一種以油脂為原料生產(chǎn)甲羥戊酸的方法及其構(gòu)建的基因工程菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以油脂為原料生產(chǎn)甲羥戊酸的方法及其構(gòu)建的基因工程菌，是在敲除phaC1基因的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中導(dǎo)入外源羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因。該菌株以油脂為底物發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸，具有轉(zhuǎn)化率較高的優(yōu)點(diǎn)，有效的降低了生產(chǎn)成本，該方法為甲羥戊酸生物合成的工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【專利說明】一種以油脂為原料生產(chǎn)甲羥戊酸的方法及其構(gòu)建的基因工程菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種經(jīng)過遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，以及利用真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲羥戊酸代謝途徑廣泛存在于多種生物中，甲羥戊酸是甲羥戊酸代謝途徑中一個(gè)重要的中間代謝物，可作為前體進(jìn)一步合成多種具有重要生理功能的類異戊二烯化合物如異戊二烯、類胡蘿卜素，輔酶Q10，青蒿素，紫杉醇等。
[0003]作為類異戊二烯化合物的前體化合物，甲羥戊酸具備越來越重要的商業(yè)價(jià)值，目前可以通過微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)甲羥戊酸。如可以在工程菌中表達(dá)甲羥戊酸代謝途徑的重組酶來實(shí)現(xiàn)甲輕戍酸的發(fā)酵(Tabata et al., 2004BiotechnologyLetters, 26:1487-1491 ；Piteta et al., 2007Metabolic Engineering, 9:193-207),盡管上述研究利用不同的工程菌和不同的重組酶進(jìn)行甲羥戊酸及其下游衍生物的發(fā)酵，但是均有一個(gè)共同點(diǎn)，就是以糖為原料進(jìn)行發(fā)酵。從理論上來講1.5分子的糖生成3分子的乙酰輔酶a，再生成I分子的甲羥戊酸，該過程中每生產(chǎn)I分子甲羥戊酸就損失3個(gè)碳原子，因此理論質(zhì)量轉(zhuǎn)化率只有52%。而在實(shí)際生物發(fā)酵的過程中糖至甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化率要低于這個(gè)理論值，因此以糖為原料進(jìn)行甲羥戊酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率較低，限制了其商業(yè)化應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種經(jīng)過遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，降低真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌將油脂類底物合成PHA的能力，提高油脂類底物經(jīng)乙酰輔酶A至甲羥戊酸的碳代謝流比率。
[0005]所述降低真養(yǎng)產(chǎn)堿`桿菌將油脂類底物合成PHA的能力是通過敲除phaCl基因?qū)崿F(xiàn)的。
[0006]具體而言，所述經(jīng)過遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，是在敲除phaCl基因的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中導(dǎo)入外源羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因。
[0007]優(yōu)選地,幾腸球菌(Enterococcus faecalis)輕甲基戍二酸單酸輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因的全長序列信息已經(jīng)公開。(Tabata etal.,2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491)
[0008]所述羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因來自于Enterococcus菌屬，為原核苷酸序列或在原序列中引入一處或多處改變以適應(yīng)在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中表達(dá)的需要。
[0009]所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌優(yōu)選真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha H16(來自德國微生物菌種保藏中心，編號(hào)DSM428 )。
[0010]本發(fā)明還提供了一種經(jīng)過遺傳修飾真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的構(gòu)建方法，是在敲除phaCl基因的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中導(dǎo)入外源羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因。
[0011]更進(jìn)一步，經(jīng)過遺傳修飾真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的構(gòu)建方法:
[0012]I)敲除真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組上的phaCl基因(PHA合成酶基因)；
[0013]2)以質(zhì)粒pBBRMCS-2為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，將用于合成甲羥戊酸的羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因引入穿梭質(zhì)粒;
[0014]3)將步驟2)構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入步驟I)經(jīng)過遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌得到重組菌。
[0015]優(yōu)選地，經(jīng)過遺傳修飾真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的構(gòu)建方法:
[0016]I)從野生型真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16出發(fā)，通過基因敲除技術(shù)敲除其基因組上的phaCl基因(PHA合成酶基因)，降低其利用油脂類碳源合成PHA的能力。
[0017]2)以質(zhì)粒pBBRMCS-2為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，將用于合成甲羥戊酸的羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因引入穿梭質(zhì)粒并導(dǎo)入大腸桿菌S17-1 ；
[0018]3)通過轉(zhuǎn)導(dǎo)將穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌。
[0019]本發(fā)明還提供了一種利用經(jīng)過遺傳修飾真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸的方法，技術(shù)方案如下:
[0020]I)敲除真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組上的phaCl基因(PHA合成酶基因)；
