專利名稱：編碼杜仲的甲羥戊酸途徑的酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及參與杜仲的類異戊二烯化合物的生物合成的基因群。
技術(shù)背景
作為類異戊二烯化合物之一的聚異戊二烯(橡膠)根據(jù)異戊二烯單元的聚合方式的不同而分為順式和反式。生產(chǎn)長(zhǎng)鏈順式聚異戊二烯的植物已知有蒲公英、山萵苣等很多植物。巴西橡膠樹(shù)(Hevea brasiliensis)所生產(chǎn)的順式聚異戊二烯作為天然橡膠在商業(yè)上廣泛應(yīng)用。而關(guān)于長(zhǎng)鏈反式聚異戊二烯，已知天然中有膠木等少數(shù)植物生產(chǎn)，但商業(yè)上并未利用。目前，反式聚異戊二烯是化學(xué)合成，應(yīng)用于高爾夫球外皮、繃帶、運(yùn)動(dòng)保護(hù)器具等中。 反式聚異戊二烯是顯示低熔點(diǎn)和高彈性的熱塑性彈性體，可用作絕緣體。
類異戊二烯化合物通過(guò)與碳原子數(shù)為5的化合物-異戊烯焦磷酸(IPP)為單元的縮合反應(yīng)生成。甲羥戊酸途徑是類異戊二烯化合物的生物合成中的初期合成途徑之一。在動(dòng)物、植物、菌類中可通過(guò)甲羥戊酸途徑生物合成IPP。
作為IPP生物合成途徑，除了甲羥戊酸途徑之外還存在非甲羥戊酸途徑。在植物中，在細(xì)胞質(zhì)中是甲羥戊酸途徑發(fā)揮作用，在色素體中是非甲羥戊酸途徑發(fā)揮作用。
通過(guò)甲羥戊酸途徑發(fā)揮作用的酶的基因在各種植物中都是公知的。例如 Kutki (胡黃連)(Picrorhiza kurrooa)中(根較多含有環(huán)烯醚萜苷)登錄了乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶(堿基序列在GenBank的登錄號(hào)為DQ347964，氨基酸序列的登錄號(hào)為 ABC74567)，巴西橡膠樹(shù)(合成順式聚異戊二烯)中登錄了 HMG-CoA合成酶(堿基序列的登錄號(hào)為AF^9389，氨基酸序列登錄號(hào)為AAS46M5) ,HMT-CoA還原酶(堿基序列登錄號(hào)為 )(54659，氨基酸序列的登錄號(hào)為P^057)、甲羥戊酸激酶(堿基序列登錄號(hào)為AF429384，氨基酸序列登錄號(hào)為AAL18925)、磷酸甲羥戊酸激酶(堿基序列登錄號(hào)為AF429385，氨基酸序列登錄號(hào)為AAL18i^6)、以及甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(堿基序列登錄號(hào)AF429386，氨基酸序列的登錄號(hào)為AAL18927)。
中國(guó)原產(chǎn)的木本植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)生產(chǎn)纖維狀的長(zhǎng)鏈反式聚異戊二烯。杜仲的葉、樹(shù)皮和種皮中含有大量反式聚異戊二烯(非專利文獻(xiàn)1)。
杜仲的樹(shù)皮作為滋養(yǎng)強(qiáng)壯和高血壓的民間治療藥物，自古以來(lái)一直被使用。杜仲中含有類異戊二烯化合物的一種-環(huán)烯醚萜的苷(京尼平苷酸)(非專利文獻(xiàn)2和幻，其具有降血壓作用。
如上所述，杜仲含有如反式聚異戊二烯和環(huán)烯醚萜苷等有用的類異戊二烯化合物。
為了制備橡膠高含量的植物，人們希望獲得參與杜仲中IPP生物合成途徑的基因。以往，在從目標(biāo)生物種中獲得具有某種功能的同源基因時(shí)，是利用使用公知基因的DNA片段的雜交篩選、或者是利用公知基因的堿基序列的縮聚PCR與接下來(lái)的5’ -RACE、 3’ -RACE和RP-PCR組合的方法。但是，這些方法的準(zhǔn)確性低，很麻煩。特別是目標(biāo)基因的保守區(qū)域不明確時(shí)，則難于采用這些方法。
對(duì)杜仲的基因序列進(jìn)行了分析(非專利文獻(xiàn)4和幻。非專利文獻(xiàn)4中報(bào)道了參與甲羥戊酸途徑的酶之一-HMG-CoA還原酶的基因及其序列。但是參與甲羥戊酸途徑的除此之外的酶則未見(jiàn)報(bào)道。
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非專利文獻(xiàn)4 :Hou H-W，Zhou Y-T, Mwang K-N, Li ff-F, He X_Q，禾口 Cui K-M, ABPl expression regulated by IAA and ABA is associated with the cambium periodicity in Eucommia ulmoides Oliv. J Exp Bot 57 :3857-3867(2006)發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供參與杜仲的類異戊二烯化合物的生物合成的基因群。
本發(fā)明提供參與由杜仲的甲羥戊酸合成異戊烯焦磷酸的基因。上述基因編碼選自含有SEQ ID N0. 2的氨基酸序列1位-408位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 4的氨基酸序列1位-408位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQID N0. 6的氨基酸序列1位-463位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 8的氨基酸序列1位-466位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 12 的氨基酸序列1位-6 位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 14的氨基酸序列1位-591位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 16的氨基酸序列1位-387位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 18的氨基酸序列1位-506位氨基酸的蛋白質(zhì)、含有SEQ ID N0. 20的氨基酸序列1 位-418位氨基酸的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述基因選自含有SEQ ID NO. 1的堿基序列101位-1327位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 3的堿基序列1 位-13M位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 5的堿基序列172位-1563位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 7的堿基序列216位-1616 位核苷酸的基因、含有SEQ IDN0. 11的堿基序列32位-1921位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 13的堿基序列60位-1835位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 15的堿基序列61位-1224 位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 17的堿基序列682位-2202位核苷酸的基因、含有SEQ4ID NO. 19的堿基序列68位-13 位核苷酸的基因。
