本發(fā)明涉及禽蛋制備卵黃抗體領(lǐng)域，具體涉及禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法及其用途。
背景技術(shù)：
I群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。Ⅱ群(火雞出血性腸炎和相關(guān)病毒)和Ⅲ群(減蛋綜合癥)禽腺病毒與疾病的關(guān)系明確，相比之下，大多數(shù)I群的禽腺病毒對(duì)禽類(lèi)的致病作用還未完全確定。但FAdV-1和FAdV-4明顯屬于例外，其中FAdV-1能引起鵪鶉支氣管炎，F(xiàn)AdV-4是心包積水肝炎綜合征的主要病因。當(dāng)雞的健康受到損害時(shí)，如并發(fā)感染雞傳染性貧血病毒(CIAV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的禽腺病毒株可使條件性致病源發(fā)生快速感染。I群禽腺病毒已經(jīng)鑒定了5個(gè)禽腺病毒，其名稱用字母A～E表示。每個(gè)種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分為不同的血清型。病毒顆粒直徑為70～nm，無(wú)囊膜，呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)。病毒核酸為雙股DNA，占整個(gè)病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分為蛋白質(zhì)。病毒六鄰體是主要的衣殼蛋白，含有型、群和群異性抗原決定簇，因而感染后可產(chǎn)生相應(yīng)的型，群和群的特異性抗體。
卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，是一種具有較強(qiáng)免疫功能的蛋白質(zhì)，多為IgG。禽類(lèi)免疫后在其卵黃中產(chǎn)生的大量高純IgG，其對(duì)某些禽類(lèi)疫病具有明顯治療和緊急預(yù)防作用?？贵w又稱免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、中和毒素等免疫活性。還能夠調(diào)理、凝集和沉淀抗原，激活補(bǔ)體。在疫病爆發(fā)時(shí)可用于緊急治療。此蛋白類(lèi)大分子用于治療時(shí)必須與其生物活性密切相關(guān)，因此在提取時(shí)必須保證其生物活性的穩(wěn)定。大量生產(chǎn)高活性抗體對(duì)于治療免疫疾病具有重要的價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
目前提取卵黃抗體的方法有很多種：
1、酸化水提取法：將卵黃與純化水按一定比例混合后，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值，通過(guò)靜置離心收集上清液，來(lái)達(dá)到收集卵黃抗體的效果。但是這種方法收集的卵黃抗體含量較低，不能完全體現(xiàn)卵黃的真正抗體含量。
2、聚乙二醇提取法：將卵黃與PBS緩沖液按一定比例混合后，加入一定比例的聚乙二醇粉末，然后靜置，10000r/min離心。聚乙二醇溶于水中不會(huì)發(fā)熱、升溫，不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，沉淀蛋白質(zhì)的時(shí)間較短且不影響離心處理，并有促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)晶的作用，但聚乙二醇易溶于水，而且需要用到10000r/min離心，在耗費(fèi)成本的同時(shí)也不能有效去除聚乙二醇，抗體得率也不高。
3、辛酸萃取法：向用酸化水法提取的IgY溶液中緩慢加入終濃度為1％的正辛酸，攪拌10min，放入冰箱中冷凍10min，抽濾得IgY溶液。該方法與聚乙二醇法相似，但辛酸在水中溶解度極低(0.062g/L)，因此在水溶性物質(zhì)中辛酸殘留量極微。但是這種方法需要冷凍抽濾，而且抗體含量不是很高。
4、普通氯仿提取法：將卵黃、生理鹽水、氯仿按一定的比例混勻后室溫放置30min，3000r/min離心20min，溶液分成3層，下層為有機(jī)溶劑，中間層為變性脂蛋白，上層為提取的IgY溶液。這種方法需要使用到離心機(jī)，而且不一定100％能分層，在室溫低下非常難析出大量的IgY溶液。因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，選用一種即能分離出含有大量卵黃抗體又要工藝簡(jiǎn)單能夠適于工業(yè)化生產(chǎn)的提取卵黃抗體的方法成了一個(gè)技術(shù)難題。
因此，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，找到一種既能分離出含大量卵黃抗體，又能適合工業(yè)化生產(chǎn)的工藝簡(jiǎn)單、節(jié)人成本的簡(jiǎn)易提取卵黃抗體的方法是亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的生產(chǎn)卵黃抗體純度低、制備繁鎖、活性低的缺陷，從而提供一種抗體純度高、對(duì)活性無(wú)影響，得率高的禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法。
為此，本發(fā)明的禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
(1)將禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活苗為抗原免疫健康母雞，并收集被免疫母雞所產(chǎn)的雞蛋；
