一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液及其制備方法
【專利摘要】一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液及其制備方法，屬于類球紅細(xì)菌提取液【技術(shù)領(lǐng)域】。提取液中包括類胡蘿卜素或輔酶Q10或超氧化物歧化酶(SOD)包括以下步驟：菌種活化、類球紅細(xì)菌發(fā)酵、類球紅細(xì)菌離心分離、類球紅細(xì)菌提取液制備。本發(fā)明制備的類球紅細(xì)菌提取液具有開創(chuàng)性的意義。
【專利說明】一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液的制備方法，屬于類球紅細(xì) 菌提取液【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 類胡蘿卜素是維生素A原，具有清除自由基、抗氧化、增強(qiáng)免疫力、防癌等功能，作 為著色劑和功能成分廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等，然而化學(xué)合成類胡蘿卜素因毒性 其應(yīng)用受到限制。絕大多數(shù)市售類胡蘿卜素源于化學(xué)合成，不能滿足消費(fèi)者對天然類胡蘿 卜素的需求，因此研究焦點(diǎn)已從化學(xué)合成轉(zhuǎn)移到生物合成。微生物生物合成商業(yè)化生物活 性色素類胡蘿卜素因其高效和易于操控受到廣泛關(guān)注。
[0003] 輔酶Q10是一種脂溶性的類維生素物質(zhì)，廣泛存在于生物體細(xì)胞的線粒體上，主 要結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，構(gòu)成呼吸鏈中的重要遞氫體。具有清除自由基、維持細(xì)胞膜的通透 性和提1?機(jī)體自身免疫力的功能，在臨床醫(yī)藥、營養(yǎng)保健品及化妝品等方面具有廣闊的應(yīng) 用前景。
[0004] 超氧化物歧化酶（S0D)是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類金屬酶，它能催化超氧陰離 子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，從而能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基，是生物體重要的細(xì)胞 防御系統(tǒng)之一，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射和消炎作用。S0D已被開發(fā)成藥品、飲料、 保健品、化妝品等的添加劑；細(xì)菌S0D的提取常被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、食品領(lǐng)域和化妝品領(lǐng)域 中。目前，人們已從豬、牛、馬等動物紅細(xì)胞、肌肉、肝臟組織以及植物和微生物中分離純化 出S0D ;其中利用微生物生產(chǎn)S0D具有成本低、周期短、產(chǎn)品純度高、適用于規(guī)?；a(chǎn)的特 點(diǎn)，且所得產(chǎn)品安全性高。因此，近年來從微生物中提取S0D受到國內(nèi)外許多學(xué)者的重視。
[0005] 當(dāng)前在國外，光合細(xì)菌已在保健食品中應(yīng)用，在國內(nèi)光合細(xì)菌沼澤紅假單胞菌已 獲準(zhǔn)用于飼料添加劑?？梢姽夂霞?xì)菌在保健食品和藥品中的應(yīng)用已具有一定基礎(chǔ)。類球紅 細(xì)菌（Rhodobacter Sphaeroides)是一種光合細(xì)菌，屬于細(xì)菌域中紫色細(xì)菌群的α亞群， 具有廣泛的代謝方式，可以在多種生長條件下生長；大量研究文獻(xiàn)表明，類球紅細(xì)菌已經(jīng)成 為一種非常有工業(yè)化開發(fā)潛力的微生物。有文獻(xiàn)報道類球紅細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素、輔 酶Q10和超氧化物歧化酶（S0D)。
[0006] 納米技術(shù)（nanotechnology)是在80年代末誕生并正在蓬勃發(fā)展的一種高新科 技，是用單個原子、分子制造物質(zhì)的科學(xué)技術(shù)，研究結(jié)構(gòu)尺寸在〇. 1至1〇〇納米范圍內(nèi)材料 的性質(zhì)和應(yīng)用。納米技術(shù)具備促進(jìn)食品傳統(tǒng)工業(yè)快速發(fā)展的巨大潛力，它可以幫助人類在 納米尺度范圍內(nèi)認(rèn)識和改造自然，即在生產(chǎn)過程中直接操縱原子、分子的排布，從而制造出 具有特定功能的新產(chǎn)品。由于其尺寸上的微觀性，納米材料具有與傳統(tǒng)材料不同的表面效 應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于原料化工、食品、農(nóng)業(yè)、 紡織、電子電器、機(jī)械、醫(yī)學(xué)等眾多領(lǐng)域。納米技術(shù)已經(jīng)迅速發(fā)展成為21世紀(jì)三大支柱科學(xué) 領(lǐng)域之一 [14]，納米技術(shù)必將引發(fā)一場新的工業(yè)革命。
[0007] 超聲波提取方法是利用超聲波的機(jī)械破碎和空化作用，使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞更容 易釋放內(nèi)容物而增大傳質(zhì)速率；因此超聲波浸提具有提取時間短、提取率1?、簡單1?效等特 點(diǎn)，而且超聲波技術(shù)設(shè)備成本低廉，操作簡單，有利于在工業(yè)上推廣。超聲波作用于含酶溶 液時，能產(chǎn)生空化、振蕩等作用，并可使酶分子構(gòu)象及催化部位微環(huán)境發(fā)生變化，深刻地影 響催化活性；人們對超聲波影響酶催化過程新的深入認(rèn)識，將對酶化工領(lǐng)域產(chǎn)生積極的影 響，其結(jié)果有可能創(chuàng)造一種安全、價廉和靠外力場強(qiáng)化酶催化過程的新方法，給酶法生產(chǎn)工 業(yè)化帶來新的飛躍。Gu等研究表明酸溶法提取類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素效果較好。