在另外的實(shí)施方案中，上述基因選自含有SEQ ID NO. 1的堿基序列1位-1516位核苷酸的基因、含有SEQ ID NO. 3的堿基序列1位-1757位核苷酸的基因、含有SEQ ID NO. 5 的堿基序列1位-1892位核苷酸的基因、含有SEQ ID NO. 7的堿基序列1位-1833位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 9的堿基序列1位-1825位核苷酸的基因、含有SEQ ID NO. 11 的堿基序列1位-2057位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 13的堿基序列1位-2225位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 15的堿基序列1位-1341位核苷酸的基因、含有SEQ ID N0. 17 的堿基序列1位4432位核苷酸的基因、含有SEQ IDN0. 19的堿基序列1位-1542位核苷酸的基因。
本發(fā)明提供參與由杜仲的甲羥戊酸合成異戊烯焦磷酸的基因。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明提供參與由杜仲的甲羥戊酸合成異戊烯焦磷酸(IPP)的基因。IPP的合成通過(guò)類異戊二烯化合物的生物合成的初期合成途徑-甲羥戊酸途徑進(jìn)行。以下的酶參與甲羥戊酸途徑⑴乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶；⑵3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA(HMG-CoA)合成酶；C3) HMG-CoA還原酶；(4)甲羥戊酸激酶；( 磷酸甲羥戊酸激酶；以及(6)甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(也稱為“焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶”)。甲羥戊酸途徑中，通過(guò)(1)乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶，由乙酰-CoA合成乙酰乙酰-CoA，通過(guò)(2)HMG-CoA合成酶，由乙酰乙酰-CoA 合成HMG-CoA，通過(guò)(3) HMG-CoA還原酶，將HMG-CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸，通過(guò)甲羥戊酸激酶和( 磷酸甲羥戊酸激酶，將甲羥戊酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢u戊酸5-焦磷酸，然后通過(guò)(6)甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶生成異戊烯焦磷酸(IPP)。
本發(fā)明的基因編碼選自含有SEQ ID NO. 2的氨基酸序列1位_408位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID NO. 2的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ IDN0. 4的氨基酸序列1位-408位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ IDN0. 4的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 6的氨基酸序列 1位-463位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID NO. 6的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 8 的氨基酸序列1位-466位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID N0.8的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 12的氨基酸序列1位-6 位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID NO. 12 的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 14的氨基酸序列1位-591位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為 "SEQ ID NO. 14的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 16的氨基酸序列1位-387位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID NO. 16的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ ID NO. 18的氨基酸序列1位-506 位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ ID N0. 18的蛋白質(zhì)”)；含有SEQ IDN0. 20的氨基酸序列1位-418位氨基酸的蛋白質(zhì)(以下也稱為“SEQ IDN0.20的蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)。含有SEQ ID NO. 10的1位-466位的氨基酸的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0. 8的蛋白質(zhì)相同。
SEQ ID N0. 2的蛋白質(zhì)和SEQ ID N0. 4的蛋白質(zhì)是(1)乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶。 SEQ ID N0. 2的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID NO. 1的堿基序列101位-1327位的核苷酸的基因編碼所得。該基因例如可含有SEQ ID NO. 1的全部堿基序列(1位-1516位)。SEQ ID N0. 4 的蛋白質(zhì)可由含有SEQ IDN0. 3的堿基序列1 位-13M位的核苷酸的基因編碼獲得。該基因例如可含有SEQ ID N0. 3的全部堿基序列(1位-1757位)。