(2)將所述免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液；
(3)將所述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)，所述雙水相系統(tǒng)包括25wt％～28wt％的聚乙二醇和20wt％～25wt％的檸檬酸鈉，得到水溶性組分混合液；
(4)對(duì)上述水溶性組分混合液進(jìn)行分離純化。
可選地，所述水溶性組分混合液中還包括0.05wt％～0.30wt％的Nacl。
可選地，所述步驟(2)具體包括：
對(duì)被免疫雞蛋的蛋殼進(jìn)行消毒處理；
取被免疫雞蛋的卵黃并加入所述卵黃重量8～10倍的雙蒸水制成卵黃稀釋液；
使用0.1mol/LHCl調(diào)節(jié)卵黃稀釋液的pH值至5～7；
放置于4℃～6℃環(huán)境下攪拌7～9小時(shí)；
將攪拌后的卵黃稀釋液在4℃～6℃的溫度下離心，得到卵黃抗體水溶性組分液上清液。
可選地，取被免疫雞蛋的卵黃時(shí)，還包括使用無(wú)菌NS將蛋殼內(nèi)的殘余蛋清洗出來(lái)。
可選地，步驟(1)中免疫健康母雞采用注射免疫，具體為4點(diǎn)注射為，肌肉一點(diǎn)，胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，首次免疫后的第7天及第14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
可選地，步驟(4)離心后分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體層，還包括在該中間層中加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥的步驟。
可選地，當(dāng)檸檬酸鈉的濃度為20wt％時(shí)，卵黃稀釋液的pH值為5.1，聚乙二醇的分子量為2000，Nacl濃度為2.5wt％。
可選地，所述檸檬酸鈉的pH值為8.0。
根據(jù)所述的腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法所得抗體制成微膠囊。
根據(jù)上述方法或產(chǎn)品在治療制備禽類(lèi)雞傳染性貧血病毒(CIAV)和傳染性法氏囊病病毒的藥物中的用途。
本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：
1.本發(fā)明實(shí)施例提供的禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，卵黃抗體通過(guò)禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活苗為抗原免疫健康母雞而得，具有特異性強(qiáng)，效價(jià)高的特點(diǎn)。上述卵黃抗體是從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，是一種具有較強(qiáng)免疫功能的蛋白質(zhì)，多為IgG。禽類(lèi)免疫后在其卵黃中產(chǎn)生的大量高純IgG，其對(duì)某些禽類(lèi)疫病具有明顯治療和緊急預(yù)防作用。
2.本發(fā)明實(shí)施例提供的禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，提取環(huán)境和條件溫和、非致變性，能夠獲得高純度的抗體，所得抗體得率在90％以上，較傳統(tǒng)方法大大提高，上述方法獲得抗體的成本低，可以大規(guī)模的生產(chǎn)，易于產(chǎn)業(yè)化，且擴(kuò)大生產(chǎn)后得率不改變，具有重要的價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
具體實(shí)施方式
下述各實(shí)施例中使用的抗原的制備方法為：禽腺病毒Ⅳ型菌在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)至菌液濃度107～10 9CFU/mL，收集菌體，用PBS稀釋后油乳滅活，得到滅活的禽腺病毒Ⅳ型。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.將免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡5分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡，使用無(wú)菌NS將蛋殼內(nèi)的殘余蛋清洗出來(lái)；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入8倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為5，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌9小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)?，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由25wt％的聚乙二醇(2000)和25wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.將免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡15分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入8倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為7，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌8小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)?，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由25wt％的聚乙二醇2000和25wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合；