[0008] 有關(guān)將納米技術(shù)應(yīng)用于類球紅細(xì)菌提取液制備方面的文獻(xiàn)未見報道。本發(fā)明首次 報道一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液及其制備方法，為后續(xù)將該提取液研究開發(fā) 為功能（保健）食品奠定堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明人正從事食品科學(xué)與工程學(xué)科的教學(xué)科研工 作，該發(fā)明同樣可以圍繞該學(xué)科開展研究開發(fā)工作，有利于學(xué)科專業(yè)建設(shè)和人才培養(yǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種類球紅細(xì)菌提取液及其制備方法。
[0010] 一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液，其特征在于，提取液中包括類胡蘿卜 素或輔酶Q10或超氧化物歧化酶（S0D)。
[0011] 上述一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0012] ⑴菌種活化
[0013] 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%，酵 母粉0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2%，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121°C高壓 蒸汽滅菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于 28-37 °C 培養(yǎng)，2-7d ;
[0014] 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121°C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ;
[0015] (2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵
[0016] ①種子培養(yǎng)：
[0017] 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0.5-5%，酵母粉0.5-5%，氯化鈉 0· 5-2%，pH = 7-8 ;并于 121°C 高壓蒸汽滅菌 15-30min ;
[0018] 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛 有（優(yōu)選250mL三角瓶中含有20mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于 28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子；
[0019] 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量再接種于滅菌的種子培養(yǎng) 基中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到活化的液體種子；
[0020] ②發(fā)酵：
[0021] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉0.4-5%，葡萄糖1-10%，硫酸銨0.5-5%，酵母 粉0.5-5 %，磷酸氫二鉀0.05-0. 15 %，磷酸二氫鉀0.03-0. 10%，pH = 7-8,生長因子 溶液0.5-2%，并于1211：高壓蒸汽滅菌15-3〇1^11，其中生長因子溶液配方 ：維生素 B10. 05-0. 2%，煙酰胺（VPP)O. 05-0. 2%，生物素0. 001-0. 002%，生長因子過濾除菌；
[0022] 按照5-10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三 角瓶中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液；
[0023] (3)類球紅細(xì)菌離心分離
[0024] 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清， 再用蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì) 菌濕菌體；
[0025] (4)制備類球紅細(xì)菌提取液
[0026] 研磨法
[0027] 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，按菌體/丙酮的質(zhì)量比為1 :5_1 :30 添加丙酮，震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì)量比為（0.5-2) :(2-5);
[0028] 或超聲波法
[0029] 取菌體按菌體/丙酮的質(zhì)量比為1 :5_1 :30添加丙酮，震蕩混勻后用冰浴超聲波 粉碎儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時 間 10-30min，最后震蕩 20-60min ;
[0030] 或酸溶輔助超聲波法
