本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和醫(yī)學(xué)檢驗技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原及其制備方法和檢測試紙卡。

背景技術(shù)：

氧氟沙星(Ofloxacin，OFL)是第三代氟喹諾酮類藥物，又名氟嗪酸，是由日本第一制藥株式會社于1980年開發(fā)的一種抗生素，因為分子的基本結(jié)構(gòu)中引入了疏水性的氟原子及親水性的哌嗪環(huán)，使其抗菌活性得到了增強，與早期喹諾酮類藥物相比，其細(xì)菌耐藥性也大大降低了。這類藥物通過抑制細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，抑制細(xì)菌DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)過程，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強的特點，是繼磺胺類藥物之后人類在合成抗菌藥物方面最重要的突破之一，其抗菌作用是磺胺類藥物的近千倍，可與第三代頭孢類抗菌藥物相媲美。目前，OFL已成為獸醫(yī)臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖中最重要的抗感染藥物之一，被大量用于治療、預(yù)防和促生長，甚至作為飼料添加劑使用。然而此類氟喹諾酮類藥物對人體有一定毒副作用，包括胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)、心臟毒性、致病菌產(chǎn)生耐藥性和潛在致癌性等，其在牲畜體內(nèi)的殘留會對環(huán)境及人體健康造成嚴(yán)重傷害。

氧氟沙星藥物殘留檢測的傳統(tǒng)方法有微生物學(xué)法，高效液相色譜法(HPLC)，液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)和液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等方法。這些方法靈敏度高、特異性強，但樣品前處理繁瑣，需要專業(yè)的技術(shù)人員和昂貴的儀器設(shè)備，不適合大批量的市場監(jiān)測要求。免疫學(xué)檢測方法建立在抗體對抗原的分子識別上，具有抗原抗體的親合力高、檢測快速、經(jīng)濟實用，能夠?qū)崿F(xiàn)對生物液體的小體積、大通量檢測的優(yōu)點。但是根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中，杜付彬等人報道氧氟沙星人工抗原的合成及鑒定方法，具體采用碳二亞胺法和混合酸酐法合成氧氟沙星免疫原和包被原，但是制備的氧氟沙星免疫原并未免疫小鼠，因此，無法估算單克隆抗體的特異性；再如，公告號為CN100418982C的專利公開了一種氧氟沙星的偶聯(lián)物及其制備方法，采用碳二亞胺法制備的氧氟沙星的偶聯(lián)物免疫白兔，抗血清的最低檢測限為1ppb(1μg/L)。因此，現(xiàn)有技術(shù)需要更低的檢測限的氧氟沙星檢測試劑盒。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原及其制備方法，使制備得到的氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原具有較高的反應(yīng)原性和偶聯(lián)率高的特點。

本發(fā)明另一個目的是提供一種氧氟沙星檢測試紙卡，使所述試紙卡具有檢測速度快、特異性強、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確的特點。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，具有式I所示結(jié)構(gòu)：

表示所述包被原中偶聯(lián)的血藍(lán)蛋白。

本發(fā)明提供了一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原的制備方法，包括以下步驟：

1)將氨基戊酸和氧氟沙星在緩沖溶液體系中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液依次進(jìn)行萃取和反萃取，得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原；

2)將所述步驟1)得到的碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液；將氯甲酸異丁酯與所述碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液混合，攪拌反應(yīng)，得到活化的氧氟沙星半抗原；

3)將血藍(lán)蛋白和磷酸緩沖液混合，調(diào)節(jié)混合液的pH值至9.0～10，在振蕩條件下反應(yīng)，得到血藍(lán)蛋白；

4)將所述步驟3)中得到的活化的血藍(lán)蛋白溶解于含有N,N-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖溶液中，得到活化的血藍(lán)蛋白溶液；

5)將所述步驟2)得到的活化的氧氟沙星半抗原滴加到所述步驟4)得到的血藍(lán)蛋白溶液中，在振蕩條件下反應(yīng)，得到具有式I所示結(jié)構(gòu)的氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原：

所述步驟1)～2)與步驟3)之間沒有時間順序的限制。

優(yōu)選的，所述步驟1)中氨基戊酸溶液的pH值為10.0～12.0；所述氨基戊酸溶液的質(zhì)量濃度為20～40mg/ml。

優(yōu)選的，所述步驟1)中氧氟沙星溶液的質(zhì)量濃度為15～30mg/ml；

所述氧氟沙星溶液中的溶劑為摩爾濃度為0.01～0.02mol/L、pH值為7.4的PBS溶液。

優(yōu)選的，所述步驟1)中萃取用萃取劑為乙酸乙酯；所述洗滌的洗滌液為質(zhì)量濃度為0.09～0.18mg/ml的鹽酸溶液；所述反萃取用反萃劑為質(zhì)量濃度為2.1～4.2mg/ml的碳酸氫鈉溶液。

