專利名稱：：法呢基途徑的生物標志物的制作方法法呢基途徑的生物標志物二膦酸鹽(bisphosphonates)，尤其是氨基二膦酸鹽抑制甲羥戊酸途徑中的關(guān)鍵酶，法呢二磷酸(FPP)合成酶(GreenJR.二膦酸鹽臨床前綜述(Bisphosphonates:preclinicalreview),TheOncologist2004;9(Suppl4):3-13)。對該酶的抑制導致蛋白質(zhì)異戊二烯化的減少(RogersMJ,GordonS,BenfordHL，CoxonFP，LuckmanSP,M6nkk6nenJ,FrithJC.Cellularandmolecularmechanismsofactionofbisphosphonates(二勝酸鹽作用的細胞和分子機制).Cancer(癌癥).2000;88(12Suppl):2961-78)。結(jié)果，影響了FPP的產(chǎn)生并因此影響了角鯊烯和類固醇(膽固醇)的生物合成。此外，涉及將法呢基或香葉基香葉基基團轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的半胱氨酸氨基酸殘基上的信號傳導蛋白的異戊二烯化也被阻礙。異戊二烯化是涉及許多代謝途徑的一些關(guān)鍵蛋白的充分激活所必需的翻譯后修飾，所述代謝途徑是細胞存活，細胞骨架組構(gòu)和癌癥進展的基礎(chǔ)(GreenJR.Bisphosphonates:preclinicalreview(二膦酸鹽臨床前綜述).TheOncologist2004;9(Suppl4):3-13;WakelingAE.Inhibitorsofgrowthfactorsignalling(生長因子信號傳導的抑制劑).EndocrRelatCancer.2005Jul;12Suppll:S183-7)。其中二膦酸鹽干擾的途徑描述在例如Reszka和Rodan,Mini-ReviewsinMedicinalChemistry(在藥物化學中的小綜述)，2004,第4巻,第712頁，圖3中。貓尿氨酸(2-氨基-7-羥基-5，5-二甲基-4-硫代庚酸)(HOOCCH(NH2)CH2SC(CH3)2CH2CH2OH)是一種已知在雄性貓尿中大量存在的重要的含硫的氨基酸。已經(jīng)推測貓尿氨酸起著吸引雌貓的雄性信息素的作用(HendriksWH，WoolhouseAD，TartelinMF，MoughanPJ(1995b)Synthesisoffelinine，2-amino-7-hydroxy-5,5-dimethyl-4-thiaheptanoicacid(貓尿氨酸，2-氨基-7-羥基-5,5-二甲基-4-硫代庚酸的合成).BioorgChem(生物有機化學)23:89-100)。到目前為止，沒有顯示貓尿氨酸存在于除了貓之外的物種中。貓尿氨酸的衍生物，Y-谷氨?；鵩elinyl甘氨酸的腎代謝物最近在家養(yǎng)貓的血液中被鑒定出來(W.H.Hendricks，D.R.Harding,K.J.Rutherfuurd-Marwick(2004)，Isolationandcharacterizationofrenalmetabolitesof，y-glutamylfelinylglycineintheurineofthedomesticcat(Feliscatus)(y-谷氨?；鵩elinyl甘氨酸的腎代謝物在家養(yǎng)貓(Feliscatus)尿中的分離和表征)，CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol139，245-251)。這種三肽在其它動物物種中以類似于谷胱甘肽-S-綴合物的方式由腎代謝。