SEQ ID N0. 6 的蛋白質(zhì)和 SEQ ID N0. 8 的蛋白質(zhì)是(2) HMG-CoA 合成酶。SEQ IDNO. 6的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID NO. 5的堿基序列172位-1563位的核苷酸的基因編碼所得。 該基因例如可含有SEQ ID NO. 5的全部堿基序列(1位-1892位)。SEQ ID NO. 8的蛋白質(zhì)可由含有SEQ ID NO. 7的堿基序列216位-1616位(或SEQ ID NO. 9的堿基序列216 位-1616位)的核苷酸的基因編碼獲得。該基因中包含例如含有SEQ ID NO. 7的堿基序列 1位-1833位的核苷酸的基因、以及含有SEQ ID NO. 9的堿基序列1位-1825位的核苷酸的基因。具有SEQ ID NO. 9所示堿基序列的基因在其1689位-1825位的區(qū)內(nèi)，相對(duì)于具有 SEQ ID NO. 7所示的堿基序列的基因的1689位-1833位的區(qū)，具有6處(SEQ ID NO. 7的堿基序列1689位、1709位、1713位、1745位、1756位和1820位)的置換和1處(SEQ ID N0. 7 的堿基序列1777位)的缺失以及3’末端的聚腺苷部位的縮短。
SEQ ID N0. 12 的蛋白質(zhì)和 SEQ ID N0. 14 的蛋白質(zhì)是(3) HMG-CoA 還原酶。SEQ ID N0. 12的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID NO. 11的堿基序列32位-1921位的核苷酸的基因編碼所得。 該基因例如可含有SEQ ID NO. 11的全部堿基序列(1位-2057位)。SEQ ID N0. 14的蛋白質(zhì)可由含有SEQ IDN0. 13的堿基序列60位-1835位的核苷酸的基因編碼獲得。該基因例如可含有SEQ ID N0. 13的全部堿基序列(1位-2225位)。
SEQ ID N0. 16的蛋白質(zhì)是(4)甲羥戊酸激酶。SEQ ID N0. 16的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID N0. 15的堿基序列61位-12M位的核苷酸的基因編碼所得。該基因例如可含有SEQ ID N0. 15的全部堿基序列(1位-1341位)。
SEQ ID N0. 18的蛋白質(zhì)是(5)磷酸甲羥戊酸激酶。SEQ ID N0. 18的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID N0. 17的堿基序列682位-2202位的核苷酸的基因編碼所得。該基因例如可含有SEQ ID N0. 17的全部堿基序列(1位4432位)。
SEQ ID N0. 20的蛋白質(zhì)是(6)甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。SEQ IDN0. 20的蛋白質(zhì)由含有SEQ ID N0. 19的堿基序列68位-13 位的核苷酸的基因編碼所得。該基因例如可含有SEQ ID N0. 19的全部堿基序列(1位-1542位)。
本發(fā)明的基因只要可以表達(dá)與具有上述氨基酸序列的酶功能性同等的酶、或者是可與具有上述堿基序列的基因發(fā)揮同樣功能即可，可以編碼一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基不同的蛋白質(zhì)，或者可以有一個(gè)或多個(gè)堿基不同。上述序列的不同可以由于堿基的置換、缺失和/ 或插入獲得，或者發(fā)生天然誘變或者是人工誘變(例如定點(diǎn)突變導(dǎo)入法的應(yīng)用)的任意方式?；虻墓δ艿拇_定例如可采用如以下實(shí)施例2所記載的基本方法的、本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的方法進(jìn)行。
本發(fā)明的基因是本領(lǐng)域技術(shù)人員采用通常所使用的方法，按照本說(shuō)明書(shū)記載的序列信息制備探針或引物，以杜仲的染色體DNA或cDNA為模板，通過(guò)PCR獲得目標(biāo)片段。當(dāng)然也可以以RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄PCR。本發(fā)明的基因除DNA、RNA等天然多核苷酸之外， 也可以是含有人工的核苷酸衍生物的人工分子。本發(fā)明的基因還可以是DNA-RNA的嵌合分子。
本發(fā)明的基因可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所采用的方法，導(dǎo)入到酵母等微生物或植物中。本發(fā)明的基因可在宿主中轉(zhuǎn)化，以表達(dá)1個(gè)或多個(gè)、或者是全部。例如其構(gòu)成可以是表達(dá)存在于甲羥戊酸途徑中的一組酶(上述(1)至(6))中的至少一個(gè)。
本發(fā)明的基因適合用于制備大量含有反式聚異戊二烯或環(huán)烯醚萜的基因重組植物(例如杜仲)。本發(fā)明的基因例如通過(guò)轉(zhuǎn)化杜仲，可用于制備較多含有橡膠的植物。
實(shí)施例
以下給出實(shí)施例，進(jìn)一步具體說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。
(實(shí)施例1杜仲中的EST分析)
(材料)
作為杜仲植物體試樣，使用在5月下旬、從愛(ài)媛縣生名村生長(zhǎng)的杜仲標(biāo)準(zhǔn)樹(shù)采集的當(dāng)年幼枝的韌皮部(樹(shù)皮)和木質(zhì)部。
酵母的突變株文庫(kù)使用市售的YKO Heterozygous Essential Strain Collection-Glycerol Stocks (Open Biosystems 公司)。
(由杜仲中提取RNA)
將約4g杜仲植物體試樣(當(dāng)年枝的韌皮部和木質(zhì)部)邊用液氮冷卻，邊用乳缽、 研磨棒破碎，懸浮于試樣的10倍量(w/v)的2XCTAB溶液(w/v)十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、1% (w/v) 2-巰基乙醇、0. IM Tris-HCl(pH 9. 5)、1.4M NaCl、20mM EDTA。將其在65°C下溫育10分鐘，接著用氯仿/異戊醇處理(洗滌)(反復(fù)兩次)。向回收的水層中加入1/4(ν/ν)量的IOM LiCl并混合，在_20°C下溫育2小時(shí)，進(jìn)行RNA的選擇性沉淀。將其離心，將沉淀溶解于適量的Tris-EDTA(TE)緩沖液中，離心分離，回收上清，排除多糖類。 將回收的上清進(jìn)行苯酚處理、苯酚/氯仿處理和氯仿/異戊醇處理，再次通過(guò)LiCl進(jìn)行RNA 的選擇性沉淀。將沉淀用70%乙醇洗滌，減壓干燥，接著溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水中。通過(guò)吸光度測(cè)定對(duì)所得RNA進(jìn)行定量，通過(guò)電泳確認(rèn)。由約4g木質(zhì)部中獲得0. S^ig RNA,由約4g韌皮部中獲得2mgRNAQ60nm和^Onm下的吸收比分別為1. 956和1. 990)。
(杜仲cDNA文庫(kù)的制備)