優(yōu)選的，所述步驟3)中碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原、N,N-二甲基甲酰胺和氯甲酸異丁酯的摩爾比為3～10：1。

優(yōu)選的，所述步驟3)中振蕩的轉(zhuǎn)速為50～200r/min，所述步驟3)中反應(yīng)的溫度為30～37℃

優(yōu)選的，所述步驟4)中血藍(lán)蛋白與N,N-二甲基甲酰胺的摩爾比為3～10：1。

優(yōu)選的，所述步驟5)中氧氟沙星半抗原與血藍(lán)蛋白的摩爾比為5～10：1。

優(yōu)選的，所述步驟5)中振蕩的轉(zhuǎn)速為50～200r/min；所述振蕩的溫度為30～37℃。

本發(fā)明還提供了一種檢測氧氟沙星用試紙卡，包括卡殼、底板、樣品墊、金標(biāo)墊、檢測和吸水區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有檢測線T和質(zhì)控線C，其特征在于，所述檢測線T位置包被有氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，所述質(zhì)控線C位置包被有兔抗IgG，所述金標(biāo)墊附著有金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體；

所述金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體是由所述的細(xì)胞株分泌得到。

優(yōu)選的，所述氧氟沙星包被原的包被濃度為0.05～0.1μg/ml。

優(yōu)選的，所述氧氟沙星單克隆抗體的質(zhì)量濃度為0.01～0.02mg/ml。

本發(fā)明提供的一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，具有式I所示結(jié)構(gòu)。所述的氧氟沙星-血藍(lán)蛋白免疫原在氧氟沙星的羧基上進(jìn)行C鏈衍生化，使羧基伸長，使抗原決定簇暴露在外，制成的包被原具有較強的反應(yīng)原性。

本發(fā)明提供的一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原的制備方法，氧氟沙星上羧基進(jìn)行C鏈衍生化，同時血藍(lán)蛋白進(jìn)行活化，再利用酸酐偶合法合成包被原，制備出的免疫原具有偶聯(lián)率高、反應(yīng)原性強的特點。

本發(fā)明提供的單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的單克隆抗體。

本發(fā)明提供的一種檢測氧氟沙星用試紙卡，包括卡殼，底板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測區(qū)和吸水區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有檢測線T和質(zhì)控線C，所述檢測線T位置包被有氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，所述質(zhì)控線C位置包被有兔抗IgG，所述金標(biāo)墊附著有金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體。本發(fā)明將上述制備得到的氧氟沙星單克隆抗體與氧氟沙星包被原制備成的試紙卡，具有檢測速度快，靈敏度高，且滿足快速檢測的要求，所述試紙卡的檢測限可達(dá)0.06ng/ml。

進(jìn)一步的，卡殼的使用可以延長檢測結(jié)果觀察時間，試紙卡穩(wěn)定性好。本試紙卡樣品吸收墊將檢測溶液完全吸收，使之與偶聯(lián)墊上金標(biāo)抗體充分反應(yīng)，可以有效減少誤差率；還可以防止外界雜質(zhì)干擾，影響金標(biāo)抗體與檢測抗原的結(jié)合；成本低、投資少。使用本發(fā)明試紙卡，不需要另配復(fù)雜的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，現(xiàn)場檢測一步到位，成本低廉，見效快；易于大范圍推廣應(yīng)用。本試紙卡操作簡單，適合不同類別的人員使用，如實驗室檢測、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生監(jiān)督、規(guī)模養(yǎng)殖及個體生產(chǎn)等，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟效益和社會效益。

附圖說明

圖1為實施例1中氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原合成反應(yīng)合成路線圖；

圖2為實施例3中左氧氟沙星免疫抗原合成路線圖；

圖3為實施例5中氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為實施例5中氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡中試紙條的側(cè)視圖；

圖5為實施例5中氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡中試紙條的俯視圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，具有式I所示結(jié)構(gòu)：

表示所述包被原中偶聯(lián)的血藍(lán)蛋白。

本發(fā)明提供了一種氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原的制備方法，包括以下步驟：

1)將氨基戊酸和氧氟沙星在緩沖溶液體系中進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，將得到的反應(yīng)液依次進(jìn)行萃取和反萃取，得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原；

