本發(fā)明屬于蛋白質分離技術領域，涉及一種基于混合模式的擴張床吸附分離人血白蛋白方法。

背景技術：

人血白蛋白是人體血漿中含量最豐富的蛋白質，約占血漿蛋白60％，主要生理功能是維持血漿滲透壓，結合以及運輸營養(yǎng)物質。臨床用于治療失血性休克、創(chuàng)傷性休克、急性血容量減少和低白蛋白血癥等。還可作為細胞培養(yǎng)的添加成分、藥物輔劑、賦形劑等，具有廣泛的應用價值。

臨床使用的人血白蛋白產品主要是從人源血漿中提取純化，制備方法包括冷乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、利凡諾沉淀、辛酸鹽沉淀等，過程繁雜，且不能排除病毒或其它潛在致病因子的影響。利用現(xiàn)代生物技術構筑表達重組人血白蛋白的酵母細胞，可避免病毒感染，解決血源供應緊張等問題，具有良好的應用前景。但是，藥用人血白蛋白的純度要求高，而酵母發(fā)酵液組分復雜，含有蛋白酶、雜蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及熱原物質等多種雜質，必須采用多步層析方法才能去除。

酵母發(fā)酵液，一般先要去除酵母細胞，然后取上清液進行后續(xù)分離純化。專利CN1127299A和US5521287利用加熱、稀釋、調酸、陽離子交換層析、疏水作用層析、金屬螯合層析、陰離子交換層析、硼酸鈣沉淀等步驟，得到純度較高的人血白蛋白。專利CN1934128A公開了一種在二價陽離子存在下通過加熱處理制備人血白蛋白的方法，可選擇性凝集來源于宿主的雜質。專利CN1406246A中公開了包括加熱處理步驟的人血白蛋白的制造方法，通過在宿主細胞蛋白等電點附近pH下進行加熱處理，可有效去除宿主細胞蛋白。專利US5962649用陽離子交換擴張床吸附替代陽離子交換層析，可以處理含酵母細胞的發(fā)酵液，縮短了工藝。不過，蛋白捕獲階段采用陽離子交換方法，料液需要調酸至pH 4.0和稀釋，酸性環(huán)境容易激活蛋白酶，導致人血白蛋白的降解，稀釋使得目標物濃度下降，吸附容量降低，處理量增大，過程時間延長。針對酵母發(fā)酵液的特點，提高人血白蛋白的捕獲效率，開發(fā)一種無需去除酵母吸附、近中性pH下吸附、高選擇性、具有耐鹽吸附特性的分離新方法，將有助于簡化人血白蛋白的分離工藝，提高效率，節(jié)約成本。

擴張床吸附利用獨特設計的擴張床和吸附劑，在向上液流的作用下床層適度膨脹，吸附劑顆粒形成穩(wěn)定的分級分布，細胞或細胞碎片等固體小顆粒可以直接穿過床層，而目標物被吸附劑捕獲。擴張床吸附突破了常規(guī)層析的局限性，可以直接處理含固體顆粒的復雜料液，實現(xiàn)從細胞培養(yǎng)液中直接捕獲目標物，將固液分離、濃縮和初步純化集成于一個單元，減少分離步驟，提高分離效率?；旌夏Ｊ綄游鍪且环N新型的生物分離技術，配基兼有多種功能基團，可以與目標蛋白產生多種相互作用，主要是疏水和靜電相互作用?；旌夏Ｊ轿絼┑呐浠芏韧ǔ］^高，吸附容量大，具有耐鹽吸附特性，可以通過靜電相吸來強化吸附，也可以通過靜電排斥來協(xié)助解吸，洗脫條件溫和，特別適合于大規(guī)模的分離純化，已在抗體等蛋白的分離純化中得到應用。本發(fā)明充分結合擴張床吸附和混合模式層析的特點，篩選合適的混合模式擴張床吸附劑，直接從酵母發(fā)酵液中捕獲人血白蛋白，開發(fā)一種基于混合模式的擴張床吸附分離人血白蛋白方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種基于混合模式的擴張床吸附分離人血白蛋白方法，具體包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5～20mM，68℃加熱30min滅活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附劑裝填到擴張床中，平衡緩沖液預平衡，達到1.8～2.5倍膨脹率，保持20分鐘；

3)調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上樣到擴張床中，平衡緩沖液沖洗，沖洗緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

4)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母、漢遜酵母或釀酒酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液；所述的混合模式吸附劑的基質為添加有增重劑的多孔微球，增重劑包括石英砂、鈦白粉、碳化鎢粉末，多孔微球包括瓊脂糖微球、纖維素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附劑的功能配基為色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羥基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.0～6.0；所述的沖洗緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值為7.0～8.0；所述的洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3.5～4.5；所述的步驟3)中的沖洗緩沖液的沖洗體積為5-20倍柱體積；所述的步驟1)中酵母發(fā)酵液pH值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的pH調節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