[0021]2)以質(zhì)粒pBBRMCS-2為出發(fā)質(zhì)粒構(gòu)建穿梭質(zhì)粒，將用于合成甲羥戊酸的羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因引入穿梭質(zhì)粒;
[0022]3)將步驟2)構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入步驟I)經(jīng)過遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌得到重組菌；
[0023]4)利用步驟4)得到的重組菌以油脂為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
[0024]更進(jìn)一步，本發(fā)明還提供了一種以甲羥戊酸為中間產(chǎn)物，生產(chǎn)目的產(chǎn)物的方法。是在高產(chǎn)甲羥戊酸的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用甲羥戊酸發(fā)酵生產(chǎn)目的產(chǎn)物異戊二烯以及異戊二烯基單元合成的萜類化合物。
[0025]本發(fā)明要解決的問題是通過構(gòu)建遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌使之適用于將油脂類底物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸，遺傳修飾后的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌降低將油脂類底物合成PHA的能力，提高油脂類底物經(jīng)乙酰輔酶A至甲羥戊酸的碳代謝流比率。目前未有研究報(bào)導(dǎo)利用工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵甲羥戊酸的報(bào)導(dǎo)，也未有研究利用工程菌以油脂為底物發(fā)酵甲羥戊酸的報(bào)導(dǎo)。
[0026]由于遺傳修飾后的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌能夠以油脂類底物為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸，其轉(zhuǎn)化率要高于現(xiàn)有的以糖為原料轉(zhuǎn)化甲羥戊酸的常見發(fā)酵方法，使得整體的生產(chǎn)成本得到降低，經(jīng)濟(jì)性得到提高。
[0027]本發(fā)明中的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌能夠高效的轉(zhuǎn)化油脂類底物生成甲羥戊酸，該轉(zhuǎn)化過程在溫和的條件下(30_37°C)進(jìn)行，且由底物至甲羥戊酸的轉(zhuǎn)化率較高，有效的降低了生產(chǎn)成本，該方法為甲羥戊酸生物合成的工業(yè)化應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1:針對(duì)真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H16基因組的遺傳修飾，即phaCl基因的敲除。
[0029]phaCl基因的敲除。真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha H16 (來自德國微生物菌種保藏中心，編號(hào)DSM428)被用作基本菌株來進(jìn)一步進(jìn)行遺傳修飾。根據(jù)已經(jīng)公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組信息(NCBI登陸號(hào):NC_008313.1),找到phaCl基因(NCBI登陸號(hào)為NC_008313.1基因組中Locus tag編號(hào):H16_A1437)上下游各500個(gè)堿基的基因序列合并為I千個(gè)堿基的序列，根據(jù)序列信息化學(xué)合成約I千堿基的線性DNA片段(SEQ ID N0.1)，序列兩端含有15bp和質(zhì)粒pJQ200mpl8Km相同的同源臂。利用 In-Fusion HD 試劑盒(Takara,貨號(hào) 639648)將通用自殺質(zhì)粒 pJQ200mpl8Km (York etal., 2001Journal of Bacteriology 183:2394,麻省理工學(xué)院 Sinskey 實(shí)驗(yàn)室提供)和合成的線性DNA片段重組為新質(zhì)粒pGY46，將pGY46通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1(來自德國微生物菌種保藏中心，編號(hào)DSM9079)。而后通過細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將pGY46通過大腸桿菌S17-1導(dǎo)入Ralstonia eutropha H16進(jìn)行phaCl基因敲除，該操作步驟和使用自殺質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除的標(biāo)準(zhǔn)方法一致(Lindenkamp et al., 2012Applied and EnvironmentalMicrobiology, 78:5375)。
[0030]實(shí)施例2:含外源羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因的表達(dá)載體的和工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的構(gòu)建。
[0031]根據(jù)已經(jīng)公布的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)輕甲基戍二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因的全長序列信息(Tabata etal., 2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491),對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行優(yōu)化使之適用于在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化后的序列為mvaZl。根據(jù)mvaZl進(jìn)行化學(xué)合成，合成時(shí)分別在序列的兩端分別加上15bp和質(zhì)粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列。然后利用In-Fusion HD試劑盒(Takara，貨號(hào)639648)重組mvaZl片段和通用表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS_2 (荷蘭菌種保藏中心，編號(hào)NCCB3434)的部分`序列(不含IacZ基因的序列)，重組為新表達(dá)載體pBBR-mvaRZ(SEQ ID N0.2)。
[0032]將表達(dá)載體pBBR-mvaRZ通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1。而后通過細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將表達(dá)載體pBBR-mvaRZ通過大腸桿菌S17-1導(dǎo)入遺傳修飾過的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(敲除phaCl基因)來構(gòu)建產(chǎn)甲羥戊酸的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌。
[0033]實(shí)施例3:利用構(gòu)建的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌以植物油如花生油或橄欖油為碳源發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