除了前述游離貓尿氨酸的存在之外，在貓尿中還顯示一些包含貓尿氨酸的代謝物的存在，包括N-乙?；埬虬彼?，felinyl甘氨酸和未改變的Y-谷氨酰基felinyl甘氨酸。y-谷氨?；鵩elinyl甘氨酸在貓中的腎代謝以與谷胱甘肽S-綴合物在其它動物物種中類似的方式進行，盡管檢測到felinyl甘氨酸說明可能存在微小的差別。發(fā)明描述本發(fā)明涉及一種新的生物標志物，其可以用于確定化合物干擾類固醇代謝的程度的方法中。所述生物標志物可以是2-氨基-7-羥基-5,5-二甲基-4-硫代庚酸，也稱為貓尿氨酸的任何天然存在的衍生物。所述衍生物包括下式的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>V其中R,R，，R"和R，"獨立地是H,CH3，COCH3,COH,OCH3,OC2H5,Gly,Gin,Glu，Ala,Val,Met,磷酸根，或焦磷酸根。所述標志物的優(yōu)選的實施方案是Y-谷氨酰基felinyl甘氮酸(3-甲基丁醇gluthatione),felinyl甘氨酸，貓尿氨酸或N-乙?；?貓尿氨酸。前述的標志物用在確定物質(zhì)干擾類固醇代謝的程度的方法中，所述方法包括確定所述標志物在用所述物質(zhì)處理受試者的體液，和完整的組織或組織提取物中的存在或不存在，其中N-乙?；?貓尿氨酸的存在指示干擾類固醇代謝的物質(zhì)，而N-乙酰基-貓尿氨酸的不存在指示不干擾類固醇代謝的物質(zhì)。體液可以是來自身體的任何流體，如血液，血漿，血清或尿液。完整的組織是任何類型的組織，其在根據(jù)本發(fā)明進行分析前從身體中移出。組織提取物是來自從身體中移出的組織的任何提取物，其使用本領(lǐng)域眾所周知的提取方法獲得。本文所述的方法是在它們從身體中移出后，在樣品(體液，完整的組織，組織提取物)上進行的離體(ex-vivo)，原位或體外方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，確定干擾法呢二磷酸產(chǎn)生的程度。優(yōu)選地，所述體液是尿液，血漿或血清。在最優(yōu)選的實施方案中，在受試者的尿液中確定N-乙?；?貓尿氨酸的存在或不存在。術(shù)語"干擾類固醇代謝的程度"涉及貓尿氨酸衍生物的產(chǎn)生和類固醇代謝之間的關(guān)聯(lián)，如FPP的抑制。因此。更高水平的貓尿氨酸衍生物與強烈的干擾(例如FPP的較強烈抑制)相關(guān)，而貓尿氨酸衍生物的低或不可檢測的水平與較弱干擾相關(guān)(例如FPP的更小的抑制，其可以由不同的抑制機制造成并且導致更低的抑制，例如蛋白質(zhì)異戊二烯化的更小的抑制)。因此，存在在貓尿氨酸衍生物產(chǎn)生和法呢二磷酸產(chǎn)生之間的關(guān)聯(lián)。用于本文的術(shù)語"受試者"涉及任何哺乳動物，優(yōu)選地涉及人受試者。盡管要理解的是，本文所述的方法沒有直接在受試者身體上進行的。因此，它們不是體內(nèi)方法。發(fā)現(xiàn)，N-乙?；?貓尿氨酸可以用于區(qū)別不同的二膦酸鹽，伊班膦酸鹽和唑來膦酸鹽。二膦酸鹽是焦磷酸鹽的類似物，其中偕位(geminal)氧已經(jīng)被碳取代(見，圖1在Mini-ReviewsinMedicinalChemistry(在藥物化學的小綜述)2004,第4巻，第712頁中)。伊班膦酸鹽結(jié)構(gòu)見例如圖2，在Mini-ReviewsinMedicinalChemistry(在藥物化學的小綜述)2004，第4巻，第712頁中。唑來膦酸鹽結(jié)構(gòu)見例如圖2，在Mini-ReviewsinMedicinalChemistry(在藥物化學的小綜述)2004,第4巻，第712頁中。