個梯度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR 反應(yīng)。最終優(yōu)化的反應(yīng)體系為：3·45μ 1 ddH20(Rnase free)，12.5y 1 Premix Ex Taq， SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4各 1μ 1，ROXReferenceDye ΙΙ0·25μ 1，Probel(SEQ9)0.5y 1 和 Probe2 (SEQ10) 0· 3 μ 1，2 μ 1 標(biāo)準(zhǔn)品模板。
[0044] 優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 458,40個循環(huán)；于601：時收集 熒光（見圖2)。結(jié)果顯示，1型鴨甲肝病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = -3. 2850x+40. 812,相關(guān)系數(shù)為 0· 9985,循環(huán)效率為101. 5 % ;3型鴨甲肝病毒標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = -3. 2791+39. 216,相關(guān)系數(shù) 為0· 9994,循環(huán)效率為10L 8%。
[0045] 4特異性試驗
[0046] 以1型鴨甲肝病毒強毒株（DHAV-1LY0801株）、3型鴨甲肝病毒毒株 (DHAV-3SD1201株）、1型鴨星狀病毒1 (DAstV-Ι)、鴨疫里默桿菌（RA)，鴨源致病性大腸桿菌 (Escherichia coli，046)、鴨瘟病毒（DPV)、新城疫病毒（NDV)、禽流感病毒H9N2(H9N2AIV)、 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥病毒（REV)、正常鴨胚胚體和正常鴨胚尿囊液樣本進(jìn)行檢測，并分別以 本實驗室分離鑒定的10株DHAV-1陽性和10株DHAV-3陽性樣本（分離方法參照已公開 文獻(xiàn)《鴨甲肝病毒3型山東分離株的分離鑒定及VP1基因的序列分析》）為陽性對照，正 常鴨胚尿囊液樣本為陰性對照，按常規(guī)方法提取病毒基因組RNA模板（DHAV-1、DHAV-3、 DAstV-l、NDV、H9N2AIV、REV)并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為：模板RNA4y 1，SEQ2/SEQ4引 物各 〇· 5μ l，5XM-MLVBuffer2y l，dNTPs(10. 0πιΜ)2μ l，Rnase Inhibition?！?25μ l，RTase M-MLV(5U/y 1)0. 5μ l，ddH20(Rnase free)0. 75μ 1。反轉(zhuǎn)錄條件：42°C 60min，72°C 15min， 4°C保存；用步驟3)所述的體系及條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)，同時用健康鴨肝提 取的RNA做陰性對照進(jìn)行特異性試驗。用常規(guī)方法提取RA、大腸桿菌046、DPV的基因組DNA 直接用步驟3)所述體系及條件進(jìn)行雙重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)，用健康鴨肝提取的RNA反轉(zhuǎn)錄 后所得的cDNA做陰性對照。結(jié)果顯示，建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法只能針對DHAV-1 和DHAV-3進(jìn)行特異性擴增，對其他家禽常發(fā)病的病原擴增為陰性，說明本發(fā)明可作為特異 性鑒定DHAV-1和DHAV-3的方法。
[0047] 5敏感性試驗
[0048] 以含有DHAV-1和DHAV-3目的基因片段的線性化質(zhì)粒作為檢測標(biāo)準(zhǔn)品對單重和雙 重?zé)晒舛縍T-PCR檢測靈敏度進(jìn)行測定。用紫外分光光度計對DHAV-1和DHAV-3標(biāo)準(zhǔn)品 進(jìn)行0D值的測定，計算出純度和含量，將模板10倍梯度稀釋，取每個稀釋度的模板分別進(jìn) 行單重和雙重?zé)晒舛縍T-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，該雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法最低可分別 檢測到7拷貝/ μ 1和11拷貝/ μ 1的模板DNA，與單重?zé)晒舛縍T-PCR方法的檢測靈敏度 一致。
[0049] 6重復(fù)性試驗
[0050] 為評價建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法的可重復(fù)性，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品陽性 模板用RNase-Free Water進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋（107?102拷貝/ μ 1)，取不同梯度樣本 的RNA在同一次擴增中進(jìn)行3次重復(fù)測定，計算出DHAV-1和DHAV-3的組內(nèi)變異系數(shù)分別 為0· 28%?1. 24%和0· 28%?1. 81 %，組間變異系數(shù)分別為0· 29%?2. 23%和0· 22%? 1.43% (見圖 3)。
[0051] 7臨床樣本檢測
[0052] 用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR方法對10份人工感染樣本的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣 品的檢測結(jié)果與普通RT-PCR的檢測結(jié)果陽性率均為100%，用建立的雙重?zé)晒舛縍T-PCR 方法對山東、河南、四川、廣東四個省12個鴨場送檢的50只病死雛鴨的肝組織中分離到 DHAV-UDHAV-3進(jìn)行檢測，本發(fā)明的熒光定量RT-PCR檢出DHAV-1和DHAV-3陽性樣本分別 為46份和34份，而普通RT-PCR的分別檢出38和25份，說明本發(fā)明建立的雙重?zé)晒舛?RT-PCR方法更適合于DHAV-1和DHAV-3的臨床檢測和血清型鑒定，且該方法的靈敏度要高 于普通RT-PCR。