[0031] 取菌體按菌體/鹽酸溶液的質(zhì)量比為1 :5-1 :20添加 l-4mol/L鹽酸，于20-30°C 處理10-30min，然后在6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體；菌體再按菌體/丙酮質(zhì)量 比為1 :5-1 :30添加丙酮，震蕩20-40min ;然后進(jìn)行冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/ 間隔時間〇. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間10-30min ;最后震蕩20-60min ;
[0032] 類胡蘿卜素提取液收集：采用不同破壁提取方法得到的類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素溶 液后，于6000-20000rpm離心10-60min，收集上清液即為類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液。
[0033] 上述一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌S0D提取液的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟：
[0034] (1)菌種活化
[0035] 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%，酵 母粉0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2%，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121°C高壓 蒸汽滅菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于 28-37 °C 培養(yǎng)，2-7d ;
[0036] 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121°C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ;
[0037] (2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵
[0038] ①種子培養(yǎng)：
[0039] 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0.5-5%，酵母粉0.5-5%，氯化鈉 0· 5-2%，pH = 7-8 ;并于 121°C 高壓蒸汽滅菌 15-30min ;
[0040] 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛 有（優(yōu)選250mL三角瓶中含有20mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于 28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子；
[0041] 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量再接種于滅菌的種子培養(yǎng) 基中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到活化的液體種子；
[0042] ②發(fā)酵：
[0043] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉0. 1-6 %，胰蛋白胨0. 1-5 %，磷酸氫二鉀 0. 05-0. 15 %，磷酸二氫鉀0. 03-0. 10 %，硫酸鎂0. 1-1 %，無水氯化鈣0. 002-0. 02 %，硫酸 亞鐵0.001-0. 01 %，EDTA0. 001-0. 01 %，pH = 7-8,生長因子溶液0.5-2%，微量元素溶液 0. 5-2 %，微量元素溶液配方：硼酸0. 06-0. 6 %，硫酸錳0. 08-0. 3 %，鑰酸鈉0. 02-0. 1 %，硫 酸鋅0.008-0.05%，硫酸銅0.001-0.01%;并于1211：高壓蒸汽滅菌15-301^11，其中生長因 子溶液配方：維生素 B10. 05-0. 2 %，煙酰胺（VPP) 0. 05-0. 2 %，生物素0. 001-0. 002 %，對氨 基苯甲酸0. 05-0. 2%，生長因子過濾除菌；上述為質(zhì)量百分含量；
[0044] 按照3-10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三 角瓶中，于25-37°C，100-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)16-48h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液；
[0045] (3)類球紅細(xì)菌離心分離
[0046] 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清， 再用蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì) 菌濕菌體；
[0047] (4)制備類球紅細(xì)菌提取液
[0048] 研磨法
[0049] 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，按菌體/磷酸緩沖液質(zhì)量比為1 : 5-1 :30添加 pH6-9磷酸緩沖液震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì)量比為（0. 5-2): (2-5)；
[0050] 或超聲波法
