專利名稱：納米硒小分子微生物多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用物理分散、修飾的方法處理經(jīng)微生物發(fā)酵、小分子化后獲得的細(xì)菌多糖而制備新的活性更高的多糖衍生物，具體屬于一種納米硒小分子微生物多糖及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，微生物多糖作為一類極具開發(fā)潛力的生物活性物質(zhì)備受世人矚目，從屬 于真菌類的靈芝多糖、香菇多糖到屬于細(xì)菌類的黃原膠、乳酸菌胞外多糖等，已經(jīng)開發(fā)了多種微生物多糖產(chǎn)品。其中，很多多糖類產(chǎn)品被用作食品添加劑、增稠劑、懸浮劑和化工凝固齊U、潤滑劑、絮凝劑等，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、石油、輕工及化工等多個領(lǐng)域，也有一部分生物多糖具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力作用而被用作免疫增強(qiáng)劑、抗氧化、抗癌藥物等應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。然而，天然的微生物多糖一般具有分子量大、難于溶解及生物活性(增強(qiáng)免疫力、抗氧化活性及抗腫瘤活性等)較低等缺陷，極大的限制了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，對微生物多糖進(jìn)行修飾改性以提高其溶解度及生物活性逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)之一，目前國內(nèi)外對微生物多糖的修飾改性主要集中在多糖的小分子化、硫酸酯化、磷酸化、羧甲基化、燒基化、砸化等方面。含硒多糖是一類由無機(jī)硒和多糖通過多種硒化方式結(jié)合形成的具生物活性的復(fù)合物。作為一種新型的有機(jī)硒復(fù)合物，含硒多糖對多種癌癥都有療效，如肺癌，乳腺癌，卵巢癌，惡性胸腺瘤，膽囊癌，食道癌以及膀胱癌等。比起單獨(dú)使用硒或者多糖，含硒多糖的療效更為顯著且毒副作用更小，進(jìn)年來對含硒多糖抑瘤活性的研究已經(jīng)成為大家關(guān)注的焦點(diǎn)。同時(shí)，有科學(xué)家提出其潛在抑制腫瘤細(xì)胞生長的分子機(jī)制可能包括過抗氧化，促進(jìn)癌細(xì)胞調(diào)亡，阻斷癌細(xì)胞周期，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等，含硒多糖在癌癥預(yù)防及治療領(lǐng)域具有更加明顯的優(yōu)勢及更好的應(yīng)用前景。含硒多糖主要有天然存在的含硒多糖、通過培養(yǎng)基中添加硒產(chǎn)生的富集硒多糖、利用化學(xué)方法使多糖被亞硒酸、氯氧化硒等硒化產(chǎn)生硒化多糖以及利用納米技術(shù)獲得納米硒并與多糖復(fù)合形成的納米硒多糖等。其中，納米硒多糖因具備較大的生物學(xué)活性和極低的細(xì)胞毒性而成為目前硒化多糖的研究焦點(diǎn)。納米硒即零價(jià)硒，最初是由我國科學(xué)家以蛋白質(zhì)的酰胺平面為吸引源及分散物質(zhì)而制得的紅色納米顆粒，其生物功能優(yōu)異甚至勝過有機(jī)硒，毒性劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他價(jià)態(tài)的硒，納米硒可殺傷人白血病細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等，具有良好的抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、護(hù)肝保健的作用。綜上所訴，目前已有開發(fā)報(bào)道的多糖很多，其中絕大多數(shù)為真菌多糖，受資源限制較為明顯；具有生物學(xué)活性的細(xì)菌多糖較少，但產(chǎn)量比真菌多糖要高；對微生物多糖進(jìn)行小分子化與修飾改性已經(jīng)成為目前多糖領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，也開發(fā)出一些經(jīng)過修飾的多糖產(chǎn)品，但多存在多糖產(chǎn)量偏低、修飾過程復(fù)雜等缺陷。因此，開發(fā)一種產(chǎn)量高、制備工藝簡便、生物活性較強(qiáng)而毒副作用小的多糖產(chǎn)品是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有較強(qiáng)免疫活性、抗腫瘤活性的納米硒小分子微生物多糖，其生產(chǎn)方法簡單、原料廉價(jià)且無毒；這種納米硒小分子微生物多糖能夠用于制備提高免疫功能、抗腫瘤的藥品及保健品。本發(fā)明提供的一種納米硒小分子微生物多糖(Nano-Se-LREPS)，采用通過包括如下步驟的方法制得
(I)取分子量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成5 7mg/mL (優(yōu)選6mg/mL)的多糖溶液；同時(shí)配制50 70mg/mL (優(yōu)選60mg/mL)的維生素C (簡稱，Vc)溶液和50 70 ii g/mL(優(yōu)選60 u g/mL)的SeO2溶液；(2)取上述LREPS和Vc溶液混合，磁力攪拌25 35min使其充分混合均勻；將SeO2溶液緩慢加入，邊滴邊攪拌；而后加入超純水；所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0.05 0.15 I. 2 2. 8 2 3，優(yōu)選為I : 0. 08