[0053] 本發(fā)明的優(yōu)點
[0054] 本發(fā)明針對我國1型鴨甲肝病毒和3型鴨甲肝病毒混合感染日益嚴(yán)重的現(xiàn)狀，根 據(jù)熒光定量RT-PCR技術(shù)原理和鴨病毒性肝炎病毒基因型與血清型相對應(yīng)的特點，針對1型 和3型鴨甲肝病毒設(shè)計了特異性引物和Taqman探針，建立了快速鑒別1型和3型鴨甲肝病 毒的雙重?zé)晒舛縍T-PCR檢測方法，該方法精確、快速、特異性好、靈敏度高，可以用于臨 床樣品中鴨甲肝病毒的快速血清型鑒定及實時定量分析。
[0001] <110〉山東農(nóng)業(yè)大學(xué) <120>-種快速鑒別1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛糠椒?<160>6 <210>1 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>1 agacacatgt tgctgaaaaa ct 22 <210>2 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>2 agaaccagt t gtcgtttggt c 21 <210>3 <211>21 <212>DNA <213〉人工序列 <220〉 <400>3 cttgaacgta atagagcttg g 21 <210>4 <211>24 <212>DNA <213>人工序列 <220〉 <400>4 aaagtctttt ggtagagtct tagc 24
[0002] <210>5 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>5 agacacatgt tgctgaaaac t 21 <210>6 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>6 cctcttcaag aatt tgggca ct 22 <210>7 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>7 acttgtagat gagatc 16 <210>8 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220> <400>8 caiactlgcc accaacLgcc a 21 <210>9 <211>30
[0003] <212>DNA <213>人工序列（Probel ) <220> <400>9 atgccatgac actatctcat atgagtcagc 30 <210>10 <211>29 <212>DNA <213〉人工序列（Probe2) <220> <400>10 acacttggca ccattgtgtc cctcataac 29
【權(quán)利要求】
1. 一種檢測1型和3型鴨甲肝病毒的雙重?zé)晒舛縍T-PCR特異性引物，其特征在于 是對GenBank上已發(fā)表的DHAV-1、DHAV-3的序列進(jìn)行比對，在兩種病毒基因序列的保守但 相互之間差異又較大的區(qū)域，分別設(shè)計一對針對DHAV-1的特異性檢測引物SEQ1和SEQ2, 一 條Taqman探針Probel ; -對針對DHAV-3的特異性檢測引物SEQ3和SEQ4, 一條Taqman探 針Probe2,引物序列如下： SEQ1 :5' -AGACACATGTTGCTGAAAAACT-3'， SEQ2 :5' -AGAACCAGTTGTCGTTTGGTC-3'， SEQ3 :5' -CTTGAACGTAATAGAGCTTGG-3'， SEQ4 :5' -AAAGTCTTTTGGTAGAGTCTTAGC-3'， Probel:5' CY5-ATGCCATGACACTATCTCATATGAGTCAGC-3' BHQ2， Probe2 :5, FAM-ACACTTGGCACCATTGTGTCCCTCATAAC-3, TAMRA， 所有引物以無菌ddH20配成lOpmol/μ 1的濃度備用； 上述引物、探針的使用方法為： A、 常規(guī)方法提取待測鴨肝組織總RNA作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；反應(yīng)體系為：模板 RNA4y 1，SEQ2/SEQ4 引物各 0· 5μ 1，5XM-MLV Buffer2y 1，濃度為 10. OmM 的 dNTPs2y 1， Rnase InhibitionO. 25μ 1，濃度為 5υ/μ 1 的 RTaseM-MLVO. 5μ l，ddH200. 75μ 1 ;反應(yīng)程序 為：42°C反應(yīng) 50min，70°C 15min，獲得病毒 cDNA ; B、 以病毒cDNA為模板進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系為：3. 45yL ddH20， 12. 5 μ L Premix Ex Taq，SEQ1、SEQ2、SEQ3 和 SEQ4 各 1 μ 1，ROX Reference Dye 110. 25μ l，ProbelO. 5μ 1 和 Probe20. 3μ 1，2μ 1 cDNA模板； PCR反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C 15s，60°C 45s，40個循環(huán)；于60°C時收集熒光； C、 用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出測得Ct值所對應(yīng)的樣品濃度：反應(yīng)最終輸出的Ct值可用標(biāo)準(zhǔn)曲 線換算出對應(yīng)的樣品濃度，縱坐標(biāo)為所得Ct值，橫坐標(biāo)為樣品濃度的對數(shù)值。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046704SQ201410317515
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月4日
【發(fā)明者】姜世金, 林少莉, 張瑞華 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)