盡管它們都可以抑制FPP合成酶，并且因此干擾固醇合成，它們抑制的程度不同。因此，發(fā)現(xiàn)在給定的時間間隔，唑來膦酸鹽刺激導致在尿中存在高水平的N-乙?；?貓尿氨酸，而關(guān)于伊班膦酸鹽刺激，在尿中沒有檢測到N-乙?；?貓尿氨酸水平。因此，根據(jù)本發(fā)明，還提供了在用伊班膦酸鹽或唑來膦酸鹽處理的受試者中區(qū)分伊班膦酸鹽和唑來膦酸鹽的方法，所述方法包括在用所述物質(zhì)處理的受試者的體液，完整組織或組織提取物中確定N-乙?；?貓尿氨酸或貓尿氨酸的另一種天然衍生物的存在或不存在，其中N-乙酰基-貓尿氨酸或貓尿氨酸的另一種天然衍生物的不存在指示患者是用伊班膦酸鹽還是用唑來膦酸鹽處理。優(yōu)選地，身體提取物是尿液，血漿或血清。在最優(yōu)選的實施方案中，在受試者的尿中確定N-乙?；?貓尿氨酸的存在或不存在。可以通過NMR或LC/GC-MS獲得鑒定和量化。根據(jù)本發(fā)明，N-乙?；?貓尿氨酸或任何天然存在的貓尿氨酸的衍生物也可以用作用于二膦酸鹽誘導毒性，尤其是腎毒性的標志物。在唑來膦酸鹽處理的動物中，在組織病理學方面觀察到了腎毒性和肝毒性，但是關(guān)于伊班膦酸鹽則沒有觀察到這些。此外，本發(fā)明提供將具有下式的貓尿氨酸衍生物用作標志物的應(yīng)用，其中R，R，，R"和R"，獨立的是H,CH3,COCH3，COH,OCH3，OC2H5,Gly,Gin,Glu,Ala,Val,Met,磷酸根，或焦磷酸根，所述標志物用于信號傳導蛋V白的翻譯后修飾蛋白異戊二烯化的改變。許多代謝途徑取決于蛋白質(zhì)異戊二烯化。因此，蛋白質(zhì)異戊二烯化的減少影響所述代謝途徑。附圖簡述圖la,b):N-乙?；?貓尿氨酸在貓中的合成途徑。報道了貓種類的合成N-乙?；?貓尿氨酸的途徑。提議了兩種合成，都需要異戊烯基(與類固醇合成相關(guān)！)。假定一種合成在腎中發(fā)生，另一種合成開始在肝中，其中通過血液將三肽運輸?shù)侥I中并代謝為n-乙酰基-貓尿氨酸。黃色的框標記在腎中假定的結(jié)構(gòu)和反應(yīng)，藍色的框標記在肝中假定發(fā)生的反應(yīng)，絳紅色的框標記三肽，所述三肽通過血液從肝中運輸?shù)侥I中。通過在血漿中尋找三肽應(yīng)該可能在肝合成和純的腎合成中進行區(qū)分。圖2:在給藥前，三只大鼠的NMR光譜。圖3a)-c):相對于肌酸酐的bin1.32ppm(N-乙?；埬虬彼岬募谆盘?的時間進程注意伊班膦酸鹽給藥的大鼠顯示在binl.32中沒有增加！圖4a)-c):大鼠尿NMR光譜的統(tǒng)計學分析揭示在1.32ppm的重要信號圖5:在給藥后96小時三只大鼠的NMR光譜在1.32ppm僅對于唑來膦酸鹽給藥大鼠可見的新信號。圖6:用6mg/kg唑來膦酸鹽給藥的大鼠尿液中關(guān)于N-乙酰基貓尿氨酸的結(jié)構(gòu)闡釋的2D,1H,13CHMBC光譜。圖7:大鼠尿液的LC-MS研究大鼠對照組；關(guān)于預(yù)期質(zhì)量的N-乙?；埬虬彼釠]有觀察到信號(綠色萃取離子色譜和室溫下9.6分鐘的中間(middle)MS示蹤)(m7z248，以陰性模式)。圖8:大鼠尿液的LC-MS研究在給藥后96小時，用6mg/kg唑來膦酸鹽給藥組的大鼠對于預(yù)期質(zhì)量的N-乙酰基貓尿氨酸觀察到強烈的信號(紅色萃取離子色譜和室溫下9.6分鐘的中間MS示蹤)(m/z248，以陰性禾莫式)。MS/MS顯示預(yù)期的斷裂模式(m/z119)。