通過(guò)日立計(jì)測(cè)器服務(wù)株式會(huì)社的G- * 7 O 7方法，由來(lái)自杜仲韌皮部和木質(zhì)部的RNA試樣制備cDNA文庫(kù)。來(lái)自韌皮部的cDNA文庫(kù)的文庫(kù)大小為3. 8 X 105，插入率為 88% ( 個(gè)樣品/瓊脂糖凝膠電泳)，全長(zhǎng)率86% (對(duì)于插入的克隆)。來(lái)自木質(zhì)部的cDNA 的文庫(kù)大小為2. 2 X 105，插入率為79% ( 個(gè)樣品/瓊脂糖凝膠電泳)，全長(zhǎng)率63% (相對(duì)于有插入的克隆)。
(EST序列的序列分析)
在北里大學(xué)北里生命科學(xué)研究所基因組情報(bào)學(xué)研究室中，對(duì)于來(lái)自杜仲韌皮部和木質(zhì)部的cDNA文庫(kù)的各約20000個(gè)克隆進(jìn)行序列分析。根據(jù)由序列分析得到的序列信息， 除去未保有插入的克隆和無(wú)法閱讀序列的克隆，獲得精度高的序列信息。對(duì)于韌皮部和木質(zhì)部的文庫(kù)，分別得到了 16567和16113長(zhǎng)度的精度高的EST序列(合計(jì)32680)。
對(duì)于所得序列進(jìn)行分組(聚類)(clustering)和注解(annotation)?！胺纸M”是在EST序列中，將同一序列、類似序列分成一組。為了進(jìn)行分組，使用NTT軟件的VISUALBI0 clustering?！白⒔狻笔峭ㄟ^(guò)與已知基因比較，對(duì)EST序列進(jìn)行注解。注解時(shí)使用采用NCBI BLAST的同源性檢索。檢索時(shí)所使用的數(shù)據(jù)庫(kù)是nr(All non-redundant GenBank CDS trgmsliitions+PDB+SwissProt+PIR(月太·歹))。
根據(jù)分組和注解所得的信息，發(fā)現(xiàn)了推定為編碼乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶、 HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的EST序列。這些酶均是參與杜仲的類異戊二烯化合物的生物合成中初期合成途徑的酶。
(實(shí)施例2編碼乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因1)
(全長(zhǎng)cDNA的獲得)
通過(guò)3，-RACE (cDNA末端的快速擴(kuò)增，RACE)，由通過(guò)實(shí)施例1的分析得到的序列確定3’末端一側(cè)的序列，獲得全長(zhǎng)cDNA。
3，-RACE使用3，-Full RACE Core Set (夕力，“λ才株式會(huì)社制備)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用oligo-dT弓丨物。PCR擴(kuò)增使用與oligo-dT的引物和與已知序列的一部分為相同的序列的有義引物。有義引物根據(jù)推定為實(shí)施例1所得的編碼乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的 EST序列信息設(shè)計(jì)。以實(shí)施例1所得的RNA為模板，第1次是使用N192-82-tree_1968_3R_ Sl (SEQ IDN0. 21)作為有義引物,第 2 次是使用 m92-82_tree_1968_3R_s2 (SEQ IDN0. 22) 作為有義引物，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR。將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和由PCR得到的擴(kuò)增片段TA克隆到 pT7Blue載體中，進(jìn)行序列分析。
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID NO. 1的堿基序列。SEQ ID NO. 1所述的堿基序列146 位-1299位的核苷酸所示的區(qū)域的堿基序列與Kutki的乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶(GenBank 登錄號(hào)DQ347964)具有82%的同源性。開(kāi)放閱讀框是101位-1327位。由該cDNA編碼的推定的氨基酸序列如SEQID N0. 2所示。SEQ ID N0. 2的全長(zhǎng)氨基酸序列(1位-408位)與 Kutki的乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶(登錄號(hào)ABC74567)具有89%的同源性。
(使用酵母突變株文庫(kù)的互補(bǔ)性試驗(yàn))
使用用酵母突變株文庫(kù)進(jìn)行的互補(bǔ)性試驗(yàn)確認(rèn)所得cDNA的功能。該互補(bǔ)性試驗(yàn)如下進(jìn)行。
使用附加有與pYES2載體(invitrogen制備)的多克隆位點(diǎn)的40 bp為相同序列的有義引物和反義引物，進(jìn)行PCR(95°C下將5分鐘作為1個(gè)循環(huán)；然后95°C下將1分鐘、下將1分鐘和72°C下將1分鐘作為30個(gè)循環(huán)；在72°C下將7分鐘作為1個(gè)循環(huán)；以及 4°C下將⑴作為1個(gè)循環(huán))，擴(kuò)增目標(biāo)基因的翻譯區(qū)序列。
將該擴(kuò)增片段和用限制酶處理成直鏈狀的PYES2載體導(dǎo)入到Ursi的酵母株 Y2^00 (EUR0SCARF制備)中。作為分析對(duì)象的乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因?qū)τ诮湍傅纳L(zhǎng)來(lái)說(shuō)是必須的，因此，作為互補(bǔ)試驗(yàn)的背景，該酵母使用只有一側(cè)的對(duì)位基因缺失目標(biāo)基因的雜合二倍體?；?qū)霑r(shí)使用 Frozen-EZ Yeast Transformation II (ΖΥΜ0 RESEARCH 制備)。將轉(zhuǎn)化后的酵母接種于極限完全培養(yǎng)基(無(wú)尿嘧啶)，在30°C下培養(yǎng)。將生長(zhǎng)的集落接種于新的極限完全培養(yǎng)基(無(wú)尿嘧啶)中，接著在30°C下培養(yǎng)。酵母突變株是尿嘧啶需求性，PYES2載體中含有URA3基因(編碼乳清苷5’ -磷酸脫羧酶)的序列，因此只有轉(zhuǎn)化的菌體可以生長(zhǎng)。生長(zhǎng)的茵體通過(guò)PCR檢查其是否含有插入片段，接著，將該菌體轉(zhuǎn)移至YPDA培養(yǎng)基中，在30°C下培養(yǎng)。將其轉(zhuǎn)移至孢子形成培養(yǎng)基，在25°C下培養(yǎng)，將所得孢子進(jìn)行四分體分析。
