一種微生物催化合成β-石竹烯的方法及能夠合成β-石竹烯的重組細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】一種微生物催化合成β-石竹烯的方法以及能夠合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，其中所用的乙酰輔酶A是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得的，所述方法包括下述步驟：A)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶A合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基因片段：乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶；B)利用A)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑誘導(dǎo)，經(jīng)過分離純化后即可獲得β-石竹烯。
【專利說明】-種微生物催化合成β-石竹烯的方法及能夠合成β-石 竹烯的重組細(xì)胞

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用生物法制備萜烯類化合物的方法，具體地，涉及一種微生物 催化合成β-石竹烯的方法以及能夠合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，其中所用的乙酰輔酶A 是從諸如葡萄糖的簡單起始材料獲得的。

【背景技術(shù)】
[0002] 萜烯類化合物--β -石竹烯，是一種雙環(huán)倍半萜型的重要平臺化合物，是醫(yī)藥、 食品、化妝品及高密度燃料工業(yè)的重要原料。β -石竹烯作為香料，已被應(yīng)用于化妝品和食 品添加劑中；在醫(yī)藥行業(yè)，β_石竹烯具有局麻、抗炎、驅(qū)蚊蟲、抗焦慮、抗抑郁等作用，其衍 生物石竹烯醇還可應(yīng)用于鎮(zhèn)咳祛痰藥物中，石竹烯氧化物具有鎮(zhèn)痛和抗炎、抗真 菌、抗細(xì)胞毒性等作用；同時β_石竹烯加氫的產(chǎn)物還可作為高密度燃料的原料。
[0003] 目前，β -石竹烯的制備主要包括從天然植物中采用一系列化學(xué)反應(yīng)提取或利用 相關(guān)原料在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行合成兩種方法，由于天然植物中β-石竹烯的含量較低，造 成其提取成本很高；同時由于β-石竹烯的結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，使化學(xué)合成的工藝繁瑣，產(chǎn)率低， 能耗大。因此尋找一種替代可持續(xù)制備β-石竹烯的工藝路線具有重要意義。
[0004] 利用微生物催化合成化學(xué)品及材料的工藝路線，因其具有原料可再生、綠色環(huán)保、 反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，而逐漸被科學(xué)家所重視。生物體中主要存在兩種天然的代謝途徑進(jìn) 行萜烯類化合物的生物合成，即甲羥戊酸（MVA)途徑和甲基赤蘚糖-4-磷酸（ΜΕΡ)途徑。 MVA途徑主要存在于真核生物、古細(xì)菌和高等植物的細(xì)胞液中，而ΜΕΡ途徑存在于植物的質(zhì) 體、細(xì)菌和藻類中，這兩類代謝途徑的最終產(chǎn)物都是形成異戊二烯的前體物質(zhì)二甲基烯丙 基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP)和異戊烯基焦磷酸（ΙΡΡ)，之后經(jīng)過香葉酯 二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶及萜烯合成酶催化DMAPP和IPP至萜烯類化合物。此前， 還沒有利用微生物發(fā)酵獲得β_石竹烯的相關(guān)報道。本發(fā)明首次介紹了利用微生物發(fā)酵制 備β-石竹烯的新方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明公開了一種微生物催化合成β -石竹烯的方法及能夠合成β -石竹烯的 重組細(xì)胞，利用可再生資源葡萄糖為原料，通過生物催化劑制備萜烯類化合物--β -石竹 烯，建立可持續(xù)發(fā)展的β_石竹烯合成工藝路線。
[0006] 本發(fā)明主要通過基因工程手段對MVA途徑合成萜烯類化合物--β -石竹烯相關(guān) 酶基因在大腸桿菌等通過基因工程技術(shù)構(gòu)建而成的重組細(xì)胞中進(jìn)行外源表達(dá)，最終在重組 細(xì)胞內(nèi)成功建立了一種萜烯類化合物--β-石竹烯的生物合成途徑。
[0007] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種微生物催化合成β -石竹烯的方法，所述方法包括下述步驟：
[0009] Α)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶Α合成β -石竹烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基 因片段：乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶、羥甲基戊二酰輔酶A還 原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異 構(gòu)酶、香葉酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶；
[0010] Β)利用Α)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)， 經(jīng)過分離純化后即可獲得β-石竹烯。
[0011] 其中所述乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:BK006949.2);或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:AAG02438. 2)，金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:AIA26811.1)褐桿菌（Phaeobacter inhibens)(GenBank:AF090074.1)，鉤 蟲貪銅菌（Cupriavidus necator)(GenBank:AEI82514.1)，大腸桿菌（Escherichia coli) (GenBank:ADX49537. 1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:NP_607695. 1);或3)來源于其它生物體，和乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。所述3-羥-3-甲基戊二酰輔 酶 A 合酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:YM4987. 09C); 或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:EEU26497. 