[0051] 取菌體按菌體/磷酸緩沖液質(zhì)量比為1 :5-1 :30添加 pH6-9磷酸緩沖液，震蕩混勻 后用冰浴超聲波粉碎儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min， 冰浴超聲波總時間10_30min，最后震蕩20-60min ;
[0052] 或酶法輔助超聲波法
[0053] 采用溶菌酶和磷酸緩沖液對菌體進(jìn)行酶解，溶菌酶添加量為0.05-lmg溶菌 酶/g菌體，菌體/磷酸緩沖液的質(zhì)量比為1 : 5-1 : 30,酶解溫度25-50°C，酶解pH值 5-9,酶解時間30-150min ;然后進(jìn)行冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/間隔時間 0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間10-30min ;最后震蕩20-60min。或納米研磨法
[0054] 將類球紅細(xì)菌濕菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1_8°C下震磨6-10h，然后按菌 體/磷酸緩沖液質(zhì)量比1 : 5-1 : 30加入pH6-9的磷酸緩沖液，震蕩20-60min。
[0055] SOD提取液收集
[0056] 將采用不同破壁提取方法提取菌體中S0D后，于6000-20000rpm離心10-60min，收 集上清液即為S0D提取液。
[0057] 上述一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌輔酶Q10提取液的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0058] (1)菌種活化
[0059] 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%，酵 母粉0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2%，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121°C高壓 蒸汽滅菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于 28-37 °C 培養(yǎng)，2-7d ;
[0060] 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121°C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ;
[0061] (2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵
[0062] ①種子培養(yǎng)：
[0063] 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0.5-5%，酵母粉0.5-5%，氯化鈉 0· 5-2%，pH = 7-8 ;并于 121°C 高壓蒸汽滅菌 15-30min ;
[0064] 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛 有（優(yōu)選250mL三角瓶中含有20mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于 28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子；
[0065] 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量接種于滅菌的種子培養(yǎng)基 中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-42h，得到活化的液體種子；
[0066] ②發(fā)酵：
[0067] 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0. 1-10%，牛肉膏0.05-5%，磷酸氫二鉀0.05-0. 15%， 磷酸二氫鉀0.03-0. 10 %，無水氯化鈣0.002-0. 02%，EDTA0. 001-0. 01%，生長因子溶液 0. 5-2%，微量元素溶液0. 5-2%，pH = 7-8 ;微量元素溶液配方：硫酸錳0. 08-0. 3 % ;并 于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min，其中生長因子溶液配方：維生素 B10.05-0.2%，煙酰胺 (VPP)O. 05-0. 2%，生物素0. 001-0. 002%，對氨基苯甲酸0. 05-0. 2%，生長因子過濾除菌；
[0068] 按照3-15%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三 角瓶中，于28-37°C，100_270r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-60h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液；
[0069] (3)類球紅細(xì)菌離心分離
[0070] 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清， 再用蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì) 菌濕菌體；
[0071] (4)制備類球紅細(xì)菌提取液
[0072] 研磨法：
[0073] 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，按菌體/甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比為 1 :5-1 :35添加甲醇-氯仿（體積比為1 : 2)溶液，震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì) 量比（0. 5-2) :(2-5);