插入到pYES2載體的多克隆位點(diǎn)上的目標(biāo)基因上的上游存在GALl啟動(dòng)子，因此， 目標(biāo)基因只在半乳糖存在下誘導(dǎo)表達(dá)。因此，判定是否在YPD培養(yǎng)基或YPG培養(yǎng)基(碳源 半乳糖)上進(jìn)行生長(zhǎng)。在YPD培養(yǎng)基中，來(lái)自突變株的二分體致死，只有來(lái)自野生型的二分體生長(zhǎng)。而在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上，具有GALl啟動(dòng)子的pYES2載體誘導(dǎo)插入基因的表達(dá)，因此，如果功能互補(bǔ)，則來(lái)自突變株的可以存活，三分體或四分體生長(zhǎng)。這樣，通過(guò)進(jìn)行互補(bǔ)的確認(rèn)，可以進(jìn)行目標(biāo)基因的功能確定。
并且，將由四分體分析得到的來(lái)自八孢子囊的集落(可認(rèn)為是單倍體)影印到(A)8YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)、(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖、不含有尿嘧啶)、(C)YPG 培養(yǎng)基(碳源半乳糖，含有抗生素G418)、或(D)YPG培養(yǎng)基(碳源葡萄糖)上。
保有質(zhì)粒的培養(yǎng)株在⑶的極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)中生長(zhǎng)。突變株具有G418抗性基因，因此可認(rèn)為在(C)YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖，含有抗生素 G418)中生長(zhǎng)。由這些培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)結(jié)果可以判別出保有質(zhì)粒的單倍體突變株。在(D) 的YPD培養(yǎng)基(碳源葡萄糖)中，保有質(zhì)粒的突變株(單倍體)應(yīng)無(wú)法生長(zhǎng)，但實(shí)際上難以判定其生長(zhǎng)的有無(wú)。因此通過(guò)篩選判別生長(zhǎng)的有無(wú)。
本實(shí)施例中，使用N219-36-tree_1968_S(SEQ ID NO. 23)作為有義引物，使用 N219-36-tree_1968_a(SEQ ID NO. 24)作為反義引物，以上述“完全cDNA的獲得”中得到的 cDNA作為模板，進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。將該擴(kuò)增片段供給上述互補(bǔ)性試驗(yàn)。在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且通過(guò)使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)，確定了乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的功能。
(實(shí)施例3編碼乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因2)
使用根據(jù)實(shí)施例1得到的推定為編碼乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶的EST序列的信息設(shè)計(jì)的 N192-84-tree_11012_3R_sl(SEQ ID NO. 25)(第 1 次)和 N192-84_tree_11012_3R_ s2(SEQ ID NO. 26)(第2次)作為3’-RACE用的有義引物，除此之外與實(shí)施例2同樣，得到全長(zhǎng)cDNA。
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID NO. 3的堿基序列。SEQ ID N0. 3的堿基序列173 位-1305位的核苷酸所示的區(qū)域的堿基序列與Kutki的乙酰-CoAC-乙酰轉(zhuǎn)移酶(登錄號(hào) DQ347964)具有83%的同源性。開(kāi)放閱讀框?yàn)? 位-13M位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID N0. 4所示。SEQID N0. 4的全長(zhǎng)氨基酸序列(1位-408位)與Kutki的乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶(登錄號(hào)ABC74567)具有87%的同源性。
本實(shí)施例中，使用N219-36_tree_11012_s(SEQ ID NO. 27)作為有義引物，使用 N-219-36-tree_11012_a(SEQ ID NO. 28)作為反義引物，以上述所得cDNA為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。將該擴(kuò)增片段與實(shí)施例2同樣供給互補(bǔ)性試驗(yàn)，得到了與實(shí)施例2同樣的結(jié)果。在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，通過(guò)使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)確定了乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的功能。
(實(shí)施例4編碼HMG-CoA合成酶的基因1)。
使用基于實(shí)施例1所得的推定為編碼HMG-CoA合成酶的EST序列的信息設(shè)計(jì)的 N192-71-tree_6098_3R_sl (SEQ ID Ν0· 29)(第 1 次)和N192-71_tree_6098_3R_s2 (SEQ ID NO. 30)(第2次)作為3，-RACE的有義引物，除此之外與實(shí)施例2同樣，得到全長(zhǎng)cDNA。
所得的全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID N0. 5的堿基序列。SEQ ID N0. 5的堿基序列172 位-1187位的核苷酸所示的區(qū)域和1390位-1439位的核苷酸所示的區(qū)域的堿基序列，分別與巴西橡膠樹(shù)的HMG-CoA合成酶(登錄號(hào)AF429389)具有83%和86%的同源性。開(kāi)放閱讀框是172位-1563位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示。SEQ ID N0. 6的全長(zhǎng)氨基酸序列(1位-463位)與巴西橡膠樹(shù)的HMG-CoA合成酶(登錄號(hào)AAS46245)具有85%的同源性。
本實(shí)施例中，有義引物使用N219-36_tree_6098_s(SEQ ID NO. 31)，反義引物使用 N219-36-tree_6098_a (SEQ ID NO. 32)，以上述所得cDNA為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。與實(shí)施例2同樣，將該擴(kuò)增片段供給互補(bǔ)性試驗(yàn)。突變株使用Ura的HMG-CoA合成酶缺損株Y26527 (EUR0SCARF制備)。在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，在使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察中，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)確定了 HMG-CoA合成酶基因的功能。
