利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法：利用Fmoc法合成“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列，并通過多肽序列的N端的半胱氨酸使該多肽與匙孔血藍蛋白偶聯(lián)得到完全抗原；用生理鹽水稀釋完全抗原，將稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑混合，然后加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液對兔子進行初次免疫，然后對兔子加強免疫，加強免疫使用的加強免疫抗原乳化液是由稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到；當(dāng)兔子血樣中的抗體的效價達到1/10000時，收集免疫后的兔子的血液，并使血塊充分收縮及抗血清完全析出，然后收集抗血清并離心處理得到上清液。
【專利說明】利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多克隆抗體制備方法，尤其涉及一種制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]家蠶是我國重要的經(jīng)濟昆蟲，以產(chǎn)生蠶絲為目的。蠶絲主要由絲素和絲膠兩種蛋白質(zhì)組成，但絲膠蛋白在繅絲過程中脫落，因此，絲織品、絲綢產(chǎn)品等中主要的成分是絲素蛋白。一方面，目前在紡織品市場，假冒絲綢產(chǎn)品較多，侵犯了消費者權(quán)益，嚴(yán)重影響了我國絲綢長期以來的良好聲譽，因此，有必要建立科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測分析方法。另一方面，在絲綢起源研究領(lǐng)域，也迫切需要更科學(xué)的分析方法，因為古代埋入墓葬或遺址中的絲織品隨著時間的推移，易受多種因素影響而遭到降解，外界的光照、酸、堿、微生物等環(huán)境因素，都會造成蠶絲蛋白質(zhì)發(fā)生變性和大分子鏈的斷裂，使之降解成肽段或氨基酸，因此利用傳統(tǒng)由天然蛋白質(zhì)大分子制備的抗體很難來檢測這樣已經(jīng)遭到破壞的抗原蛋白，這樣就很難來探尋絲綢的起源，且年代越早的證據(jù)越難尋覓。因此如何采用自然科學(xué)的先進手段，建立絲織品微痕檢測技術(shù)體系，從印痕、殘留物、土壤中提取古代絲綢的信息，對絲綢起源研究非常迫切。目前蛋白質(zhì)檢測的先進技術(shù)是基于抗體-抗原的Western Blotting或ELISA方法，但制備抗體常采用天然蛋白質(zhì)大分子，因此，無法滿足上述研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法。
[0004]為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:本發(fā)明利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法包括以下步驟:
步驟一:利用Fmoc法合成序列為“CGAG`AGSGAGAGS”的多肽，并通過所述多肽的N端的半胱氨酸使該多肽與載體匙孔血藍`蛋白(KLH)偶聯(lián)得到完全抗原；
步驟二:用生理鹽水稀釋所述完全抗原，將稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液對兔子進行初次免疫，然后對兔子進行加強免疫，加強免疫使用的是加強免疫抗原乳化液；所述加強免疫抗原乳化液是由所述稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到；當(dāng)兔子血樣中的抗體的效價達到1/10000時，收集免疫后的兔子的血液，并使血塊充分收縮及抗血清完全析出，然后收集抗血清并離心處理得到上清液。
[0005]進一步地，本發(fā)明在所述步驟二中，在配制初次免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合；在配制加強免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合。
[0006]進一步地，本發(fā)明在所述步驟二中，對兔子進行所述初次免疫的方法是:使用初次免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100 ul ；對兔子進行所述加強免疫的方法是:在初次免疫后的第2、4、6周分別進行一次加強免疫，每次加強免疫是使用加強免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100 ul。