S5.去除步驟S4中的下層和上層后，向中間層鹽析出的抗體層加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥，既延長(zhǎng)了抗體的保存時(shí)間又對(duì)抗體進(jìn)行濃縮，抗體凍干后其活性與凍干前活性無(wú)變化。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡10分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡，使用無(wú)菌NS將蛋殼內(nèi)的殘余蛋清洗出來(lái)；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入10倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為6，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌7小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以11000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)?，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由25wt％的聚乙二醇2000、20wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)和0.05wt％的Nacl，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合。
S5.去除步驟S4中的下層和上層后，向中間層鹽析出的抗體層加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥。
實(shí)施例4
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡7分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入8倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為5.1，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌8小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)?，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由26wt％的聚乙二醇2000、24wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)和3.0wt％的Nacl，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合
S5.去除步驟S4中的下層和上層后，向中間層鹽析出的抗體層加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥。
實(shí)施例5
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡12分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入8倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為5.5，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌9小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以10000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)?，待雙水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由27wt％的聚乙二醇2000、23wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)，0.15wt％的Nacl，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合。
S5.去除步驟S4中的下層和上層后，向中間層鹽析出的抗體層加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥。
實(shí)施例6
本實(shí)施例提供一種禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.免疫母雞所產(chǎn)雞蛋中的卵黃分離得到水溶性組分液的具體步驟如下：