(實(shí)施例5編碼HMG-CoA合成酶的基因2)
使用實(shí)施例1所得的推定編碼HMG-CoA合成酶的EST序列的信息設(shè)計(jì)的 N192-36-tree_10370_3R_sl (SEQ ID NO. 33)(第 1 次)和 N192-36_tree_10370_3R_s2 (SEQ ID NO. 34)(第2次)，作為3，-RACE用的有義引物，除此之外與實(shí)施例2同樣得到全長(zhǎng)cDNA。 得到了兩個(gè)全長(zhǎng)cDNA。
所得的第一全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID NO. 7的堿基序列。SEQ ID N0. 7的堿基序列 234位-1496位的核苷酸所示區(qū)域的堿基序列與巴西橡膠樹(shù)的HMG-CoA合成酶(登錄號(hào) AF429389)具有81%的同源性。所得第二全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID N0. 9的堿基序列。該第二 cDNA在其1689位-1825位的區(qū)域內(nèi)，對(duì)應(yīng)第一 cDNA的1689位-1833位的區(qū)域有6處(第一 cDNA 的 1689 位、1709 位、1713 位、1745 位、1756 位和 1820 位)置換和 1 處(第一 cDNA 的1777位)缺失、以及3’末端的聚腺苷部位的縮短。SEQ ID N0. 9的堿基序列也與SEQ ID N0. 7的堿基序列同樣，與巴西橡膠樹(shù)的HMG-CoA合成酶(登錄號(hào)AF^9389)具有81% 的同源性。開(kāi)放閱讀框在兩個(gè)堿基序列均為216位-1616位。由這些cDNA編碼的推定氨基酸序列分別如SEQ ID N0.8和10所示，它們是相同的序列。該推定氨基酸序列在SEQ ID N0. 8的6位-452位的氨基酸區(qū)域中，與巴西橡膠樹(shù)的HMG-CoA合成酶(登錄號(hào)AAS46245) 具有84%的同源性。
本實(shí)施例中，使用N219-36_tree_10370_s(SEQ ID NO. 35)作為有義引物，使用 N219-36-tree_10370_a(SEQ ID NO. 36)作為反義引物，以上述所得cDNA作為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。與實(shí)施例2同樣，將該擴(kuò)增片段供給互補(bǔ)性試驗(yàn)。突變株使用tea—的HMG-CoA合成酶缺損株Y26527(EUR0SCARF制備)。在四分體分析中觀察到Y(jié)PG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，在使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察中，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。 結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)，確定了 HMG-CoA合成酶基因的功能。
(實(shí)施例6編碼HMG-CoA還原酶的基因1)
關(guān)于編碼HMG-CoA還原酶的基因，為了獲得全長(zhǎng)cDNA，采用5，RACE、3，RACE和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)組合的方法。該方法中，使用5，-FullRACE Core Set (TaKaRa制備)和3，-Full RACE Core Set (TaKaRa制備)。根據(jù)實(shí)施例1所得的推定為編碼HMG-CoA還原酶的EST序列設(shè)計(jì) m92-45-tree_8220_5R_al(SEQ ID Ν0· 37)(第一次)和 m92-45_tree_8220_5R_ a2 (SEQ ID NO. 38)(第二次)作為 5，RACE 用的反義引物，N192-45-tree_8220_5R_3R_ si (SEQ ID NO. 39)(第一次)和 m92-45_tree_8220_5R_3R_s2 (SEQ ID NO. 40)(第二次) 作為3，-RACE用的有義引物，N192-45-tree_8220_5R_p (SEQ ID NO. 41)作為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用。以實(shí)施例1所得的RNA為模板，與實(shí)施例2同樣地，將它們反應(yīng)所得的擴(kuò)增片段TA克隆到pTCBlue載體上，進(jìn)行序列分析。
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID NO. 11的堿基序列。SEQ ID NO. 11的堿基序列260 位-303位的核苷酸所示區(qū)域、773位-936位的核苷酸所示區(qū)域、以及1148位-1845位的核苷酸所示的的區(qū)域的堿基序列分別與蘋(píng)果(Malus χ domestica)的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào)AF315713)具有88%、82%和81 %的同源性。開(kāi)放閱讀框是32位-1921位。由該cDNA 編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。在SEQ ID NO. 12的33位-612位的氨基酸區(qū)域中，該推定氨基酸序列與喜樹(shù)(Camptotheca acuminata)的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào) P48021)具有78%的同源性。SEQ ID N0. 12的33位-612位的氨基酸區(qū)域與非專利文獻(xiàn)4 的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào)AAVM051)具有73%的同源性。因此，可以認(rèn)為序列號(hào)11的堿基序列是來(lái)自與非專利文獻(xiàn)4的基因不同的基因座的HMG-CoA還原酶基因。
(實(shí)施例7編碼HMG-CoA還原酶的基因2)
根據(jù)實(shí)施例1所得的推定為編碼HMG-CoA還原酶的EST序列設(shè)計(jì) N192-47-tree_13453_5R_al (SEQ ID NO. 42)(第一次)和 Nl92_47_tree_l3453_5R_a2 (SEQ ID NO. 43)(第二次)作為 5，RACE 用的反義引物，N192-47-tree_13453_5R_3R_sl (SEQ ID NO. 44)(第一次)和 N192-47-tree_13453_5R_3R_s2 (SEQ ID NO. 45)(第二次)作為 3，-RACE用的有義引物，N192-47-tree_13453_5R_p(SEQ ID NO. 46)作為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用，除此之外與實(shí)施例6同樣，得到全長(zhǎng)cDNA。