1)， 金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:YP_501316. 1)，屎腸 球菌（Enterococcus faecium)(GenBank:AAG02443.1)，魏氏利斯特菌（Listeria welshimeri)(GenBank:YP_849629.1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97584. 1);或3)來源于其它生物體，和3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因 沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0012] 所述輕甲基戊二酰輔酶A還原酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:YLR450W);或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:ESU74184. 1)，金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:AAG02423. 1)，屎腸球菌（Enterococcus faecium) (GenBank:AGS75052. 1)，或釀 胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97583. 1);或 3)來源于其它生物體， 和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白 的核酸序列。所述甲輕戊酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP_013935. 1);或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:EPI38248. 1)，金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:ABR51486. 1)，屎腸球菌（Enterococcus faecium) (GenBank:EFS06266. 1)，或釀 胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:AFV37808. 1);或 3)來源于其它生物體，和 甲羥戊酸激酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0013] 所述甲輕戊酸-5-磷酸激酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP_013947. 1);或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球 菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:WP_016626966.1)，金黃色釀胺葡萄球 菌（Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA27148.1)，屎腸球菌（Enterococcus faecium)(GenBank:WP_016629841.1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:WP_023613167. 1);或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因沒有 明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。所述甲羥戊酸-5-二磷酸 脫竣酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:AY757921. 1);或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選奠腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:YP_005707688. 1)， 屎腸球菌（Enterococcus faecium) (GenBank:EPI24610. 1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97580. 1);或3)來源于其它生物體，和甲輕戊酸-5-二磷酸脫羧酶 基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0014] 所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP_015208. 1);或2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選糞腸球 菌（Enterococcus faecalis)(GenBank:NP_814639.1),金黃色釀胺葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) (GenBank:YP_501084. 1),屎腸球菌（Enterococcus faecium)(GenBank:ERK34722. 1),或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:YP_001128672. 1);或3)來源于其它生物體，和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0015] 所述香葉酯二磷酸合成酶基因來源于：1)大腸桿菌（Escherichia coli)(GenBank:AHY68945.1),或鮑氏不動桿菌（Acinetobacter baumannii) (GenBank:BAN86603. 1);或 2)來源于北美冷杉（Abies grandis) (GenBank:AAN01134. 1)， 芒果（Mangifera indica)(GenBank:AFJ52722.1),丹參（Salvia Miltiorrhiza) (GenBank:AEZ55677. 1),或葡萄（Vitis vinifera) (GenBank:AAR08151. 1);或3)來源于其 它生物體，和香葉酯二磷酸合成酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的 蛋白的核酸序列。
[0016] 所述法呢基焦磷酸合酶基因來源于：1)大腸桿菌（Escherichia col i) (GenBank:AHY68945· 1),或粗糖脈抱菌（Neurospora crassa) (GenBank:CAA65645· 1); 或 2)春蘭（Cymbidium goeringii) (GenBank:AFP19446. 1)，芒果(Mangifera indica) (GenBank:AFJ5272〇. 1)，蘆輿（Asparagus officinalis) (GenBank:AGH33733· 1)，或長囊水 云（Ectocarpus siliculosus) (GenBank:CBN75787. 1);或 3)來源于其它生物體，和法呢基 焦磷酸合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