2)將所述步驟1)得到的碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液；將氯甲酸異丁酯與所述碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液混合，攪拌反應(yīng)，得到活化的氧氟沙星半抗原；

3)將血藍(lán)蛋白和磷酸緩沖液混合，調(diào)節(jié)混合液的pH值至9.0～10，在振蕩條件下反應(yīng)，得到血藍(lán)蛋白；

4)將所述步驟3)中得到的活化的血藍(lán)蛋白溶解于含有N,N-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖溶液中，得到活化的血藍(lán)蛋白溶液；

5)將所述步驟2)得到的活化的氧氟沙星半抗原滴加到所述步驟4)得到的血藍(lán)蛋白溶液中，在振蕩條件下反應(yīng)，得到具有式I所示結(jié)構(gòu)的氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原：

所述步驟1)～2)與步驟3)之間沒有時間順序的限制。

本發(fā)明將氨基戊酸溶液和氧氟沙星溶液進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)，得到脫水縮合反應(yīng)液。本發(fā)明中，所述氨基戊酸溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為20～40mg/ml，更優(yōu)選為24mg/ml。所述氨基戊酸溶液的溶劑為水。所述氨基戊酸溶液的pH值優(yōu)選為10.0～12.0，更優(yōu)選為11.0。所述氨基戊酸溶液的pH值優(yōu)選采用質(zhì)量濃度為0.1％的氫氧化鈉溶液調(diào)整，調(diào)整后的氨基戊酸溶液冰浴攪拌，所述冰浴攪拌的目的是逐漸降低反應(yīng)溶液至4℃，進(jìn)行氨基戊酸和氧氟沙星的脫水縮合反應(yīng)。所述冰浴的方法沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的冰浴的技術(shù)方案即可。

本發(fā)明中，所述氧氟沙星溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為15～30mg/ml，更優(yōu)選為22mg/ml。所述氧氟沙星溶液的溶劑優(yōu)選為摩爾濃度為0.01～0.02mol/L、pH值為7.4的PBS溶液。

在本發(fā)明中，所述脫水縮合反應(yīng)具體方法優(yōu)選為：在攪拌狀態(tài)下將所述氧氟沙星溶液逐滴加入氨基戊酸溶液中，在攪拌條件下進(jìn)行脫水縮合反應(yīng)。本發(fā)明中，所述攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200r/min，更優(yōu)選為100r/min；所述脫水縮合反應(yīng)的時間優(yōu)選為2～3h；所述脫水縮合反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30～37℃。所述逐滴加入的每滴液體的體積為0.02ml。所述逐滴加入的每滴液體的速度為50滴/min。所述逐滴加入能夠使氧氟沙星溶液與氨基戊酸溶液充分發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，提高氧氟沙星(OFL)羧基C鏈延伸化的比例。

脫水縮合反應(yīng)后，本發(fā)明將得到的反應(yīng)液進(jìn)行萃取，本發(fā)明對所述萃取的具體操作沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的萃取的技術(shù)方案即可。在本發(fā)明中，所述萃取用萃取劑優(yōu)選為乙酸乙酯。萃取劑的用量為2～5ml。所述萃取的目的是去除不溶解的大顆粒雜質(zhì)分子，其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)入有機相。

所述萃取后，得到水相和有機相。本發(fā)明優(yōu)選將所述萃取后有機相進(jìn)行洗滌。本發(fā)明對所述洗滌的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的洗滌的技術(shù)方案即可。在本發(fā)明中，所述洗滌用洗滌液優(yōu)選為鹽酸溶液。所述鹽酸溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.09～0.18mg/ml更優(yōu)選為0.15mg/ml。所述洗滌的次數(shù)優(yōu)選2～5次，更優(yōu)選3次。

得到有機相后，本發(fā)明將所述有機相進(jìn)行反萃取，反萃取后得到的水相含有反應(yīng)產(chǎn)物，即碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原。在本發(fā)明中，所述反萃取用反萃劑優(yōu)選為碳酸氫鈉溶液。所述碳酸氫鈉溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為2.1～4.2mg/ml，更優(yōu)選為3.15mg/ml。所述反萃取的目的是將反應(yīng)產(chǎn)物重新溶解在水相中。反萃劑的用量為3～6ml。

得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原后，本發(fā)明將所述碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶于N,N-二甲基甲酰胺，得到碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液；將氯甲酸異丁酯與所述碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原溶液混合，攪拌反應(yīng)，得到活化的氧氟沙星半抗原；