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID N0. 13的堿基序列。SEQ ID N0. 13的堿基序列169 位-373位的核苷酸所示區(qū)域、751位-1600位的核苷酸所示區(qū)域、以及1637位-1720位的核苷酸所示的的區(qū)域的堿基序列，分別與喜樹(shù)的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào)U72145)具有 79^^80%和89%的同源性。開(kāi)放閱讀框是60位-1835位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ IDN0. 14所示。在SEQ ID N0. 14的1位-588位的氨基酸區(qū)域中，該推定氨基酸序列與煙草(Nicotiana tabacum)的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào)AAB87727)具有78%的同源性。SEQ ID N0. 14的1位-589位的氨基酸區(qū)域與非專利文獻(xiàn)4的HMG-CoA還原酶(登錄號(hào)AAVM051)具有75%的同源性。因此，可以認(rèn)為序列號(hào)13的堿基序列也是來(lái)自與非專利文獻(xiàn)4的基因不同的基因座的HMG-CoA還原酶基因。
(實(shí)施例8編碼甲羥戊酸激酶的基因)
3’ -RACE用的有義引物使用基于實(shí)施例1所得的推定為編碼甲羥戊酸激酶的EST 序列的信息設(shè)計(jì)的tree 1729引物(SEQ ID Ν0· 47)(第一次)和tree 1729引物套(SEQ ID NO. 48)(第二次)，除此之外與實(shí)施例2同樣，得到全長(zhǎng)cDNA.
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID N0. 15的堿基序列。SEQ ID N0. 15的堿基序列 616位-1104位的核苷酸所示區(qū)域的堿基序列與巴西橡膠樹(shù)的甲羥戊酸激酶(登錄號(hào) AF429384)具有83%的同源性。開(kāi)放閱讀框是61位-12M位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID N0. 16所示。SEQ IDN0. 16全長(zhǎng)氨基酸序列(1位-387位)與巴西橡膠樹(shù)的甲羥戊酸激酶(登錄號(hào)AAL18925)具有77%的同源性。
本實(shí)施例中，使用N219-36_tree_1729_s(SEQ ID NO. 49)作為有義引物，使用 N219-36-tree_1729_a(SEQ ID NO. 50)作為反義引物，以上述所得cDNA作為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。將該擴(kuò)增片段與實(shí)施例2同樣地供給互補(bǔ)性試驗(yàn)。突變株使用tea-的甲羥戊酸激酶缺損株Y20794 (EUR0SCARF制備)。在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，在使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察中，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)，確定了甲羥戊酸激酶基因的功能。
(實(shí)施例9編碼磷酸甲羥戊酸激酶的基因)
以實(shí)施例1所得cDNA文庫(kù)作為模板，使用以下引物進(jìn)行PCR，獲得部分序列。該簡(jiǎn)并PCR中使用的引物如下第一次使用S_No. 243_Ρ· 10_1 (SEQ ID NO. 51)作為有義引物和使用 AS_No. 243_P. 10_1 (SEQ IDNO. 52)作為反義引物；第一次使用 S_No. 243_P. 10_2 (SEQ ID NO. 53)作為有義引物和使用AS_No. 243_P. 10_2(SEQ ID NO. 54)作為反義引物，引物的設(shè)計(jì)基于 BAD93946(擬南芥，Arabidopsis thaliana)、AAL18926(巴西橡膠樹(shù)，Hevea brasiliensis)、CAB52^4(粟酒裂殖酵母，Schizosaccharomyces pombe)、NP593421 (粟酒裂殖酵母，Schizosaccharomyces pombe)、P24521 (酉良酒酵母，Saccharomyces cerevisiae) 和XP329795(粗糙脈孢霉，Neurospora crassa)的六個(gè)氨基酸序列的保守區(qū)域進(jìn)行。PCR 的條件如下
(第一次PCR)
95 0C 5分鐘進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；將95 °C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C 1分30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；4°Cc 進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；
(第二次PCR)
95 0C 5分鐘進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；將95 °C 1分鐘、55°C 1分鐘、72°C 1分30秒進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C 7分鐘進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；4°Cc 進(jìn)行一個(gè)循環(huán)；
上述部分序列中未得到3’末端和5’末端的堿基序列信息，因此，以實(shí)施例1所得的RNA作為模板，進(jìn)行5’ -RACE,3' -RACE和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。該方法中使用5’ -Full RACE Core Set (Takara)和3’_Full RACE Core Set (Takara)。根據(jù)所得部分片段的信息設(shè)計(jì)第一次的 No. 243_P. 51_race_al (SEQ ID NO. 56)和第二次的 No. 243_P. 51_race_a2 (SEQ ID NO. 55)作為 5’ -RACE 用的反義引物，第一次的 No. 243_P. 51_race_sl (SEQ IDNO. 57)和第二次的 No. 243_P. 51_race_s2(SEQ ID NO. 58)作為 3，-RACE 用的有義引物，No. 243_P. 51_ race_p (SEQ ID NO. 59)作為反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)用。由此得到3，末端和5，末端的堿基序列信息。