[0017] 所述β -石竹烯合酶基因來源于：1)小花蔓澤蘭（Mikania micrantha) (GenBank:FJ767894. 1);或 2)新克里多尼亞檀香（Santalum austrocaledonicum) (GenBank:AD087005. 1);或 3)黃花蒿（Artemisia annua)(GenBank:AF472361. 1); 或 4)玉米（Zea mays)(GenBank:ABY79213. 1),苦艾（Artemisia absinthium) (GenBank:BAN81914. 1)，或蘋果（Malus domestica) (GenBank:AGB14624. 1);或 5)來源于 其它生物體，和β_石竹烯合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋 白的核酸序列。
[0018] 本發(fā)明還涉及一種能夠從乙酰輔酶Α合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞 包含下述基因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二 酰輔酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊 烯焦磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶和β-石竹烯合酶。其中，重組 細(xì)胞是由細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或真菌細(xì)胞（如釀酒酵母），或微藻等通過 基因工程技術(shù)構(gòu)建而成的。關(guān)于能夠從乙酰輔酶Α合成β-石竹烯的的重組細(xì)胞的構(gòu)建可 以參見前面的描述。
[0019] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，為在重組細(xì)胞中更好地表達(dá)，上述各種酶的基因序列 或由其衍生的編碼具有相同或相似的功能的蛋白的核酸序列可以根據(jù)所用的宿主細(xì)胞的 密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化。
[0020] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，上述各種酶的基因序列或由其衍生的編碼具有相同 或相似的功能的蛋白的核酸序列可以按照常規(guī)分子克隆技術(shù)克隆到宿主細(xì)胞中。另外，這 些核苷酸片段還可以與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制元件（例如，啟動子，增強(qiáng)子等）可操作地連接。這 些都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，不需要付出創(chuàng)造性的勞動。這些核苷酸片段可操 作性連接可以借助于接頭也可以不用接頭，這可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行適 當(dāng)?shù)倪x擇。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，在選擇適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞構(gòu)建好能夠從乙酰輔酶A合成 β -石竹烯的重組細(xì)胞后，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)技術(shù)常識或經(jīng)過有限次實(shí)驗(yàn)確定合適 的培養(yǎng)條件（例如，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度、攪拌速度、pH值、溶氧率、發(fā)酵時間等參數(shù)），也能夠選 擇合適的誘導(dǎo)劑，確定加入誘導(dǎo)劑的時機(jī)，等等。這不需要付出創(chuàng)造性的勞動。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] 與傳統(tǒng)的制備工藝相比，利用微生物催化合成β_石竹烯的路線具有如下的優(yōu) 勢：（1)由于有專一性的β_石竹烯合成酶，所以生成的產(chǎn)物具有高選擇性，工業(yè)上可以大 大降低分離成本；(2)使用的原料為木質(zhì)纖維素降解獲得的葡萄糖是可再生資源；（3)整個 過程是在常溫常壓下進(jìn)行，能耗低。因此，利用生物催化手段制備β_石竹烯將成為今后 β -石竹烯工業(yè)發(fā)展的必然趨勢。此外，微生物具有生長速度快、發(fā)酵周期短、遺傳背景清 楚、易于工程化操作、可利用廉價的可再生資源等特點(diǎn)，因此微生物作為生物催化劑已成為 近年來生產(chǎn)生物基化學(xué)品的有效手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中：
[0025] 圖1是利用乙酰輔酶Α生物合成萜烯類化合物--β -石竹烯代謝途徑示意圖；
[0026] 圖2是pYJM50質(zhì)粒圖譜；
[0027] 圖3是pYJM51質(zhì)粒圖譜；
[0028] 圖4是pYJM14質(zhì)粒圖譜；
[0029] 圖5是發(fā)酵產(chǎn)物β -石竹烯結(jié)構(gòu)的GC分析圖譜；
[0030] 圖6顯示工程菌YJM51產(chǎn)β -石竹烯的時間曲線；其中工程菌YJM51的β -石竹 烯產(chǎn)量（▲)和細(xì)胞生長（)，當(dāng)工程菌細(xì)胞生長12h開始進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
[0031] 圖7顯示誘導(dǎo)溫度對工程菌β -石竹烯的影響：當(dāng)工程菌YJM51的細(xì)胞0D_達(dá) 0. 6-0. 9時，向培養(yǎng)基中添加終濃度為ImM的IPTG，分別在不同的溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)29h : 25°C (白色），30°C (淺灰色），34°C (灰色），37°C (深灰色）；上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)三次的 平均值；
[0032] 圖8顯示IPTG濃度對工程菌產(chǎn)β -石竹烯的影響：當(dāng)工程菌YJM51的細(xì)胞0D6QQ 達(dá)0. 6-0. 9時，在誘導(dǎo)溫度為30°C，不同終濃度IPTG的條件下誘導(dǎo)66h :0. lmM( )， 0· 25mM( ? )，0· 5mM( ▲ )，lmM( ·);上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)三次的平均值。