圖9:大鼠尿液的LC-MS研究在給藥后96小時，在用3mg/kg伊班膦酸鹽給藥組的大鼠中，關(guān)于預(yù)期質(zhì)量的N-乙酰基貓尿氨酸沒有發(fā)現(xiàn)信號(m/z248以陰性模式)。圖10:大鼠尿液的LC-MS研究加入N-乙酰基貓尿氨酸的大鼠對照組；關(guān)于預(yù)期質(zhì)量的N-乙酰基貓尿氨酸發(fā)現(xiàn)強烈的信號(m/z248，以陰性模式)。實施例1.1測試系統(tǒng)測試系統(tǒng)基本原理來源組分配動物總數(shù)量在遞送的年齡區(qū)分隨機化1.2分配Crl:CD⑧(SD)IGS.BR(SPF)SpragueDawley大鼠用于所有COMET研究的標準品系CharlesRiverDeutschlandGmbHSulzfeld/德國組l-5:每組10只雄性50只雄性約6周(在處理開始的8周)籠子編號和耳朵刺的標記計算機產(chǎn)生的隨機算法<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>*僅用賦形劑處理對照動物.1.3詞養(yǎng)管理條件標準實驗室條件。以每小時10-15次換氣來進行空氣調(diào)節(jié)，持續(xù)監(jiān)測環(huán)境在溫度22±3。C和相對濕度在30-70。/。的目的范圍。12小時熒光光照/12小時黑暗周期，在光照階段播放音樂。住宿在順應(yīng)期的大部分天數(shù)里，將每只動物置于具有金屬網(wǎng)眼頂部和標準的軟木墊的Makrolon3型的籠子('Lignocel'SchillAQCH-4132Muttenz/瑞士)中，并在順應(yīng)期的三天(第7天，第4天和第1天)和整個取樣階段，將每只置于代謝籠(>300g,Tecniplast，意大利)中。飲食隨意取用Purinachow5002經(jīng)過檢驗的嚙齒類動物飲食，其是非小丸的(non-pelleted)(PMINutitionInternational,LLCP.O.Box19798,布倫特伍德,MO63144美國)。從順應(yīng)期開始時即向動物提供。水隨意取用來自Itingen的公用自來水。在附錄I中顯示代表性的細菌學、化學和污染物分析結(jié)果。見第110-113頁1.4測試項目化合物l:在鹽水溶液中的伊班膦酸鹽化合物2:在鹽水溶液中的唑來膦酸鹽對照/賦形劑鹽水溶液(0.9%)1.5尿取樣以下面的取樣計劃表中給出的間隔，在0-4。C(通過Tecniplast取樣/冷卻裝置自動冷卻)在代謝籠中收集尿樣品到樣品管中，所述樣品管包含lml的疊氮化銫水溶液(1%)。在等分前，確定尿液的體積。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*:該樣品經(jīng)歷如下所述的另外的特殊的尿液分析在達到取樣階段末期后立即確定體積并將樣品在3000u/分鐘[500g]離心10分鐘。1.6通過NMR和LC-MS確定N-乙酰基-貓尿氨酸基于1D和2DNMR光譜鑒定尿樣品中的N-乙?；?貓尿氨酸。在BmkerAV600分光計上在600.13MHz上獲得光譜并在BrukerDRX-500分光計上在500.13MHz獲得光譜。制備并測量尿樣品并如別處所述評價數(shù)據(jù)(Keun,H.C.;Ebbels,T,M.D.;Antti,H.;Bollard,M.E.;Beckonert,O.;Schlotterbeck,G.;Senn,H，；Niederhauser,U.;Holmes,E.;Lindon,J.C.;Nicholson,J.K.Ozem.i饑7bxz'co/.2002,75,1380-1386)。將400微升的尿的等分試樣轉(zhuǎn)移到孔板中。