本發(fā)明針對酵母發(fā)酵液組分復雜、pH中性、電導較高的特點，結合擴張床吸附和混合模式層析的優(yōu)勢，采用混合模式擴張床吸附劑直接處理含酵母細胞的發(fā)酵液，充分利用擴張床吸附直接處理含細胞料液的特點，以及混合模式吸附容量大、選擇性好、具有耐鹽特性、洗脫條件溫和等優(yōu)勢，簡化分離步驟，提高分離效率，得到一個從酵母發(fā)酵液中擴張床吸附直接分離人血白蛋白的新方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于：1)采用獨特的擴張床吸附模式，發(fā)酵液無需去除酵母細胞，直接用于人血白蛋白分離，簡化預處理步驟，提高分離效率；2)采用特殊的混合模式吸附劑，對人血白蛋白的吸附選擇性高，單步層析純度高達95％以上，宿主細胞蛋白和色素去除率達90％左右；3)在pH 5.0～6.0條件下實現(xiàn)吸附，減小酸性環(huán)境下蛋白酶對人血白蛋白的降解；4)具有耐鹽吸附的特性，料液無需調節(jié)離子強度，直接上樣；5)利用靜電排斥作用實現(xiàn)有效洗脫，洗脫條件溫和，人血白蛋白的回收率達到85％以上；6)吸附容量大，過程處理量大，工藝簡單，易于放大。

附圖說明

附圖1是本發(fā)明混合模式擴張床吸附分離人血白蛋白的高效液相色譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種基于混合模式的擴張床吸附分離人血白蛋白方法。取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，加入辛酸鈉，加熱，滅活蛋白酶，直接通過混合模式擴張床進行分離，得到人血白蛋白。本發(fā)明方法得到的人血白蛋白純度大于95％。

從酵母發(fā)酵液中直接分離人血白蛋白的方法包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5～20mM，68℃加熱30min滅活蛋白酶，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)混合模式吸附劑裝填到擴張床中，平衡緩沖液預平衡，達到1.8～2.5倍膨脹率，保持20分鐘；

3)調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0～6.0，上樣到擴張床中，平衡緩沖液沖洗，沖洗緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

4)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母、漢遜酵母或釀酒酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液；所述的混合模式吸附劑的基質為添加有增重劑的多孔微球，增重劑包括石英砂、鈦白粉、碳化鎢粉末，多孔微球包括瓊脂糖微球、纖維素微球、聚丙烯酰胺微球；所述的混合模式吸附劑的功能配基為色氨酸及其衍生物，包括L-色氨酸、L-色氨酸甲酯、L-色氨酸乙酯、5-羥基-L-色氨酸、N-乙酰-L-色氨酸、色胺和4-(1H-吲哚-2-基)苯胺等；所述的平衡緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH值為5.0～6.0；所述的沖洗緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，pH值為7.0～8.0；所述的洗脫緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液或檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值為3.5～4.5；所述的步驟3)中的沖洗緩沖液的沖洗體積為5-20倍柱體積；所述的步驟1)中酵母發(fā)酵液pH值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的pH調節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的描述，實施例中除特殊說明外所有pH調節(jié)溶液均為乙酸或氫氧化鈉：

實施例1

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至5mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附劑(添加石英砂為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到2.0倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.3％，收率為89.6％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.2％和89.0％。其中附圖1是本發(fā)明混合模式擴張床吸附分離人血白蛋白的高效液相色譜圖。

實施例2

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至10mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加鈦白粉為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸甲酯為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到1.8倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗5倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 3.5)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為95.0％，收率為86.7％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.5％和89.1％。

實施例3

取含有重組人血白蛋白的漢遜酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加碳化鎢為增重劑的瓊脂糖微球、L-色氨酸乙酯為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 6.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液預平衡，達到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至6.0，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH 8.0)沖洗15倍柱體積，20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.1％，收率為89.2％，宿主蛋白和色素去除率分別為89.7％和90.1％。

實施例4

取含有重組人血白蛋白的漢遜酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附劑(添加石英砂為增重劑的聚丙烯酰胺微球、5-羥基-L-色氨酸為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗20倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為97.7％，收率為90.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為91.3％和92.2％。

實施例5

取含有重組人血白蛋白的釀酒酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至10mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加碳化鎢為增重劑的聚丙烯酰胺微球、N-乙酰-L-色氨酸為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到2.0倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.5)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.5％，收率為91.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為89.3％和93.1％。

實施例6

取含有重組人血白蛋白的釀酒酵母發(fā)酵液，調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至20mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液。混合模式吸附劑(添加石英砂為增重劑的纖維素微球、色胺為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到2.5倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.5，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH7.0)沖洗10倍柱體積，20mM乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫10倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為95.4％，收率為85.6％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.3％和89.2％。實施例7

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，用檸檬酸或氫氧化鈉調節(jié)pH至6.0，加入辛酸鈉至15mM，68℃加熱30min，得到人血白蛋白粗品溶液?；旌夏Ｊ轿絼?添加石英砂為增重劑的聚丙烯酰胺微球、4-(1H-吲哚-2-基)苯胺為配基)裝填到內徑為1cm的擴張床中，柱高約20cm，pH 5.0乙酸-乙酸鈉緩沖液預平衡，達到2.2倍膨脹率，保持20分鐘；調節(jié)人血白蛋白粗品溶液的pH至5.0，上樣10ml。經平衡緩沖液沖洗5倍柱體積，20mM磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 7.0)沖洗10倍柱體積，20mM檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0)洗脫15倍柱體積，收集洗脫Ⅱ組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，HPLC分析純度為96.7％，收率為85.5％，宿主蛋白和色素去除率分別為90.6％和90.2％。