先用75％酒精將收集的雞蛋浸泡13分鐘，對(duì)外殼進(jìn)行消毒處理；取出雞蛋用清水沖洗，用無(wú)菌紗布將蛋殼擦干；將蛋殼打開(kāi)一個(gè)小孔，讓蛋清緩慢流出，直至蛋清流盡；打開(kāi)蛋殼，小心將整個(gè)蛋黃移至滅菌濾紙上，來(lái)回流動(dòng)，除盡蛋清；把蛋黃加入無(wú)菌量杯，記錄卵黃量(一般約5-10g),然后加入8倍滅菌的雙蒸水于量杯中制成卵黃稀釋液；用0.1mol/LHCl調(diào)卵黃稀釋液pH為6.5，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌8小時(shí)；攪拌結(jié)束后，在4℃環(huán)境下將卵黃稀釋液放入離心機(jī)中以11000轉(zhuǎn)/分鐘(用高速低溫離心機(jī))離心15分鐘，收取得卵黃抗體水溶性組分液上清液，制成水溶性組分液；
S4.將上述卵黃分離得到水溶性組分液加入至雙水相系統(tǒng)混合均勻，然后至于37.5℃水浴鍋溫?zé)幔p水相系統(tǒng)明顯分層后轉(zhuǎn)入離心機(jī)3000r/min，離心10分鐘，離心后雙水相系統(tǒng)明顯分為三層，上層為聚乙二醇層，下層為檸檬酸鈉層，中間層為鹽析出的抗體；
其中，雙水相系統(tǒng)由25wt％的聚乙二醇2000、20wt％的檸檬酸鈉(pH＝8.0)和1.5wt％的Nacl，加入一定量的去離子水，得到水溶性組分混合液，聚乙二醇2000、25wt％的檸檬酸鈉和去離子水按1：1：1：1混合。
S5.去除步驟S4中的下層和上層后，向中間層鹽析出的抗體層加入0.05％的蔗糖進(jìn)行冷凍干燥。
S6.使用上述方法得到的抗體制成微膠囊保存，方便使用。
對(duì)比例1
本實(shí)施例提供的禽腺病毒Ⅳ型卵黃抗體的提取方法，包括以下步驟：
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.將卵黃與PBS緩沖液按一定比例混合后，加入一定比例的聚乙二醇粉末，然后靜置，10000r/min離心，得到上層液體為抗體液。
對(duì)比例2
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫占Ｌm褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.卵黃與蛋清分離后，將卵黃與純化水按一定比例混合后，用0.1mol/LHCl鹽酸調(diào)卵黃稀釋液pH為6.5，把制備好的卵黃液放置在4℃環(huán)境下攪拌，通過(guò)靜置離心收集上清液，以收集卵黃抗體。
對(duì)比例3
S1.選擇健康的17-18周齡海蘭褐雞3只，將免疫原(禽腺病毒Ⅳ型油乳滅活疫苗)注射到海蘭褐雞體內(nèi)，每只免疫注射量為0.5ml，免疫注射部位為4點(diǎn)注射，分別為胸部一點(diǎn)，兩翼下各一點(diǎn)，肌肉一點(diǎn)共四點(diǎn)，首次免疫后的第7天及14天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量與方法與首次免疫相同；
S2.免疫結(jié)束后收集雞蛋，收集從最后一次免疫算起，將收集的雞蛋編號(hào)并做好記錄，并于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，收集海蘭褐雞未免疫雞蛋為陰性對(duì)照；
S3.卵黃與蛋清分離后，將卵黃與純化水按一定比例混合后，靜置2小時(shí)得到上層清液為卵黃粗提物，向卵黃抗體粗提物中加入硫酸銨至飽和度為60％，攪拌均勻后4℃過(guò)夜，4℃下離心，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，再加入硫酸鈉至飽和度為14％，攪拌均勻后室溫過(guò)夜，室溫離心，將沉淀用去離子水稀釋至原體積，得到卵黃抗體提取液；卵黃抗體提取液用100kDa截留量的超濾膜包進(jìn)行超濾濃縮，超濾后的卵黃抗體提取液在-70℃條件下預(yù)凍2h，然后在真空度20Pa下，冷凍干燥，24h后得到純化的腺病毒Ⅳ型卵黃抗體凍干粉。
效果例
測(cè)試方法：使用間接ELISA法測(cè)定所提卵黃抗體與未提抗體的效價(jià)。
包被禽腺病毒Ⅳ型抗原4℃過(guò)夜，PBST溶液洗滌三次，每次1min，洗滌后加入5％的脫脂奶粉37℃封閉2小時(shí)，封閉后PBST洗滌三次，每一1min，洗滌后將所提抗體還原為提純前的體積作為一抗以及免疫血清原液作為一抗加入到封閉后的ELISA板中，1％的BSA作為陰性對(duì)照加入。37℃溫箱撫育1小時(shí)后PBST洗滌三次，每次1min，加入二抗37℃溫箱撫育40min。PBST洗滌3次，每次1min。洗滌后加入顯色液，37℃放置15min。15min后加入終止液，酶標(biāo)儀測(cè)450nm的OD值及為所得抗體效價(jià)。
所得值與陰性對(duì)照組比值大于2.1及可判定所測(cè)效價(jià)為有效值。對(duì)于有效值減去陰性對(duì)照后與免疫血清減去陰性對(duì)照組的OD值乘以100％及作為所得抗體的得率。
抗體得率的計(jì)算公式：
X為所提抗體的OD值，Y為免疫血清的OD值，R為陰性對(duì)照。此處，X/R>2.1；Y/R>2.1。
經(jīng)檢測(cè)實(shí)施例1提取抗體得率為91.7％，實(shí)施例2抗體得率為90.3％，實(shí)施例3的抗體得率為92.6％，實(shí)施例4的抗體得率為92.5％，實(shí)施例5的抗體得率為91.9％，實(shí)施例6的抗體得率為95.7％，由此可得，通過(guò)本申請(qǐng)所使用的提取方法所得到的抗體得率均為90％以上，特別是實(shí)施例6的試驗(yàn)參數(shù)，抗體得率穩(wěn)定且相對(duì)高。對(duì)比例1～對(duì)比例3的抗體得率很低，其中，對(duì)比例3的抗體得率在70％左右，較對(duì)比例1和對(duì)比例2高。綜上所述，使用上述提取方法所得抗體質(zhì)量穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，成本低，具有很好的產(chǎn)業(yè)化前景。
顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。