本發(fā)明中，所述碳鏈延伸的氧氟沙星半抗原與N,N-二甲基甲酰胺的摩爾比優(yōu)選為3～10：1，更優(yōu)選為5：1。

本發(fā)明中，所述攪拌反應(yīng)優(yōu)選在磁力攪拌的條件下進(jìn)行。所述磁力攪拌的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200r/min，更優(yōu)選為100r/min。本發(fā)明中，所述攪拌反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30～37℃，更優(yōu)選為35℃。實現(xiàn)避光反應(yīng)是用錫伯紙將試劑瓶進(jìn)行嚴(yán)密包裝，阻止光線進(jìn)入。

本發(fā)明將血藍(lán)蛋白和磷酸緩沖液混合，調(diào)節(jié)混合液的pH值至9.0～10，進(jìn)行振蕩，得到溶解的血藍(lán)蛋白。

本發(fā)明中，所述血藍(lán)蛋白(KLH)的質(zhì)量和磷酸緩沖液的體積比優(yōu)選為(40～60)mg：(2～5)ml，更優(yōu)選為45mg：3ml。

本發(fā)明中，所述pH值優(yōu)選采用NaHCO₃溶液調(diào)節(jié)。所述NaHCO₃溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為2.1～4.2mg/ml，更優(yōu)選為3.15mg/ml。所述pH值優(yōu)選調(diào)整至9.6。

本發(fā)明中，所述振蕩條件的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200r/min，更優(yōu)選為100r/min。所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為3～5h，更優(yōu)選為4h。所述振蕩的目的是加速血藍(lán)蛋白的完全溶解。

將血藍(lán)蛋白溶解后，本發(fā)明將溶解的血藍(lán)蛋白溶與含有N,N-二甲基甲酰胺的磷酸鹽緩沖溶液混合，得到血藍(lán)蛋白溶液。本發(fā)明中，所述血藍(lán)蛋白與N,N-二甲基甲酰胺的摩爾比為3～10：1，更優(yōu)選為5：1。

得到活化的氧氟沙星半抗原和血藍(lán)蛋白溶液后，本發(fā)明將所述活化的氧氟沙星半抗原滴加到所述KLH溶液中，在振蕩條件下脫水縮合反應(yīng)，得到具有式I所示結(jié)構(gòu)的氧氟沙星-血藍(lán)蛋白(氧氟沙星-KLH)包被原：

本發(fā)明中，所述滴加的速率30～100滴/min。

本發(fā)明中，所述振蕩的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50～200r/min，更優(yōu)選為100r/min；所述振蕩的溫度優(yōu)選為30～37℃，更優(yōu)選為35℃。所述反應(yīng)的時間優(yōu)選為3～5h，更優(yōu)選為4h。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30～37℃。

本發(fā)明還提供了一種檢測氧氟沙星用試紙卡，包括卡殼，底板，樣品墊，金標(biāo)墊，檢測區(qū)和吸水區(qū)，所述檢測區(qū)設(shè)有檢測線T和質(zhì)控線C，所述檢測線T位置包被有氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原，所述質(zhì)控線C位置包被有兔抗IgG，所述金標(biāo)墊附著有金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體。

本發(fā)明中，所述兔抗IgG的包被濃度為0.2～0.5mg/ml，更優(yōu)選為0.3mg/ml。本發(fā)明對所述兔抗IgG的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的兔抗IgG即可。

本發(fā)明中，所述氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原的包被濃度優(yōu)選為0.05～0.1μg/ml，更優(yōu)選為0.08μg/ml。

本發(fā)明中，所述檢測區(qū)的材料優(yōu)選為硝酸纖維素膜。所述硝酸纖維素膜的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的硝酸纖維素膜即可。

本發(fā)明中，所述金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體在金標(biāo)墊上的濃度優(yōu)選為0.01～0.02mg/ml，更優(yōu)選為0.015mg/ml。

本發(fā)明中，所述氧氟沙星單克隆抗體由所述左氧氟沙星免疫原免疫小鼠篩選得到產(chǎn)抗氧氟沙星的單克隆抗體的細(xì)胞株，對所述細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，收集氧氟沙星單克隆抗體。

本發(fā)明中，所述左氧氟沙星免疫原為左氧氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原。所述左氧氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原的制備方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的左氧氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原的制備方法即可。本發(fā)明實施例中所述左氧氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原是采用碳乙二胺法合成。