[0074] 或超聲波法：
[0075] 取菌體按菌體/甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比為1 :5_1 :35添加甲醇-氯仿（體積比 為1 : 2)溶液，震蕩混勻后用超聲波粉碎儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/間隔時間 0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間5-30min ;最后震蕩20-60min ;
[0076] 或酶法輔助超聲波法：
[0077] 采用溶菌酶和磷酸緩沖液對菌體進(jìn)行酶解，溶菌酶添加量為0. 05-lmg溶菌酶/g 濕菌體，菌體/磷酸緩沖液的質(zhì)量比1 : 5-1 : 35,酶解溫度25-50°C，酶解pH值5-9,酶 解時間30-180min ;酶解后于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，按菌體/甲醇-氯仿 溶液質(zhì)量比為1 : 5-1 : 35添加甲醇-氯仿（體積比為1 : 2)溶液懸浮菌體；然后進(jìn)行 冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間 10_30min ;最后震蕩 20_60min ;
[0078] 或納米研磨法：
[0079] 將類球紅細(xì)菌濕菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1_8°C下震磨5_12h，然后按菌 體/甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比1 : 5-1 : 35加入甲醇-氯仿（1 : 2)溶液，震蕩20-60min;
[0080] 輔酶Q10提取液收集
[0081] 采用不同破壁提取方法提取菌體中輔酶Q10后，于6000-20000rpm離心10-60min， 取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于20 - 55°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸法，將上清液濃縮干，按菌體/無水乙醇質(zhì) 量比1 : 5-1 : 35加入無水乙醇溶解樣品，得到輔酶Q10提取液。
[0082] 本專利發(fā)明了一種以蘋果酸鈉和胰蛋白胨為主要原料，或以葡萄糖和牛肉膏為主 要原料，生產(chǎn)具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌S0D或輔酶Q10提取液的方法，采用的菌株是一 株具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌（Rhodobacter Sphaeroides)。本發(fā)明首次報道將類球紅 細(xì)菌經(jīng)高能納米沖擊磨制備為類球紅細(xì)菌S0D或輔酶Q10提取液，經(jīng)體外抗氧化實驗結(jié)果 表明該類球紅細(xì)菌提取液具有抗氧化活性，并介紹其制備方法。由于其尺寸上的微觀性，納 米材料具有與傳統(tǒng)材料不同的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)及宏觀量子隧道效應(yīng)， 因此類球紅細(xì)菌經(jīng)高能納米沖擊磨破壁制備的提取液，其生物活性物質(zhì)S0D或輔酶Q10便 于釋放出來，有利于其體外和體內(nèi)抗氧化作用的發(fā)揮。采用高能納米沖擊磨制備類球紅細(xì) 菌S0D或輔酶Q10提取液容易實現(xiàn)擴(kuò)大生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化，將其開發(fā)為功能（保?。┦称酚欣?于人體健康。
[0083] 本專利發(fā)明了一種用蘋果酸鈉、葡萄糖、硫酸銨和酵母浸粉為主要原料，生產(chǎn)具有 抗氧化活性的類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液的方法，采用的菌株是一株具有抗氧化活性的 類球紅細(xì)菌（Rhodobacter Sphaeroides)。本發(fā)明首次報道具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌 類胡蘿卜素提取液的制備方法，將類球紅細(xì)菌經(jīng)酸溶輔助超聲波法破壁制備類球紅細(xì)菌類 胡蘿卜素提取液，經(jīng)體外抗氧化實驗結(jié)果表明該類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液具有抗氧化 活性，并介紹其制備方法。采用酸溶輔助超聲波法對類球紅細(xì)菌進(jìn)行細(xì)胞破壁，具有設(shè)備簡 單、操作易行的特點(diǎn)。類球紅細(xì)菌經(jīng)酸溶輔助超聲波法破壁制備的提取液，其生物活性物質(zhì) 類胡蘿卜素便于釋放出來，有利于其體外和體內(nèi)抗氧化作用的發(fā)揮，將其開發(fā)為功能（保 ?。┦称酚欣谌梭w健康。

【具體實施方式】
[0084] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0085] 實施例1
[0086] 類胡蘿卜素的含量計算
[0087] 將提取好含類胡蘿卜素的丙酮溶液在475nm測吸光度；參照惠伯棣等[惠伯棣， 李京.紅和黃瓤西瓜中類胡蘿卜素含量和組成比較[J].食品科學(xué)，2008, 29 (12) :587-591.
[0088] ]方法計算類胡蘿卜素含量。計算公式如下：
[0089] 類續(xù)夢卜素含量(mg/i〇〇g Tlf》=Axys< ：!00/_!