[0007]進一步地，本發(fā)明在所述步驟二中，使血塊充分收縮及抗血清完全析出的方法是:將所收集的血液置室溫下讓其凝固，然后將凝固血液置于37°C溫箱內(nèi)放置30 min，再置于4 °C冰箱過夜。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果是:
(O本發(fā)明方法通過家蠶mori)絲素蛋白的特征多肽制備的多克隆抗體具有很強的特異性，經(jīng)ELISA法分析可知，該抗體與家蠶絲素蛋白具有明顯的免疫反應(yīng)，靈敏度很高，能夠用于檢測家蠶絲素蛋白，特別適合用于不完整絲素蛋白的檢測分析。
[0009](2)與傳統(tǒng)方法利用天然蛋白質(zhì)的大分子制備的抗體不同，本發(fā)明制備的抗體不僅能夠檢測完整的絲素蛋白，也能用于檢測諸如古代絲織品中已經(jīng)斷裂的絲素蛋白分子，從而為中國早期墓葬和遺址中的絲織品殘留物提供一種敏感特異快捷的辨識方法，為絲綢考古和起源分析提供新的科學(xué)證據(jù)，在考古、文物鑒定和其他科學(xué)研究中具有重要作用。
【具體實施方式】
[0010]在PubMeD (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/)上下載家香 QBombyxmori )絲素蛋白的重鏈(H-chain)氨基酸序列(如SEQ N0.1所示)。通過統(tǒng)計分析,確定“GAGAGSGAGAGS”多肽片段出 現(xiàn)頻率最高，合計170處，是家蠶絲素的特征多肽，故以此片段制備抗原。
[0011]以下具體說明本發(fā)明的制備方法。
[0012]完全抗原合成:
利用Fmoc法合成半抗原(即“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列)，在“CGAGAGSGAGAGS”多肽序列的N端添加半胱氨酸使該多肽與KLH偶聯(lián)。通過交聯(lián)劑的作用，“CGAGAGSGAGAGS” N端的半胱氨酸上的巰基和KLH伯胺形成共價鍵，從而將多肽和KLH偶聯(lián)起來，得到完全抗原。
[0013]用適量的生理鹽水稀釋完全抗原，然后將稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑按體積比1:1混合，加入鏈霉素、青霉素溶液進行乳化處理，得到初次免疫時所使用的抗原乳化液(即初次免疫抗原乳化液)。此外，將以上稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑按體積比1:1混合，加入鏈霉素、青霉素溶液進行乳化處理，則得到加強免疫時所使用的抗原乳化液(即加強免疫抗原乳化液)。
[0014]2.抗體制備:
選取2只大白兔(14-16周齡)進行初次免疫和加強免疫。免疫前先抽取兔耳血樣做對照。初次免疫是用初次免疫抗原乳化液對兔的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100ul.初次免疫后的第2周、4周、6周各加強免疫一次，每次加強免疫是用加強免疫抗原乳化液對兔的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100 ul。分別在第三次、四次免疫后的第10天靜脈取血檢測抗血清效價。
[0015]當(dāng)兔子血樣中的抗血清的效價達到1/10000時，殺死兔子收集血液，收集的大量血液置室溫下讓其凝固；將凝固血液置于37°c溫箱內(nèi)放置30 min，再置于4°C冰箱過夜，使血塊充分收縮及抗血清完全析出。收集抗血清，4°C 3000 g離心10 min，分裝上清液，放-70°C儲存?zhèn)溆谩?br> [0016]抗體純化:
利用免疫親和層析技術(shù)對抗血清進行純化。先將合成的半抗原(即多肽“CGAGAGSGAGAGS”)和層析填料 Sulfo-link-gel 進行交聯(lián)，使 “CGAGAGSGAGAGS” N 端的半胱氨酸封閉。用20ml、50mM、pH7.4的PBS對柱進行預(yù)處理，預(yù)處理的流速為60ml/h。用50mM、pH7.4的PBS將IOml的抗血清稀釋至20ml，稀釋后上樣。重復(fù)上樣一次。用20ml、50mM、ρΗ7.4的PBS對柱進行清洗，清洗的流速為60ml/h。用ρΗ3.0、0.IM的glycine-HCL對抗體進行洗脫。洗脫完成后用含50mM、pH7.4、含0.02%硫柳汞鈉的PBS洗滌多肽柱，得到純化后的抗體并于4°C儲存。