為了調(diào)整尿的pH，將200微升的緩沖液[約0.2MNa2HP04/NaH2P04，約1mMTSP(3-三甲基甲硅垸基-D4-丙酸)，約3mM疊氮化鈉]加入每個孔中。在4。C，在約3,000rpm將制備的孔板進行離心5-10分鐘以去除不溶的物質(zhì)。在300K測量進行Metabonomic分析的1HNMR光譜(例如，在500Mhz:64k數(shù)據(jù)點，12019.2Hz光譜寬度)。通過使用標準的脈沖-順序(例如noesyprld，以2秒放松延遲輻射，并在100ms的混合時間中)抑制水共振。對于每個樣品，加入需要的許多瞬時，以提供具有足夠高信號噪音比的光譜。通過使用匹配的窗功能(例如lb=l)，隨后通過(自動或手動的)相位調(diào)整和基線校正進行傅立葉轉(zhuǎn)換。關(guān)于加入的TSP(定義為O.Oppm)進行參照。用BrukerXWinNMR3.5軟件進行光譜的獲得和處理。減少每個記錄的光譜的大小來進行簡單的統(tǒng)計學分析(例如，對于根據(jù)標準方法記錄的NMR光譜，通過在0.2-10.0ppm之間的等距整合來計算245個變量)。在分析前，排除或合并包含誤導信息(例如，溶劑，覆蓋4.5-6.0ppm的區(qū)域的尿素)的區(qū)域(例如，2.66-2.74ppm的區(qū)域充當指示檸檬酸鹽的值)。考慮尿濃度中的變化，將所有減少數(shù)據(jù)的光譜標準化到不變的100個單位的整合強度。多變量數(shù)據(jù)分析鑒定信號，信號的模式和其衍生出的代謝物，它們在個體和個體的組之間顯著不同。由此，將廣泛PCA(主要成分分析)用于鑒定信號的顯著模式并且將這些模式分配到樣品和樣品的組中。還將PLS(對潛在結(jié)構(gòu)的預(yù)期，部分最小二乘方)用于發(fā)現(xiàn)信號的顯著模式，其中與PCA相反，將給藥組的信息用于加強顯著變化的鑒定。以代謝物的內(nèi)部數(shù)據(jù)庫的輔助，以途徑繪圖方法(KEGG數(shù)據(jù)庫)的輔助和以當可能時對于未知代謝物的分光鏡結(jié)構(gòu)的輔助闡釋進行分配。在用唑來膦酸鹽給藥的大鼠的光譜中發(fā)現(xiàn)N-乙?；?貓尿氨酸(見圖5)。在1DNMR光譜中觀察到在1.32ppm的信號，并在2DNMR實驗的基礎(chǔ)上闡釋結(jié)構(gòu)(見圖6)。LC-MS此外，還在尿樣品的LC-MS實驗中確定N-乙?；?貓尿氨酸。使用與裝配了電噴射界面的BrukerEsquire3000+質(zhì)譜儀偶聯(lián)的Agilent1100HPLC系統(tǒng)進行尿的LC-MS分析。用蒸餾水將尿樣品稀釋4倍并從維持在4。C的孔板將2pl注射到150mmx3.9mmWatersAtlantisdC183pmHPLC柱上，所述柱維持在30。C的烘箱中。將所述柱以1ml/分鐘的流速洗脫；流動相A由20mM乙酸銨組成，流動相B由乙腈組成。將以100%A起始5分鐘的梯度洗脫在15分鐘內(nèi)線性增加到95%B并在95%B維持3分鐘，在1分鐘內(nèi)回到100%A，接著在最后的5分鐘內(nèi)再平衡，隨后注射下一個樣品。以81/分鐘的干燥氣流，27psi的噴霧器壓力和330。C的干燥溫度，以陰性模式(negativemode)運行質(zhì)譜儀。設(shè)定儀器以獲得m/z50-800的質(zhì)量范圍。在該條件下，在給藥唑來膦酸鹽的大鼠的樣品中，在9.6分鐘的停留時間發(fā)現(xiàn)預(yù)期為m7z248的N-乙?；?貓尿氨酸(見圖8)。MS/MS實驗揭示預(yù)期的片段m/z119。在LC-MS中，還可以以陽性模式(positivemode)測量N-乙?；?貓尿氨酸。