[0090] A - 480nm處的吸光度值；
[0091] y一樣品溶液的體積（mL);
[0092] -吸光系數(shù)，定義為在1cm光程長的比色杯中1% (W/V)濃度溶質(zhì)的理論吸收 值，在此采用值為2500。
[0093] 類球紅細(xì)菌中類胡蘿卜素清除DPPH自由基能力的測定[劉薇，劉彥霞， 趙建，等.DPPH法測定保健食品脂溶性成份抗氧化能力的可行性研究[J].中國 釀造，2011,04:86-89.和 Hongfei Fu，Bijun Xie，Shaojun Ma，Xinrong Zhu, Gang Fan,Siyi Pan. Evaluation of antioxidant activities of principal carotenoids available in water spinach(Ipomoea aquatica). Journal of Food Composition and Analysis, 2011, 24:288 - 297]
[0094] 1.配制試劑
[0095] 丙酮環(huán)己烷混合液：用量筒量取lOmL丙酮和15mL環(huán)己烷，于50mlL磨砂口三角瓶 中混合均勻，蓋蓋保存，待用，現(xiàn)用現(xiàn)配。
[0096] DPPH溶液（120ymol/L):稱取DPPH0. 00118g加10mL丙酮溶解，再用環(huán)己烷溶液 定容于25mL混合均勻，即為120 μ mol/L DPPH溶液。
[0097] Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲備液（0. 2g/L):稱取Trolox標(biāo)準(zhǔn)物0. 0050g，用10mL丙酮溶解，再 用環(huán)己烷稀釋定容于25mL混合均勻，即為0. 2g/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲備液。
[0098] 2測定方法
[0099] 按照表1所列順序依次向試管中加入試劑并按表中規(guī)定的條件操作。
[0100] 表1樣品及Trolox的測定方法設(shè)計
[0101]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌提取液，其特征在于，提取液中包括類胡蘿卜素 或輔酶Q10或超氧化物歧化酶（SOD)。
2. -種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液的制備方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 菌種活化 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5 %，胰蛋白胨0. 5-5 %，酵母粉 0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2 %，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121 °C高壓蒸汽滅 菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于28-37°C 培養(yǎng)，2-7d ; 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121 °C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ; (2) 類球紅細(xì)菌發(fā)酵 ① 種子培養(yǎng)： 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5 %，胰蛋白胨0. 5-5 %，酵母粉0. 5-5%，氯化鈉0. 5-2%， pH = 7-8 ;并于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min ; 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛有（優(yōu) 選250mL三角瓶中含有20mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于28-37°C， 150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子； 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量再接種于滅菌的種子培養(yǎng)基 中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到活化的液體種子； ② 發(fā)酵： 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉〇. 4-5 %，葡萄糖1-10 %，硫酸銨0. 5-5 %，酵母粉0. 5-5 %， 磷酸氫二鉀〇· 05-0. 15 %，磷酸二氫鉀0· 03-0. 10 %，pH = 7-8,生長因子溶液0· 5-2 %，并 于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min，其中生長因子溶液配方：維生素 B10.05-0. 2%，煙酰胺 (VPP)O. 05-0. 2%，生物素0. 001-0. 002%，生長因子過濾除菌； 按照5-10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶 中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液； (3) 類球紅細(xì)菌離心分離 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清，再用 蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì)菌濕 菌體； (4) 制備類球紅細(xì)菌提取液 研磨法 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，按菌體/丙酮的質(zhì)量比為1 :5-1 :30添加 丙酮，震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì)量比為（0.5-2) :(2-5); 或超聲波法 取菌體按菌體/丙酮的質(zhì)量比為1 :5_1 :30添加丙酮，震蕩混勻后用冰浴超聲波粉碎 儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間 10-30min，最后震蕩20-60min ;或酸溶輔助超聲波法 取菌體按菌體/鹽酸溶液質(zhì)量比為1 :5_1 :20添加 l-4mol/L鹽酸，于20-30°C處理 10-30min，然后在6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體；菌體再按菌體/丙酮質(zhì)量比為 1 :5-1 :30添加丙酮，震蕩20-40min ;然后進(jìn)行冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/間隔 時間0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間10-30min ;最后震蕩20-60min ; 類胡蘿卜素提取液收集：采用不同破壁提取方法得到的類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素溶液 后，于6000-20000rpm離心10-60min，收集上清液即為類球紅細(xì)菌類胡蘿卜素提取液。