0.12 I. 6 2. 4 2. 5 ；(3)上述體系在超聲狀態(tài)下反應(yīng)5 lOmin，使硒顆粒分散均勻；(4)將反應(yīng)體系用超純水透析24 36h,直到檢測透析外液中沒有硒為止；(5)冷凍干燥，得納米硒小分子微生物多糖產(chǎn)品。所述的LREPS，是將錦雞爾根瘤菌胞外多糖(可按照專利號ZL 200510048129. O制備)經(jīng)過微波福照氧化降解處理(見文獻(xiàn)魏國琴等，小分子Rhizobium sp. N613胞外多糖的制備及其抗腫瘤活性，微生物學(xué)通報(bào)，2011，38 (5) :743-749)，獲得的分子量約為7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖。所述步驟(I)中的LREPS的分子量優(yōu)選為9 13KD。所述的Nano-Se-LREPS可以在制備抗癌藥物中的應(yīng)用，也可以在在制備保健品中的應(yīng)用。本發(fā)明Nano-Se-LREPS經(jīng)過透射電鏡及掃描電鏡檢驗(yàn)，表明其中的硒以納米硒顆粒形態(tài)存在，且均勻分布于多糖之中，多糖的形態(tài)也較修飾前發(fā)生了較大的改變；粒徑分布檢測表明Nano-Se-LREPS中的硒顆粒平均粒徑約為380nm ;動物試驗(yàn)證明Nano-Se-LREPS具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性，對小鼠S180肉瘤抑瘤率可達(dá)到70 %以上(同等劑量下LREPS的抑瘤率為52%左右)，且對動物臟器有明顯的保護(hù)作用。本發(fā)明Nano-Se-LREPS可作為免疫增強(qiáng)劑、抗腫瘤藥物等被開發(fā)應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域。本發(fā)明所采用的檢測方法(I)多糖含量測定苯酚硫酸法。(2)分子量測定凝膠過濾層析法。 (3)硒含量測定比色法。(4)粒徑分布采用激光粒徑分布儀結(jié)合投射電鏡觀察、測定。(5)多糖表觀結(jié)構(gòu)采用掃描電鏡觀察。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明涉及的原料錦雞爾根瘤菌胞外多糖具有生產(chǎn)速度快、質(zhì)量穩(wěn)定及價(jià)格較低等特點(diǎn)，利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的Nano-Se-LREPS硒含量可達(dá)15. 2 16. 4 y g/mg，硒顆粒平均粒徑為380nm左右，多糖收率達(dá)到70%以上。與目前同類技術(shù)產(chǎn)品相比，質(zhì)量穩(wěn)定、成本較低，具有較強(qiáng)的競爭優(yōu)勢。Nano-Se-LREPS具有較高的腫瘤生長抑制率，在較小劑量下即可對小鼠S180肉瘤產(chǎn)生70%以上的抑瘤率，具有誘人的應(yīng)用前景。


圖INano-Se-LREPS透射電鏡照片圖2Nano-Se_LREPS掃描電鏡照片
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I(I)取分子量11. 4KD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時(shí)配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液 (2)取上述LREPS溶液20mL、Vc溶液2mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和成均一體系。(3)將48mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入超純水50mL。(4)上述體系在超聲狀態(tài)下反應(yīng)5min。(5)將反應(yīng)體系用超純水透析30h,檢測透析外液中不再有硒析出。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為16. 2 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為380nm。納米硒小分子微生物多糖經(jīng)過透射電鏡及掃描電鏡檢驗(yàn)，表明其中的硒以納米硒顆粒形態(tài)存在，且均勻分布于多糖之中(見附圖I)，多糖的形態(tài)也較修飾前發(fā)生了較大的改變(見附圖2)。實(shí)施例2(I)取分子量約11. OKD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時(shí)配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液(2)取上述LREPS溶液20mL和Vc溶液I. 6mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和 成均一體系。(3)將32mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入超純水50mL。(4)上述體系在超聲狀態(tài)下反應(yīng)7min。(5)將反應(yīng)體系用超純水透析，直到檢測透析外液中沒有硒為止。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為15. 2 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為370nmo實(shí)施例3(I)取分子量約10. 2KD的LREPS，以超純水配制成6mg/mL的LREPS溶液；同時(shí)配制60mg/mL的Vc溶液和60 u g/mL的SeO2溶液。(2)取上述LREPS溶液IOmL和Vc溶液I. 2mL混合，磁力攪拌30min使其充分混和成均一體系。