本發(fā)明中，所述氧氟沙星單克隆抗體的收集方法優(yōu)選包括以下步驟：

當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞株的濃度達(dá)到10⁷/ml以上時，向液體石蠟處理過的母鼠腹腔內(nèi)注射單克隆細(xì)胞，培養(yǎng)10～12d；

培養(yǎng)完成后，抽取母鼠腹水，用飽和硫酸胺法純化抗氧氟沙星單克隆抗體，得到抗氧氟沙星單克隆抗體。

本發(fā)明中，所述注射單克隆細(xì)胞的數(shù)量優(yōu)選為10⁷～10⁹/只，更優(yōu)選為10⁸/只。

本發(fā)明中，所述金標(biāo)記的氧氟沙星單克隆抗體的制備方法沒有特殊限制采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的制備方法即可。

本發(fā)明中，所述金標(biāo)墊的材料優(yōu)選為玻璃纖維或聚酯膜。所述玻璃纖維和聚酯膜的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的玻璃纖維和聚酯膜即可。

本發(fā)明中，所述吸水區(qū)的材料優(yōu)選采用吸水紙。所述吸水紙的厚度優(yōu)選為0.35mm。所述吸水紙的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的吸水紙即可。

本發(fā)明中，所述樣品墊優(yōu)選進(jìn)行預(yù)處理。所述預(yù)處理的方法優(yōu)選為用樣品墊處理液浸泡后烘干，得到處理后的樣品墊。所述樣品墊處理液包括以下重量百分比的組分：含質(zhì)量濃度3～8％的BSA，質(zhì)量濃度為1～3％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.5％～1％的NaCl和質(zhì)量濃度為0.03％～0.0％8的NaN₃的PBS緩沖液，更優(yōu)選為含質(zhì)量濃度為5％的BSA，質(zhì)量濃度為2％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.8％的NaCl和質(zhì)量濃度為0.05％的NaN₃的PBS緩沖液。本發(fā)明中，所述樣品墊的材料優(yōu)選為玻璃纖維。所述玻璃纖維的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的玻璃纖維即可。

本發(fā)明中，所述檢測氧氟沙星用試紙卡的制備方法優(yōu)選包括以下步驟：所述檢測線和質(zhì)控線的劃線，所述的結(jié)合墊的制備，所述的樣品墊的制備和所述試紙卡的組裝。

所述檢測線和質(zhì)控線的包被方法優(yōu)選采用噴點儀包被。所述包被的具體步驟為：將硝酸纖維素膜置于噴點儀平臺上，氧氟沙星-血藍(lán)蛋白包被原溶液放于A池，兔抗IgG溶液放于B池，在噴點儀作用下將包被抗原和二抗分別點射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)。室溫自然干燥后，將其浸入封閉液中30min，37℃烘干后，加入干燥劑，4℃密封保存。

所述封閉液優(yōu)選為質(zhì)量濃度為1％的BSA的PBS緩沖液，所述的PBS緩沖液的pH值優(yōu)選為7.4。

本發(fā)明中，所述的金標(biāo)墊的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟：

將玻璃纖維棉放入含有BSA、蔗糖、NaCl和NaN₃的PBS處理液處理，烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空冷凍干3～5h，即為金標(biāo)墊。

本發(fā)明中，所述BSA溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為4～6％，更優(yōu)選為5％。

本發(fā)明中，所述蔗糖的質(zhì)量濃度優(yōu)選為1～3％，更優(yōu)選為2％。

本發(fā)明中，所述NaCl的質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.6～1.0％，更優(yōu)選為0.8％。

本發(fā)明中，所述NaN₃的質(zhì)量濃度為0.03～0.07％，更優(yōu)選為0.05％。

本發(fā)明中，所述處理的時間優(yōu)選為15～30min，更優(yōu)選為20min。

本發(fā)明中，所述烘干的溫度優(yōu)選為35～40℃，更優(yōu)選為37℃。

本發(fā)明中，所述的樣品墊的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟：

玻璃纖維棉要用含質(zhì)量濃度為2％的BSA，質(zhì)量濃度為1％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.5％的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為0.1％的NaN3的PBS處理后，干燥備用，即為樣品墊。

本發(fā)明中，所述的試紙卡的組裝，優(yōu)選包括以下步驟：

在底板上，按照樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸收墊依次組裝在一起，形成組裝板；

將所述組裝板切割成試紙條。

本發(fā)明中，所述樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸收墊之間的重疊區(qū)域優(yōu)選5～6mm。

本發(fā)明優(yōu)選將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的特制的塑料盒體中，即為氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡。