【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面參照具體的實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā) 明并不限于這些具體的實(shí)施例。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 通過在大腸桿菌中共同表達(dá)來源于糞腸球菌（Enterococcus faecalis)的乙酰輔 酶A酰基轉(zhuǎn)移酶基因/羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因（mvaE)，3-羥-3-甲基戊二酰輔酶 A合酶基因（mvaS);來源于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的甲輕戊酸激酶基因 (ERG12)，甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因（ERG8)，甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶基因（ERG19)，異 戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因（IDI1);來源于北美冷杉（Abies grandis)的香葉酯二磷酸合成酶 基因（GPPS2);來源于粗糙脈孢菌（Neurospora crassa)的法呢基焦磷酸合酶基因（FPPS) 和來源于黃花蒿（Artemisia annua)的β-石竹烯合酶基因（QHS1),利用葡萄糖降解中間 產(chǎn)物乙酰輔酶Α生物合成異戊二烯衍生物--β-石竹烯。
[0036] 1. 1外源基因的克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0037] 1.1.1外源基因的克隆
[0038] 1. 1. 1. 1糞腸球菌MVA上游代謝途徑基因的克隆
[0039] 來自于奠腸球菌（Enterococcusfaecalis)的 mvaS 基因 （GenBank :EEU26497. 1)， mvaE基因（GenBank:AAG02438. 2)由上海捷瑞公司通過化學(xué)合成方法獲得。之后分別與載 體pGH (購自上海捷瑞生物工程有限公司）連接獲得pGH/mvaS，pGH/mvaE。
[0040] 1· 1· 1. 2GPPS2, ispA 和 QHS1 基因的克隆
[0041] 分別對來自于 Abies grandis GPPS2 基因 （GenBank :ΑΑΝ01134· 1)和 Artemisia annua QHS1 基因 （GenBank :AF543530. 1)序列進(jìn)行稀有密碼子分析（http://www. genscript. com/cgi_bin/tools/rare_codon_analysis)，并將其稀有密石馬子優(yōu)化為 E. coli 偏好的密碼子（ http://www.jcat.de/)。優(yōu)化后的GPP合成酶基因（GPPS2)和β-石竹烯 合酶基因（QHS1)送上海捷瑞公司進(jìn)行化學(xué)合成，并連入pGH載體上分別形成pGH-GPPS2和 pGH-QHSl 載體。
[0042] 以E. coli基因組為模板，利用引物ispA-F(5'-CATGGACGT CATGGACTTTCCGCAGCAACTC-3' ）和 ispA-R(5' -TTATTTATTACG CTGGATGATGTCTCGAGCGG-3' ） PCR 擴(kuò)增 ispA 基因 （GenBank :ΑΗΥ68945· 1)。
[0043] 1. 1. 2表達(dá)載體的構(gòu)建
[0044] 1. 1. 2· lpYJMM 載體構(gòu)建
[0045] 將 pGH-GPPS2 載體與 pACYCDuet-Ι 載體（Novagen)分別用 Ndel 和 Bglll 進(jìn)行雙 酶切，載體與外源片段按摩爾比1:5的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn) 化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · mL-1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從 陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM24(pACY-GPPS2)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0046] 1. 1. 2. 2pYJM26 載體構(gòu)建
[0047] 將 pACY-mvaE-mvaS-ispSPa 載體（pYJM2〇)與 pACY_GPPS2(pYJM24)載體分 別用Ncol和PstI進(jìn)行雙酶切，載體pACY-GPPS2與外源片段mvaE-mvaS按摩爾比1:5 的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，然后涂布加 有34μ g · ml/1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒 PYJM26 (PACY-mVaE-mvaS-GPPS2)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0048] 1. 1. 2. 3pYJM50 載體構(gòu)建
[0049] 將 pGH-QHSl 載體與 pYJM26 (pACY-mvaE-mvaS-GPPS2)載體分別用 Bglll 和 Fse I 進(jìn)行雙酶切，載體pACY-mVaE-mvaS-GPPS2與外源片段QHS1按摩爾比1:5的比例，4°C連接 過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，然后涂布加有34 μ g · ml/1氯霉素 的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM50 (pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHS1)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0050] 1. 1. 2. 4pYJM51 載體構(gòu)建
[0051] 將 ispA 基因片段與 pYJM50(pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHSl)載體分別用 Aat II 和Xho I進(jìn)行雙酶切，載體pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHSl與ispA基因片段按摩爾比1:5 的比例，4°C連接過夜或16°C連接4?6h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，然后涂布加有 34 μ g · ml/1氯霉素的LB固體平板，PCR篩選陽性克隆，從陽性克隆中提取重組質(zhì)粒pYJM51 (pACY-mvaE-mvaS-GPPS2-QHSl-ispA)后，再通過限制性酶切和測序鑒定。
[0052] 1. 1. 2. 5pYJM14 (pTrc-low)載體構(gòu)建