3. -種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌SOD提取液的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 菌種活化 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%，酵母粉 0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2 %，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121 °C高壓蒸汽滅 菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于28-37°C 培養(yǎng)，2-7d ; 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121 °C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ; (2) 類球紅細(xì)菌發(fā)酵 ① 種子培養(yǎng)： 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5 %，胰蛋白胨0. 5-5 %，酵母粉0. 5-5%，氯化鈉0. 5-2%， pH = 7-8 ;并于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min ; 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛有種子培 養(yǎng)基液體的三角瓶中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子； 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量再接種于滅菌的種子培養(yǎng)基 中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到活化的液體種子； ② 發(fā)酵： 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉〇. 1-6%，胰蛋白胨0. 1-5%，磷酸氫二鉀0.05-0. 15%， 磷酸二氫鉀〇. 03-0. 10 %，硫酸鎂0. 1-1 %，無水氯化鈣0. 002-0. 02 %，硫酸亞鐵 0· 001-0. 01 %，EDTA0. 001-0. 01 %，pH = 7-8,生長因子溶液 0· 5-2 %，微量元素溶液 0. 5-2 %，微量元素溶液配方：硼酸0. 06-0. 6 %，硫酸錳0. 08-0. 3 %，鑰酸鈉0. 02-0. 1 %，硫 酸鋅0.008-0.05%，硫酸銅0.001-0.01%;并于1211：高壓蒸汽滅菌15-301^11，其中生長因 子溶液配方：維生素 B10. 05-0. 2 %，煙酰胺（VPP) 0. 05-0. 2 %，生物素0. 001-0. 002 %，對氨 基苯甲酸0. 05-0. 2 %，生長因子過濾除菌； 按照3-10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶 中，于25-37°C，100_200r/min搖床振蕩培養(yǎng)16-48h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液； (3) 類球紅細(xì)菌離心分離 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清，再用 蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì)菌濕 菌體； (4)制備類球紅細(xì)菌提取液 研磨法 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，再按菌體/磷酸緩沖液質(zhì)量比為 1 : 5-1 : 30添加 pH6-9磷酸緩沖液震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì)量比為 (0. 5-2) ：(2-5)； 或超聲波法 取菌體按菌體/磷酸緩沖液質(zhì)量比為1 : 5-1 : 30添加 pH6-9磷酸緩沖液，震蕩混勻 后用冰浴超聲波粉碎儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min， 冰浴超聲波總時間10_30min，最后震蕩20-60min ; 或酶法輔助超聲波法 采用溶菌酶和磷酸緩沖液對菌體進(jìn)行酶解，溶菌酶添加量為〇. 〇5-lmg溶菌酶/ g菌體，菌體/磷酸緩沖液質(zhì)量比為1 : 5-1 : 30,酶解溫度25-50 °C，酶解pH值 5-9,酶解時間30-150min ;然后進(jìn)行冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/間隔時間 0· 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間10-30min ;最后震蕩20-60min ; 或納米研磨法 將類球紅細(xì)菌濕菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1-8°C下震磨6-10h，然后按菌體/ 磷酸緩沖液質(zhì)量比1 : 5-1 : 30加入pH6-9的磷酸緩沖液，震蕩20-60min; SOD提取液收集 將采用不同破壁提取方法提取菌體中SOD后，于6000-20000rpm離心10-60min，收集上 清液即為SOD提取液。