[0017]抗體特異性效果測定:抗原絲素蛋白以lug/ml的濃度包被，4°C包被過夜。將抗體分別稀釋20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍，50ul/孔的量上樣，37°C下溫育Ih0用TBST以200ul/孔洗滌2遍。酶標(biāo)二抗以1:5000稀釋使用，50ul/孔、37°C下溫育Ih0用TBST以200ul/孔洗滌3遍。以100 ul/孔加入TMB于陰暗處顯色，顯色IOmin后，以IOOul/孔加入2M的H2SO4終止。用酶標(biāo)儀測定OD450值。根據(jù)OD45tl值，對抗原抗體的結(jié)合等情況進行判斷。當(dāng)OD45tl值達到陽性標(biāo)準(zhǔn)時就可以確定樣品中含有絲素；若樣品中不含絲素，則OD45tl值就會低于陽性標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)此就可以快速判斷絲素的存在。
[0018]結(jié)果分析:結(jié)果顯示除空白對照呈無色外，樣品孔均呈現(xiàn)黃色。用酶標(biāo)儀測定OD45tl值結(jié)果為:對純化后的抗體進行20000倍、10000倍、5000倍、1000倍、200倍稀釋后得到的OD450 值分別為 2.006、1.840、2.149、2.339、2.445，空白對照的 OD450 值為 0.054。按照平臺OD45tl值達到0.6為陽性的要求，即使將制備的抗體稀釋20000倍，仍能夠檢測到絲素蛋白的陽性信號，顯色清晰，結(jié)`果明確。從以上結(jié)果可以說明，由本發(fā)明方法制備的抗體對絲素的反應(yīng)靈敏度極高，所需的抗原量極少，且操作簡便，投入小，宜大規(guī)模推廣利用。
【權(quán)利要求】
1.一種利用特征多肽制備家蠶絲素蛋白特異抗體的方法，其特征是，包括以下步驟: 步驟一:利用Fmoc法合成序列為“CGAGAGSGAGAGS”的多肽，并通過所述多肽的N端的半胱氨酸使該多肽與匙孔血藍蛋白偶聯(lián)得到完全抗原； 步驟二:用生理鹽水稀釋所述完全抗原，將稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到初次免疫抗原乳化液，使用初次免疫抗原乳化液對兔子進行初次免疫，然后對兔子進行加強免疫，加強免疫使用的是加強免疫抗原乳化液；所述加強免疫抗原乳化液是由所述稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑混合，然后再加入鏈霉素和青霉素溶液進行乳化處理得到；當(dāng)兔子血樣中的抗體的效價達到1/10000時，收集免疫后的兔子的血液，并使血塊充分收縮及抗血清完全析出，然后收集抗血清并離心處理得到上清液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:在所述步驟二中，在配制初次免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合；在配制加強免疫抗原乳化液時，稀釋后的完全抗原與不完全弗氏佐劑是按體積比1:1進行混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:在所述步驟二中，對兔子進行初次免疫的方法是:使用初次免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100ul ； 對兔子進行加強免疫的方法是:在初次免疫后的第2、4、6周分別進行一次加強免疫，每次加強免疫是使用加強免疫抗原乳化液對兔子的后大腿和皮下進行多點注射，每只注射100 Ulo
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是:在所述步驟二中，使血塊充分收縮及抗血清完全析出的方`法是:將所收集的血液置室溫下讓其凝固，然后將凝固血液置于37°C溫箱內(nèi)放置30 min，再置于4°C冰箱過夜。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是:在所述步驟二中，使血塊充分收縮及抗血清完全析出的方法是:將所收集的血液置室溫下讓其凝固，然后將凝固血液置于37°C溫箱內(nèi)放置30 min，再置于4°C冰箱過夜。
【文檔編號】C07K16/06GK103509107SQ201310342720
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月7日
【發(fā)明者】鄭秦, 吳小鋒, 鄭海玲, 周旸 申請人:浙江大學(xué), 中國絲綢博物館