(3)將20mL SeO2溶液用真空滴液漏斗逐滴加入上述均一的體系中，邊滴邊攪拌，并加入純水25mL。(4)上述體系在超聲狀態(tài)下反應(yīng)lOmin。(5)將反應(yīng)體系用超純水透析,直到Vc檢測透析外液中沒有硒為止。(6)冷凍干燥，得Nano-Se-LREPS，其硒含量為16. 4 U g/mg,硒顆粒的平均粒徑為380nm。實(shí)施例4有關(guān)Nano-Se-LREPS的抗腫瘤動物試驗(yàn)實(shí)施例如下 (I)建立荷瘤小鼠模型昆明小鼠每組20只，全部為雌性小鼠，隨機(jī)分組。分成I、
3、5、10mg/lg劑量組和陰性、陽性對照組。抽取肝癌S180的腫瘤鼠的腹水，以生理鹽水配制成濃度為IO6個/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，在小鼠左腋皮下接種0. 2mL，建立荷瘤小鼠模型。(2)給藥分別按分組劑量給小鼠腹腔注射Nano-Se-LREPS，給陰性對照組注射生理鹽水，陽性對照組注射環(huán)磷酰胺，連續(xù)注射10天。(3)抑瘤率及臟器指數(shù)測定與計(jì)算處死腫瘤試驗(yàn)小鼠，以實(shí)體瘤重法表征抑瘤率；測定和計(jì)算臟器指數(shù)，結(jié)果見下表。表I.不同劑量Nano-Se-LREPS (硒含量16. 2 ii g/mg)對S180荷瘤小鼠瘤重及臟
器指數(shù)的影響
劑量體重增加值胸腺指數(shù)~脾指數(shù) *抑瘤率
(mg/kg)fe)__(mg/g)(mg/g)__怖里⑶(%)
陰性對照組5.36±0.40 1.67±0.226.18±0.25 1.34±0.08O
陽性對照組(Cy)- 20" 3.87±0.41**~ 0.78士0.07**~6.55±0.12** 0.53士0.08*廠60.4
I4.88士1.00 1.92士 0.07**7.6U0.19* 0.87±0.05*35.1
34.97士0.732.11士 0.158.01±0.12** 0.65 士 0.13* 51.5
Nano-Se-LREPS------
56.10±0.902.24±0.18** 8.43±0.28* 0.39±0.02** 70.9
10 5.90±0.462.10士0.07** 8.02±0.14** 0.38士0.05* 71.權(quán)利要求
1.一種納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，采用通過包括如下步驟的方法制得 (1)取分子量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成5 7mg/mL的多糖溶液；同時(shí)配制50 70mg/mL的維生素C溶液和50 70 y g/mL的SeO2溶液； (2)取上述多糖溶液和維生素C溶液混合，磁力攪拌25 35min使其充分混合均勻；將SeO2溶液緩慢加入，邊加入邊攪拌；而后加入超純水；所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0.05 0.15 12 2. 8 2 3; (3)上述體系在超聲狀態(tài)下反應(yīng)5 IOmin； (4)將反應(yīng)體系用超純水透析，直到檢測透析外液中沒有硒為止； (5)冷凍干燥，得納米硒小分子微生物多糖產(chǎn)品。
2.按照權(quán)利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(I)取分子 量7 16KD的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖，以超純水配制成6mg/mL的多糖溶液；同時(shí)配制60mg/mL的維生素C溶液和60 u g/mL的SeO2溶液。
3.按照權(quán)利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(2)中所述的多糖溶液、維生素C溶液、SeO2溶液及超純水的體積比為I : 0. 08 0. 12 I. 6 2.4 2. 5。
4.按照權(quán)利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖，其特征在于，所述步驟(I)中的小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖的分子量為9 13KD。
5.按照權(quán)利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
6.按照權(quán)利要求I所述的納米硒小分子微生物多糖在制備保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種納米硒小分子微生物多糖，是采用小分子錦雞爾根瘤菌胞外多糖為原料，經(jīng)均勻分散后與二氧化硒及還原劑共同作用，在超聲條件下制備而成。具體生產(chǎn)方法配制合適濃度的小分子細(xì)菌多糖溶液，小分子錦雞爾根瘤菌多糖與維生素C混合均勻，混合體系中緩慢滴加二氧化硒，超聲分散反應(yīng)，透析，冷凍干燥。通過該制備工藝制備的納米硒小分子微生物多糖產(chǎn)品，其硒含量可達(dá)15.2～16.4μg/mg，硒顆粒平均粒徑為380nm左右，多糖收率達(dá)到70％以上。經(jīng)小鼠試驗(yàn)表明，該納米硒小分子多糖具有良好的抗癌活性，可在制備抗癌藥物、保健品中應(yīng)用。
文檔編號A23L1/09GK102643361SQ20121012462
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者呂利華, 趙良啟, 魏國琴 申請人:山西大學(xué)