本發(fā)明中，所述一種檢測氧氟沙星用試紙卡的使用方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的試紙卡使用方法即可。

本發(fā)明中，所述檢測氧氟沙星用試紙卡的檢測結(jié)果判定方法具體為：

試紙卡以紅色印跡線“|”或“‖”作為檢測線的陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“|”印跡時，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)同時出現(xiàn)兩條紅色“‖”印跡時，表示樣品溶液呈陰性。本發(fā)明提供的試紙卡的檢測限可達(dá)0.06ng/ml。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種氧氟沙星免疫原及其制備方法和檢測試紙卡進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護范圍的限定。

實施例1

氧氟沙星檢測抗原的合成，合成反應(yīng)如附圖1所示。

氧氟沙星羧基C鏈延伸化：稱取2mmol氨基戊酸加入三角燒瓶中，然后用2ml氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值，冰浴攪拌；用含50％DMF的甲醇溶解氧氟沙星，攪拌狀態(tài)下逐滴加入氨基戊酸-氫氧化鈉溶液中，磁力攪拌反應(yīng)2h；用乙酸乙酯萃取，稀鹽酸洗滌，再用碳酸氫鈉溶液反萃取，制得OFL半抗原。

所述的氧氟沙星－血藍(lán)蛋白(OFL-KLH)檢測抗原通過混合酸酐偶聯(lián)方法實現(xiàn)：稱取20mg OFL半抗原溶解在2ml DMF中，加入10μL三乙胺，4℃冰浴條件下反應(yīng)1h。然后加入30μL氯甲酸異丁酯，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1h。將30mg的KLH溶于2ml碳酸鹽緩沖溶液中(CBS，0.05mol/L,pH 9.6)，并加入2ml DMF攪拌反應(yīng)0.5h。冰浴、攪拌條件下將OFL反應(yīng)產(chǎn)物逐滴加入KLH溶液中，加完后在4℃下振蕩反應(yīng)6h。反應(yīng)液裝入透析袋，CBS緩沖液4℃透析5d，6h換液1次，離心取上清，得OFL-KLH檢測抗原，-20℃凍存。

實施例2

左氧氟沙星(LOF)免疫原的合成；合成反應(yīng)如附圖2所示。

(1)BSA活化：糖基化修飾法，在偏堿性環(huán)境中使葡萄糖上的醛基與蛋白質(zhì)上的羧基偶聯(lián)，封閉羧基，提高BSA上偶聯(lián)氨基的數(shù)量。具體過程如下：稱取66mg牛血清白蛋白(BSA)和1mg葡萄糖溶于PBS緩沖液中，用NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至9.5，40℃搖床反應(yīng)2h，制得活化的cBSA。

(3)免疫原的合成：采用碳二亞胺兩步法合成LOF免疫原。取LOF半抗原19.3mg，用2.3ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)攪拌溶解后，加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)14.4mg和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)51.2mg，溶解后室溫條件下避光，搖床振蕩反應(yīng)24h，稱A液。將活化的cBSA溶解于含50％DMF的PBS磷酸鹽緩沖溶液中，稱B液。將A液逐滴緩慢加入到B液中，并不斷震蕩，加完后繼續(xù)反應(yīng)3h，獲得LOF-cBSA免疫原。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液裝入透析袋，用PBS緩沖液透析6d，每天換液3次。紫外掃描透析液無小分子吸收峰時分裝于安瓿瓶中，–20℃保存。

實施例3

抗氧氟沙星單克隆抗體的制備；

1、所述的抗氧氟沙星特異性單克隆抗體由左氧氟沙星－牛血清白蛋白(LOF-cBSA)偶聯(lián)物免疫Balb/C小鼠制備而來，由以下步驟實現(xiàn)：

(1)小鼠免疫：用LOF-cBSA免疫8-10周齡雌性Balb/C小鼠5只，劑量為60μg/只，體積為0.2ml。首免用PBS稀釋的免疫原與等體積FCA完全乳化，以后每隔3w加強免疫一次，換用FIA乳化。免疫5次后斷尾采血分離血清，用間接ELISA和間接競爭ELISA(ciELISA)篩選效價高，抑制效果好的小鼠作為融合備用鼠。融合前3d超免小鼠，尾靜脈和腹腔各注射60μg免疫原。