[0053] 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室建立的DNA組裝（Lego DNA assembling)方法構(gòu)建pTrc-low載體： 該方法是一種多個DNA片段在體外通過變性解鏈，退火組裝成重組質(zhì)粒的快速方法，連接 過程中無需任何限制性酶。在構(gòu)建的過程中，通過PCR(simple PCR, overlap extension PCR，long tailed primer PCR)的方法擴(kuò)增出一系列連續(xù)的片段（successive substrate fragments，SFs)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增這些片段時，需要在這些相鄰片段之間存在一段比較長的重疊 部分，將這些片段按等摩爾比例混合后，變性，退火。由于片段和片段之間的重疊區(qū)較長，占 整個片段長度的1/3-2/3,使得變性后的單鏈很容易與相鄰片段形成的單鏈進(jìn)行雜交，最終 形成環(huán)狀，將退火后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，最終可以形成重組質(zhì)粒。pTrc-low載體構(gòu)建過 程如下：
[0054] 分別以pTrchis2B骨架（來自Invitrogen公司）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)基因組為模板，擴(kuò)增出質(zhì)粒pTrchis2B的部分片段SFIBhB，SFB12hB，以及 釀酒酵母MVA途徑的下游4個基因的片段ERG 12 (SF128h 12，SFB12h 12) ;ERG8 (SF128h8， SF819h8) ;ERG19(SF819hl9, SF19IhI) ;IDI(SF19IhI， SFIBhl)，然后以這些片段或 pTrchis2B骨架為模板，通過普通PCR或者重疊 PCR擴(kuò)增出組裝質(zhì)粒的6個SFs片段SF128， SF819, SF19I，SFIB，SFB12, SFB。4 個基因 ERG12, ERG8, ERG19, IDI 之間的 3 個 RBS 序列是 在PCR擴(kuò)增時，通過設(shè)計(jì)引物時引入，使得4個基因由單一的trc(trp-lac promoter)啟動 子作用下進(jìn)行表達(dá)。
[0055] 表1為pTrc-low質(zhì)粒構(gòu)建的過程中片段擴(kuò)增的引物及模板，表2為所用到的引物 序列匯總。
[0056] 表1片段擴(kuò)增的引物與模板
[0057] TablelPCR templates and primers for fragment construction
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 一種微生物催化合成β-石竹烯的方法，其特征在于，所述方法包括下述步驟： Α)構(gòu)建能夠從乙酰輔酶Α合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含下述基因片 段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔酶Α還原酶、 甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶、 香葉酯基焦磷酸合酶、法呢基焦磷酸合酶和β -石竹烯合酶； Β)利用Α)中所述重組細(xì)胞在包含葡萄糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，通過誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，經(jīng)過 分離純化后即可獲得β-石竹烯。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述乙酰輔酶Α酰基轉(zhuǎn)移酶基 因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:BK006949. 2);或 2) 來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:AAG02438. 2)， 金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus)(GenBank:AIA26811. 1)，褐桿菌 (Phaeobacter inhibens) (GenBank: AF090074. 1)，鉤蟲貪銅菌（Cupriavidus necator) (GenBank:AEI82514. 1)，大腸桿菌(Escherichia coli) (GenBank:ADX49537. 1)，或釀膿鏈 球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:NP 607695. 1);或 3)來源于其它生物體，和 乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核 酸序列；所述3-輕-3-甲基戊二酰輔酶A合酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:YM4987. 09C);或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:EEU26497. 1)，金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:YP 501316. 1)，屎腸球菌(Enterococcus faecium) (GenBank:AAG02443. 1)，魏氏 利斯特菌（Listeria welshimeri) (GenBank: YP 849629. 1)，或釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97584. 1);或3)來源于其它生物體，和3_羥_3_甲基戊二酰輔酶 A合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述羥甲基戊二酰輔酶A還原 酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank: YLR450W);或 2) 來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:ESU74184. 1)， 金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus)(GenBank:AAG02423. 1)，屎腸球 菌（Enterococcus faecium)(GenBank:AGS75052. 1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank: AAL97583. 1);或3)來源于其它生物體，和輕甲基戊二酰輔酶A還原 酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列；所述甲羥戊酸 激酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP 013935. 1)； 或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:EPI38248. 1), 金黃色釀胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus)(GenBank:ABR51486. 