4. 一種具有抗氧化活性的類球紅細(xì)菌輔酶Q10提取液的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟： (1) 菌種活化 配制固體培養(yǎng)基（質(zhì)量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%，酵母粉 0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %，瓊脂1. 5-2 %，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121 °C高壓蒸汽滅 菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細(xì)菌進(jìn)行平板劃線；將平板置于28-37°C 培養(yǎng)，2-7d ; 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于121 °C高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細(xì)菌單菌落進(jìn)行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C培養(yǎng)，2-7d ; (2) 類球紅細(xì)菌發(fā)酵 ①種子培養(yǎng)： 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5 %，胰蛋白胨0. 5-5 %，酵母粉0. 5-5 %，氯化鈉0. 5-2 %， pH = 7-8 ;并于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min ; 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細(xì)菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛有（優(yōu) 選250mL三角瓶中含有20mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于28-37°C， 150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子； 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量接種于滅菌的種子培養(yǎng)基中， 于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-42h，得到活化的液體種子； ②發(fā)酵： 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖0. 1-10 %，牛肉膏0. 05-5 %，磷酸氫二鉀0. 05-0. 15 %，磷 酸二氫鉀0. 03-0. 10%，無水氯化鈣0. 002-0. 02%，EDTA0. 001-0. 01 %，生長因子溶液 0. 5-2 %，微量元素溶液0. 5-2%，pH = 7-8 ;微量元素溶液配方：硫酸錳0.08-0. 3 % ;并 于121°C高壓蒸汽滅菌15-30min，其中生長因子溶液配方：維生素 B10.05-0.2%，煙酰胺 (VPP)O. 05-0. 2%，生物素0. 001-0. 002%，對氨基苯甲酸0. 05-0. 2%，生長因子過濾除菌； 按照3-15%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶 中，于28-37°C，100_270r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-60h，得類球紅細(xì)菌發(fā)酵液； (3) 類球紅細(xì)菌離心分離 取步驟（2)類球紅細(xì)菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清，再用 蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細(xì)菌濕 菌體； (4) 制備類球紅細(xì)菌提取液 研磨法： 取菌體加石英砂研磨10_30min，研磨成勻漿，按菌體/甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比為1 : 5-1 :35添加甲醇-氯仿（體積比為1 : 2)溶液震蕩20-60min，其中菌體：石英砂的質(zhì)量比 (0. 5-2) ：(2-5)； 或超聲波法： 取菌體按菌體/甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比為1 :5_1 :35添加甲醇-氯仿溶液，其中甲 醇-氯仿體積比為1 : 2,震蕩混勻后用超聲波粉碎儀進(jìn)行破壁處理：振幅20-60%、工作/ 間隔時間〇. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總時間5-30min ;最后震蕩20-60min ; 或酶法輔助超聲波法： 采用溶菌酶和磷酸緩沖液對菌體進(jìn)行酶解，溶菌酶添加量為〇. 〇5-lmg溶菌酶/g菌體， 按菌體/磷酸緩沖液的質(zhì)量比1 : 5-1 : 35,酶解溫度25-50°C，酶解pH值5-9,酶解時間 30-180min ;酶解后于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體；按菌體/甲醇-氯仿溶液質(zhì) 量比為1 : 5-1 : 35添加甲醇-氯仿溶液懸浮菌體，其中甲醇-氯仿體積比為1 : 2;然 后進(jìn)行冰浴超聲波處理：振幅20-60%、工作/間隔時間0. 5-2min/0. 5-2min，冰浴超聲波總 時間10-30min ;最后震蕩20-60min ; 或納米研磨法： 將類球紅細(xì)菌濕菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1-8°C下震磨5-12h，然后按菌體/ 甲醇-氯仿溶液質(zhì)量比1 : 5-1 : 35加入甲醇-氯仿溶液，其中甲醇-氯仿體積比為1 : 2,震蕩 20_60min ; 輔酶Q10提取液收集 采用不同破壁提取方法提取菌體中輔酶Q10后，于6000-20000rpm離心10-60min，取上 清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于20 - 55°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸法，將上清液濃縮干，按菌體/無水乙醇質(zhì)量比 為1 : 5-1 : 35添加1 : 5-1 : 35加入無水乙醇溶解樣品，得到輔酶Q10提取液。
【文檔編號】C12R1/01GK104099395SQ201410332409
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月11日
【發(fā)明者】李祖明, 安君, 惠博棣, 高麗萍, 白志輝, 王棟, 楊衛(wèi)東 申請人:北京聯(lián)合大學(xué)