在本文，在m/z250發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的M+fT質(zhì)量。權(quán)利要求1.一種確定物質(zhì)干擾類固醇代謝的程度的方法，所述方法包括-確定在用所述物質(zhì)處理的受試者的體液和完整的組織或組織提取物中，下式的貓尿氨酸衍生物的存在或不存在，其中R，R’，R”和R”’獨立地是H，CH3，COCH3，COH，OCH3，OC2H5，Gly，Gln，Glu，Ala，Val，Met，磷酸根，或焦磷酸根，其中所述貓尿氨酸衍生物的存在指示干擾類固醇代謝的物質(zhì)，所述貓尿氨酸衍生物的不存在指示不干擾類固醇代謝的物質(zhì)。-其中確定干擾法呢二磷酸產(chǎn)生的程度。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述干擾在體液中進行確定，所述體液是尿，血漿或血清。3.權(quán)利要求1或2任一項的方法，其中所述貓尿氨酸衍生物是Y-谷氨酰基felinyl甘氨酸(3-甲基丁醇gluthatione)，felinyl甘氨酸，貓尿氨酸或N-乙?；?貓尿氨酸。4.一種在用氨基二膦酸鹽化合物處理的受試者中區(qū)分伊班膦酸鹽和唑來膦酸鹽的方法，所述方法包括在用所述物質(zhì)處理的受試者的體液，完整的組織或組織提取物中，確定下式的貓尿氨酸衍生物的存在或不存在其中R,R，，R"和R，"獨立地是H，CH3,COCH3，COH,OCH3,OC2H5,Gly,GIn，Glu，Ala,Val，Met,磷酸根，或焦磷酸根。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中所述貓尿氨酸衍生物的不存在指示所述受試者是用伊班膦酸鹽還是用唑來磷酸鹽處理。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述體液是尿，血槳或血清。6.權(quán)利要求4或5的方法，其中所述貓尿氨酸衍生物是Y-谷氨?；鵩elinyl甘氨酸(3-甲基丁醇gluthatione),fdinyl甘氨酸，貓尿氨酸或N-乙?；?貓尿氨酸。7.下式的貓尿氨酸衍生物用作二膦酸鹽誘導的腎毒性的標志物的應(yīng)用，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中R,R，，R"和R"，獨立地是H,CH3,COCH3，COH，OCH3，OC2H5,Gly,Gin,Glu,Ala,Val,Met,磷酸根，或焦磷酸根。8.權(quán)利要求7的應(yīng)用，其中所述貓尿氨酸衍生物是Y-谷氨?；鵩elinyl甘氨酸(3-甲基丁醇gluthatione)，felinyl甘氨酸，貓尿氨酸或N-乙?；?貓尿氨酸。9.下式的貓尿氨酸衍生物作為翻譯后修飾蛋白質(zhì)異戊二烯化的改變的標志物的應(yīng)用，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中R,R，，R"和R，"獨立地是H，CH3，COCH3,COH,OCH3,OC2H5,Gly，Gin,Glu，Ala,Val，Met,磷酸根或焦磷酸根。全文摘要本發(fā)明涉及新的生物標志物，其可以用于確定物質(zhì)干擾法呢基途徑的程度。文檔編號G01N33/68GK101416062SQ200780012324公開日2009年4月22日申請日期2007年3月28日優(yōu)先權(quán)日2006年4月5日發(fā)明者勞拉·蘇特-迪克,弗蘭克·迪耶泰勒,格茨·施洛特貝克,漢斯·森申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司