(2)細(xì)胞融合：融合前4-5d用含有8-氮鳥嘌呤的完全培養(yǎng)基(含15％FBS的RPMI-1640)傳代培養(yǎng)NS0細(xì)胞；前1d用HAT培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞；融合時眶下竇采血，脫頸致死小鼠。無菌取脾臟制備脾細(xì)胞，在PEG-1500作用下與NS0細(xì)胞融合(細(xì)胞數(shù)量比約為10：1)，將融合后的細(xì)胞懸液加入到已鋪有滋養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，HAT培養(yǎng)。

(3)單克隆細(xì)胞株的篩選：融合后10-14d用間接ELISA和ciELISA篩選強陽性、抑制率高、生長狀態(tài)好的雜交瘤細(xì)胞株，用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆。然后用氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品溶液篩選靈敏度高、特異性強的單克隆源細(xì)胞株，共取得7株。其中，L2H4D2細(xì)胞株靈敏度最高，特異性最強，除與氧氟沙星和左氧氟沙星100％交叉反應(yīng)外，與其它氟喹諾酮類藥物無交叉反應(yīng)，其抗體特異性結(jié)果見表1。

表1 L2H4D2細(xì)胞株抗體特異性

(4)單克隆抗體的生產(chǎn)：將L2H4D2細(xì)胞株轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞板及50ml細(xì)胞瓶中擴大培養(yǎng)。篩選的雜交瘤細(xì)胞濃度達(dá)到約10⁷/ml時，向10d前經(jīng)液體石蠟處理過的經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔內(nèi)注射單克隆細(xì)胞10⁸/只。10～12d后抽取腹水，飽和硫酸胺法純化抗OFL特異性單克隆抗體，進(jìn)行膠體金標(biāo)記。

實施例4

試紙卡靈敏度檢測對比實驗

利用雜交瘤細(xì)胞株L2H4D2分泌的單克隆抗體，進(jìn)行膠體金標(biāo)記，同時采用混合酸酐法合成的包被抗原OFL-KLH，以及本實驗室EDC法合成的包被抗原OFL-OVA進(jìn)行對比實驗，在PBS緩沖液(0.01mol/L,pH 7.4)中進(jìn)行試紙卡添加檢測實驗，兩種包被原的試紙卡制備方法和檢測條件完全相同。

結(jié)果表明：混合酸酐法合成的包被抗原OFL-KLH制備的試紙卡，檢測靈敏度為0.06ng/ml，而EDC法合成的包被抗原OFL-OVA制備的試紙卡，檢測靈敏度為0.5ng/ml。

實施例5

金標(biāo)抗體的制備方法

膠體金標(biāo)記氧氟沙星特異性單克隆抗體(氧氟沙星mAb)制備，由以下步驟實現(xiàn)：

(1)膠體金溶液的制備：取超純水溶解的0.01％氯金酸溶液100ml，置電爐加熱至沸騰，3min后邊攪拌，邊迅速加入1％的檸檬酸三鈉溶液2ml。繼續(xù)加熱，溶液顏色由無色轉(zhuǎn)為淺黃色，最后變?yōu)槌燃t色時停止加熱。冷卻后用超純水恢復(fù)至原體積，進(jìn)行透射電鏡掃描，鑒定膠體金質(zhì)量及顆粒大小。膠體金懸液中加入最終質(zhì)量濃度為0.05％的疊氮鈉(NaN3)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)抗體預(yù)處理：高濃度的抗體長時間冷凍保存會發(fā)生不同程度的聚集，這些聚集物會影響標(biāo)記的穩(wěn)定性。因此標(biāo)記前，將抗氧氟沙星特異性單克隆抗體10000r/min，4℃條件下離心30min，棄沉淀，上清液用0.01mol/L PBS稀釋成1mg/ml。

(3)待標(biāo)mAb實際用量的確定：酶標(biāo)板用每孔50μl雙蒸水鋪底，縱排加入倍比稀釋的氧氟沙星mAb，每孔50μl，設(shè)空白對照(BC)。用0.1mol/L K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液至pH 9.0，加入到酶標(biāo)板中，每孔50μl混勻。室溫孵育15min后，加入10％NaCl溶液100μl，混勻，靜置。對照孔與mAb量不足以穩(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象，而mAb量達(dá)到或超過最低穩(wěn)定量的各孔仍保持紅色不變。選擇不聚沉?xí)rmAb的最低量，在此基礎(chǔ)上增加20％，即為待標(biāo)氧氟沙星mAb的實際用量。