[0034]使用工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌以植物油(花生油或橄欖油)為碳源發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。使用該菌株發(fā)酵甲羥戊酸的條件為:在500毫升搖瓶體系中使用100毫升裝液量，接種量5%，發(fā)酵溫度30°C，pH值控制在6.8，培養(yǎng)基組分見表1，初始植物油添加量為10克/升(花生油或橄欖油)，攪拌速度為300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，發(fā)酵96小時(shí)后，以不同植物油為碳源發(fā)酵甲羥戊酸的產(chǎn)量見表2。
[0035]表1工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分表
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)甲羥戊酸的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，是降低真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌將油脂類底物合成PHA的能力，提高油脂類底物經(jīng)乙酰輔酶A至甲羥戊酸的碳代謝流比率。
2.如權(quán)利要求1所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，其特征在于，是在敲除PhaCl基因的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中導(dǎo)入外源羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因。
3.如權(quán)利要求1所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，其特征在于，所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌為真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha H16,所述輕甲基戍二酸單酰輔酶A合成酶基因和輕甲基戍二酸單酰輔酶A還原酶基因來自于Enterococcus菌屬，為原核苷酸序列或在原序列中引入一處或多處改變以適應(yīng)在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中表達(dá)的需要。
4.如權(quán)利要求3所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌，其特征在于，所述羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因來自糞腸球菌。
5.權(quán)利要求1所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌用于發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
6.如權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，步驟如下: I)敲除真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌基因組上的PhaCl基因； 2 )將羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因引入穿梭質(zhì)粒； 3)將步驟2)構(gòu)建的穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入步驟I)經(jīng)過步驟I)遺傳修飾的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌得到重組菌； 4)步驟3)得到的重組菌利用油脂發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
7.如權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，所述羥甲基戊二酸單酰輔酶A合成酶基因和羥甲基戍二酸單酰輔酶A還原酶基因來自于Enterococcus菌屬，為原基因序列或在原序列中引入一處或多處突變以適應(yīng)在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中表達(dá)的需要。
8.如權(quán)利要求7所述方法，其特征在于，所述真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌為真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌RalstoniaeutrophaH16。
9.如權(quán)利要求6所述方法，其特征在于，具體步驟如下: 1)根據(jù)已經(jīng)公布的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstoniaeutropha H16基因組信息，找到phaCl基因上下游各500個(gè)堿基的基因序列合并為I千個(gè)堿基的序列，根據(jù)序列信息化學(xué)合成約I千堿基的線性DNA片段如SEQ ID N0.1所示，序列兩端含有15bp和質(zhì)粒pJQ200mpl8Km相同的同源臂；將通用質(zhì)粒pJQ200mpl8Km和合成的線性DNA片段重組為新質(zhì)粒pGY46，將pGY46通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1，而后通過細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將pGY46通過大腸桿菌 S17-1 導(dǎo)入 Ralstonia eutropha H16 進(jìn)行 phaCl 基因敲除； 2)根據(jù)已經(jīng)公布的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)輕甲基戍二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因的全長序列信息，對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行優(yōu)化使之適用于在真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中進(jìn)行表達(dá)，優(yōu)化后的序列為mvaZl ;根據(jù)mvaZl進(jìn)行化學(xué)合成，合成時(shí)分別在序列的兩端分別加上15bp和質(zhì)粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列；將重組mvaZl片段和通用表達(dá)質(zhì)粒pBBRlMCS-2不含IacZ基因的序列重組為新表達(dá)載體pBBR-mvaRZ，重組載體pBBR-mvaRZ核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； 3)將表達(dá)載體pBBR-mvaRZ通過傳統(tǒng)的熱激轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌S17-1，而后通過細(xì)菌轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將表達(dá)載體pBBR-mvaRZ通過大腸桿菌S17-1導(dǎo)入遺傳修飾過的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌來構(gòu)建產(chǎn)甲羥戊酸的工程真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌；4)利用步驟3)得到的重組菌以油脂為原料發(fā)酵生產(chǎn)甲羥戊酸。
10.權(quán)利要 求5所述方法在發(fā)酵生產(chǎn)以甲羥戊酸為中間代謝產(chǎn)物產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103602626SQ201310473745
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 鄒慧斌, 程濤, 徐鑫 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所