本發(fā)明涉及獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雞新城疫病毒滅活疫苗制備方法。
背景技術(shù)：
雞新城疫病毒在分類(lèi)上是屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒屬(Paramyxovirus)。成熟的病毒粒子近圓形，多數(shù)呈蝌蚪狀，直徑為120-300nm。具有囊膜，內(nèi)含有一長(zhǎng)螺旋狀核衣殼，直徑17-18nm，囊膜外有長(zhǎng)約8-12nm的糖蛋白(HN和F)纖突。螺旋形核衣殼是由一個(gè)與蛋白相聯(lián)結(jié)的單股RNA所形成，具有RNA聚合酶活性，它被一個(gè)雙層脂質(zhì)膜所包裹，脂質(zhì)膜內(nèi)襯有一層特殊的M蛋白，而脂質(zhì)膜的外層又被具有纖突的糖蛋白所覆蓋，使外形呈花穗狀。
現(xiàn)有技術(shù)中，控制雞新城疫病毒發(fā)病的主要手段是接種滅活全病毒疫苗，通過(guò)免疫接種來(lái)控制典型的雞呼腸孤病毒感染，但目前滅活疫苗多為油包水型，注射時(shí)阻力大，不易吸收，并具有一定的毒副作用。因此有必要開(kāi)發(fā)一種劑型更合理，更易吸收同時(shí)具有更好的免疫應(yīng)答效應(yīng)的疫苗產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種雞新城疫病毒滅活疫苗制備方法。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一種雞新城疫病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)制備原代CEF細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)接種雞新城疫病毒。
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80％以上病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液。
3)測(cè)定病毒效價(jià)，病毒的效價(jià)應(yīng)≥106.5TCID50/0.1mL。
4)將檢驗(yàn)合格的細(xì)胞毒液置于無(wú)菌容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理，加入甲醛溶液充分搖勻，甲醛溶液的加入量為滅活溶液體積的0.5‰-2‰，控制溫度在37℃滅活12-48h，轉(zhuǎn)速為180r/min。
5)將滅活的病毒進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，確定最佳的滅活時(shí)間及甲醛濃度。
6)將滅活的病毒液與進(jìn)口佐劑MONTANIDETMISA 206VG按1:1比例(w/w)或75:87比例(v/v)混勻，利用ATS Engineering Inc公司的AH100D型均質(zhì)機(jī)對(duì)疫苗進(jìn)行了乳化進(jìn)行乳化，制備的滅活疫苗。
作為優(yōu)選，步驟4)中所述滅活時(shí)間是16h。
作為優(yōu)選，步驟4)中甲醛溶液的加入量為滅活溶液體積的1‰。
本發(fā)明的有益效果包括：采用了本土分離的雞新城疫病毒，免疫原性好，具有更高的保護(hù)率；本發(fā)明采用雞胚成纖維細(xì)胞取代利用雞胚絨毛尿囊膜接種方式繁殖雞新城疫病毒，節(jié)省了疫苗制備成本，各批間質(zhì)量差異降低，產(chǎn)量大，病毒毒價(jià)和疫苗質(zhì)量提高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
一種雞新城疫病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)制備原代CEF細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)接種雞新城疫病毒。
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80％以上病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液。
3)測(cè)定病毒效價(jià)，病毒的效價(jià)應(yīng)≥106.5TCID50/0.1mL。
4)將檢驗(yàn)合格的細(xì)胞毒液置于無(wú)菌容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理，加入甲醛溶液充分搖勻，甲醛溶液的加入量為滅活溶液體積的2‰，控制溫度在37℃滅活48h，轉(zhuǎn)速為180r/min。
5)將滅活的病毒進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，確定最佳的滅活時(shí)間及甲醛濃度。
6)將滅活的病毒液與進(jìn)口佐劑MONTANIDETMISA 206VG按1:1比例(w/w)或75:87比例(v/v)混勻，利用ATS Engineering Inc公司的AH100D型均質(zhì)機(jī)對(duì)疫苗進(jìn)行了乳化進(jìn)行乳化，制備的滅活疫苗。
實(shí)施例2
一種雞新城疫病毒滅活疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)制備原代CEF細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至單層時(shí)接種雞新城疫病毒。
2)當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)80％以上病變時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì)胞毒液。
3)測(cè)定病毒效價(jià)，病毒的效價(jià)應(yīng)≥106.5TCID50/0.1mL。
4)將檢驗(yàn)合格的細(xì)胞毒液置于無(wú)菌容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理，加入甲醛溶液充分搖勻，甲醛溶液的加入量為滅活溶液體積的0.5‰，控制溫度在37℃滅活12h，轉(zhuǎn)速為180r/min。
5)將滅活的病毒進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，確定最佳的滅活時(shí)間及甲醛濃度。
6)將滅活的病毒液與進(jìn)口佐劑MONTANIDETMISA 206VG按1:1比例(w/w)或75:87比例(v/v)混勻，利用ATS Engineering Inc公司的AH100D型均質(zhì)機(jī)對(duì)疫苗進(jìn)行了乳化進(jìn)行乳化，制備的滅活疫苗。
以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。