(4)金標(biāo)抗體的制備：將事先確定的最佳標(biāo)記氧氟沙星mAb的實際用量與膠體金偶聯(lián)，常溫攪拌30min，5000r/min離心20min，棄上清后，加入10％BSA硼酸鈉溶液，使BSA終濃度為1％作為穩(wěn)定劑。金標(biāo)抗體溶液10000r/min離心30min，棄上清，用20mmol/L的硼酸鹽稀釋液(含1％BSA和0.1％疊氮鈉)將金標(biāo)抗體恢復(fù)至原體積的1/10，放置在4℃冰箱備用。

實施例6

試紙卡的生產(chǎn)和組裝。

硝酸纖維素膜(NC膜)的制備方法，將硝酸纖維素膜置于X-only單向噴點儀平臺上，檢測抗原放于A池，RaMIgG放于B池，展平壓緊，開機后將氧氟沙星-KLH檢測抗原和二抗分別點射于硝酸纖維素膜上，形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)。室溫自然干燥后，將其浸入封閉液(質(zhì)量濃度為1％的BSA的PBS緩沖液，pH 7.4)中30min，37℃烘干后，加入干燥劑，4℃密封保存。

結(jié)合墊的制備方法，將玻璃纖維棉裁成4mm寬的細(xì)條，放入含質(zhì)量濃度為5％的BSA，質(zhì)量濃度為2％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.8％的NaCl和質(zhì)量濃度為0.05％的NaN₃的PBS處理液中20min，37℃恒溫烘干，然后將金標(biāo)抗體灌注已處理好的玻璃纖維棉上，真空凍干4h，即為結(jié)合墊。

樣品墊的制備方法，玻璃纖維棉要用含質(zhì)量濃度為2％的BSA，質(zhì)量濃度為1％的蔗糖，質(zhì)量濃度為0.5％的硼酸鈉和質(zhì)量濃度為0.1％的NaN3的PBS處理后，干燥備用，即為樣品墊。

試紙卡的組裝，在支持板(PVC板)上，將NC膜、結(jié)合墊、樣品墊、吸收墊和膠膜等按一定工藝組裝在一起，用CM4000切割機制成4mm寬的試紙條。然后，按一定工藝將試紙條封裝于帶有加樣孔和觀察窗的特制的塑料盒體中，即為本發(fā)明的氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡，試紙卡的圖片見附圖3～5，其中1為卡殼，2為檢測區(qū)，3為底板，4為樣品墊，5為金標(biāo)墊，6為硝酸纖維素膜，7為吸水墊，8為點樣孔，9為觀察窗，10為質(zhì)控線(C線)，11為檢測線(T線)，12為膠膜，13為標(biāo)記線。

實施例7

本發(fā)明的氧氟沙星特異性免疫學(xué)檢測試紙卡樣品前處理過程：

(1)牛奶樣品：采集新鮮牛奶2ml放于10ml離心管中，以1000r/min離心10min，撥去上層脂肪層，吸取上層清液，用PBS稀釋10倍后，直接上樣檢測。

(2)雞蛋樣品：去除蛋殼，取蛋液2g于10ml離心管中，加入配制好的PBS緩沖液(pH 7.4)與甲醇的混合液(V:V＝1:1)充分勻漿，渦旋1min，后振蕩10min，以5000r/min離心10min，取上清液于潔凈離心管中，置于4度冰箱中保存，備檢。

(3)雞肉樣品：將雞肉組織樣品切碎、研磨后稱取5g樣本于20ml離心管中，再加入乙腈5ml，于旋渦儀渦動10min，6000r/min離心5min；取1ml上清液，加入4ml的樣品稀釋液振蕩搖勻1min；取100ml用于樣品分析。

將處理后的樣品溶液用滴管滴入試紙卡加樣孔內(nèi)3-4滴，3-5min即可觀察結(jié)果。

試紙卡以紅色印跡線“|”或“‖”作為檢測線的陽性和陰性標(biāo)記，即在硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)顯示一條紅色“|”印跡時，表示被檢測樣品溶液呈陽性；若硝酸纖維素膜上質(zhì)控線(C線)和檢測線(T線)同時出現(xiàn)兩條紅色“‖”印跡時，表示樣品溶液呈陰性。樣品的濃度為0.06ng/ml時，檢測線隱約出線。

由以上實施例可知，本發(fā)明提供的試紙卡，通過制備具有強免疫性的免疫原免疫動物篩選得到具有高親和力的抗氧氟沙星特異性單克隆抗體，所述單克隆抗體與包被原制備而成。因此，快速檢測試紙卡靈敏度高、特異性強，其檢測限可達(dá)0.06ng/ml。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。