1)，屎腸球 菌（Enterococcus faecium)(GenBank:EFS06266. 1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:AFV37808. 1);或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸激酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因來 源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP 013947. 1);或2)來源于 其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank: WP_016626966. 1)，金黃色釀 胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:AIA27148.1)，屎腸球菌（Enterococcus faecium)(GenBank:WP_016629841.1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank:WP_023613167. 1);或3)來源于其它生物體，和甲羥戊酸-5-磷酸激酶基因沒有 明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列；所述甲羥戊酸-5-二磷酸 脫駿酶基因來源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:AY757921. 1);或 2)來源于其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:YP 005707688. 1)， 屎腸球菌（Enterococcus faecium) (GenBank:EPI24610. 1)，或釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (GenBank:AAL97580. 1);或3)來源于其它生物體，和甲輕戊酸_5_二磷酸脫羧酶 基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因來 源于：1)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank:NP 015208. 1);或2)來源于 其它細(xì)菌，優(yōu)選幾腸球菌（Enterococcus faecalis) (GenBank:NP 814639. 1)，金黃色釀膿 葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (GenBank:YP 501084. 1)，屎腸球菌(Enterococcus faecium)(GenBank:ERK34722. 1)，或釀胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes) (GenBank: YP 001128672. 1);或3)來源于其它生物體，和異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶基因沒有明 顯的同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述香葉酯二磷酸合成酶基因 來源于：1)大腸桿菌（Escherichia coli) (GenBank: AHY68945. 1)，或鮑氏不動桿菌 (Acinetobacter baumannii) (GenBank:BAN86603. 1);或 2)來源于北美冷杉（Abies grandis)(GenBank:AAN01134. 1,)芒果（Mangifera indica) (GenBank:AFJ52722.1)， 丹參（Salvia Miltiorrhiza) (GenBank:AEZ55677. 1),或葡萄（Vitis vinifera) (GenBank:AAR08151. 1);或3)來源于其它生物體，和香葉酯二磷酸合成酶基因沒有明顯的 同源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述法呢基焦磷酸合酶基因 來源于：1)大腸桿菌（Escherichia coli) (GenBank: AHY68945. 1)，或粗糙脈孢菌 (Neurospora crassa)(GenBank:CAA65645.1)； 或 2)春蘭(Cymbidium goeringii) (GenBank:AFP19446. 1)，芒果（Mangifera indica) (GenBank:AF.T52720. 1)，蘆輿 (Asparagus officinalis) (GenBank: AGH33733. 1)，或長囊水云(Ectocarpus siliculosus) (GenBank:CBN75787. 1);或3)來源于其它生物體，和法呢基焦磷酸合酶基因沒有明顯的同 源性，但編碼具有相同或相似功能的蛋白的核酸序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述β-石竹烯合酶基因來源于： 1)小花蔓澤蘭（Mikania micrantha)(GenBank:FJ767894. 1);或 2)新克里多尼亞檀香 (Santalum austrocaledonicum) (GenBank: AD087005. 1);或 3)黃花蒿（Artemisia annua) (GenBank:AF472361. 1);或 4)玉米（Zea mays) (GenBank:ABY79213. 1)，苦艾（Artemisia absinthium) (GenBank:BAN81914. 1)，或蘋果(Malus domestica) (GenBank:AGB14624. 1)； 或5)來源于其它生物體，和β-石竹烯合酶基因沒有明顯的同源性，但編碼具有相同或相 似功能的蛋白的核酸序列。
9. 一種能夠從乙酰輔酶Α合成β-石竹烯的重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞包含 下述基因片段：乙酰輔酶Α?；D(zhuǎn)移酶、3-羥-3-甲基戊二酰輔酶Α合酶、羥甲基戊二酰輔 酶A還原酶、甲羥戊酸激酶、甲羥戊酸-5-磷酸激酶、甲羥戊酸-5-二磷酸脫羧酶、異戊烯焦 磷酸異構(gòu)酶、香葉酯二磷酸合成酶、法呢基焦磷酸合酶和β -石竹烯合酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的重組細(xì)胞，其特征在于，是由細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，枯草芽 孢桿菌或真菌細(xì)胞（如釀酒酵母），或微藻等通過基因工程技術(shù)構(gòu)建而成的。
【文檔編號】C12P5/00GK104120141SQ201410332423
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】楊建明, 王曉璐, 易曉華, 聶慶娟 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)