根據(jù)3’末端和5’末端的堿基序列信息，設(shè)計(jì)cDNA文庫(kù)篩選用探針，使用SEQ ID N0. 60的引物作為有義引物，使用SEQ ID N0. 61的引物作為反義引物，進(jìn)行PCR。以所得片段作為探針，篩選實(shí)施例1所得的cDNA文庫(kù)。將所得片段TA克隆到pT7Blue載體上，進(jìn)行序列分析。
所得cDNA片段的全部堿基序列如SEQ ID N0. 17所示。SEQ IDN0. 17的堿基序列 681位-886位的核苷酸所示的區(qū)域、922位-1000位的核苷酸所示的區(qū)域、1042位-1285 位的核苷酸所示的區(qū)域、1339位-1732位的核苷酸所示的區(qū)域、以及1807位-20M位的核苷酸所示區(qū)域的堿基序列分別與巴西橡膠樹(shù)的磷酸甲羥戊酸激酶(登錄號(hào)具有 83 %、84 %、81 %、81 %和78 %的同源性。開(kāi)放閱讀框?yàn)?82位-2202位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID N0. 18所示。SEQ ID N0. 18的全長(zhǎng)氨基酸序列(1位-506位) 與巴西橡膠樹(shù)的磷酸甲羥戊酸激酶(登錄號(hào)AAL18926)具有78%的同源性。
本實(shí)施例中，使用SEQ ID N0. 62的引物作為有義引物，使用SEQ IDN0. 63的引物12作為反義引物，以上述所得CDNA作為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。將該擴(kuò)增片段與實(shí)施例2同樣供給互補(bǔ)性試驗(yàn)。突變株使用Ursi的磷酸甲羥戊酸激酶缺損株Y20806 (EUR0SCARF制備)。在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源 半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，在使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察中，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)，確定了磷酸甲羥戊酸激酶基因的功能。
(實(shí)施例10編碼甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的基因)
使用基于實(shí)施例1所得的推定為甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶的EST序列的信息設(shè)計(jì)的 Nl92-102_tree_l3103_3R_sl(SEQ ID NO. Μ)(第一次)和 Nl92-102_tree_l3103_3R_ s2(SEQ ID NO. 65)(第二次)作為3’-RACE用的有義引物，除此之外與實(shí)施例2同樣，得到全長(zhǎng)cDNA。
所得全長(zhǎng)cDNA具有SEQ ID NO. 19的堿基序列。SEQ ID NO. 1的堿基序列100 位-1325位的核苷酸所示區(qū)域的堿基序列與巴西橡膠樹(shù)的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(登錄號(hào) AF429386)具有80%的同源性。開(kāi)放閱讀框?yàn)?8位-13M位。由該cDNA編碼的推定氨基酸序列如SEQ ID NO. 20所示。在SEQ ID N0. 20的5位-418位的氨基酸區(qū)域中，該推定氨基酸序列與巴西橡膠樹(shù)的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(登錄號(hào)AAL18927)具有84%的同源性。
本實(shí)施例中，使用N219-36_tree_13103_s(SEQ ID NO. 66)作為有義引物，使用 N219-36-tree_13103_a(SEQ ID NO. 67)作為反義引物，以上述所得cDNA作為模板，除此之外與實(shí)施例2同樣進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目標(biāo)翻譯區(qū)的序列。將該擴(kuò)增片段與實(shí)施例2同樣供給互補(bǔ)性試驗(yàn)。突變株使用Ursi的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶缺損株Y2M18 (EUR0SCARF制備)。 在四分體分析中觀察到在YPG培養(yǎng)基(碳源半乳糖)上的生長(zhǎng)。并且，在使用來(lái)自八孢子囊的集落的生長(zhǎng)觀察中，觀察到在(B)極限完全培養(yǎng)基(碳源半乳糖，不含尿嘧啶)上的生長(zhǎng)。結(jié)果，通過(guò)互補(bǔ)，確定了甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因的功能。
產(chǎn)業(yè)實(shí)用性
本發(fā)明提供編碼杜仲的類異戊二烯化合物的生物合成中的初期合成途徑一甲羥戊酸途徑的各種酶的基因。本發(fā)明的基因適合用于制備大量含有反式異戊二烯或環(huán)烯醚萜的基因重組植物(例如杜仲)。
權(quán)利要求
1.基因，該基因是參與由杜仲的甲羥戊酸合成異戊烯焦磷酸的基因，該基因是由SEQ ID NO. 16的氨基酸序列中第1位-387位的氨基酸組成的、編碼甲羥戊酸激酶的基因。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其中，上述基因選自含有SEQIDN0. 15的堿基序列61 位-12M位核苷酸的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其中，上述基因選自含有SEQIDN0. 15的堿基序列1 位-1341位核苷酸的基因。
全文摘要
本發(fā)明提供參與杜仲的類異戊二烯化合物生物合成的基因群。本發(fā)明還提供參與由杜仲的甲羥戊酸合成異戊烯焦磷酸的基因。本發(fā)明的基因編碼杜仲的乙酰-CoA C-乙酰轉(zhuǎn)移酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶或甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102505018SQ20111035864
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2008年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月21日
發(fā)明者中澤慶久, 小林昭雄, 福崎英一郎, 西河貴史, 馬場(chǎng)健史 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人大阪大學(xué), 日立造船株式會(huì)社