本發(fā)明涉及多肽合成領(lǐng)域，特別涉及一種以片段法固液結(jié)合制備替度魯肽的方法。
背景技術(shù)：
替度魯肽，英文名稱為Teduglutide，由33個(gè)天然氨基酸組成，可減少胃排空和分泌，并調(diào)節(jié)小腸內(nèi)膜細(xì)胞的生長、增殖和修復(fù)，是一種天然生成的激素，在臨床上用于治療成人短腸綜合征，其肽序?yàn)椋篐-His-Gly-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。
目前，替度魯肽的制備方法有以下報(bào)道；專利CN104072603A先合成替度魯肽2-33位氨基酸片段，而后采用特殊保護(hù)基保護(hù)的His進(jìn)行1位偶聯(lián)，該方法減少了1位His的消旋雜質(zhì)生成，但與逐個(gè)氨基酸偶聯(lián)的方法無異，固相合成步數(shù)多，溶劑用量大，三廢嚴(yán)重；專利CN104418949A公開的替度魯肽合成方法是將肽序分為兩段，先合成1-3位和4-33位氨基酸片段，而后再偶聯(lián)而成，該方法降低了合成過程中3-Asu雜質(zhì)的生成，但并未解決長肽鏈合成后期偶聯(lián)困難，粗肽純度不高，工藝雜質(zhì)繁多的問題；專利CN104072605A采取了片段法進(jìn)行替度魯肽合成，先將肽鏈分為三個(gè)片段，再將三個(gè)片段偶聯(lián)得替度魯肽，粗肽純度有較大的改善，但片段法成本太大，且片段純化費(fèi)時(shí)費(fèi)力，工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)時(shí)成本不可控，且該專利在進(jìn)行片段法合成時(shí)，并未針對性的控制特殊雜質(zhì)，例如1-His消旋，3-Asu雜質(zhì)。
替度魯肽是由33個(gè)氨基酸組成的多肽，從固相合成的角度而言，肽鏈較長，隨著肽鏈的延伸偶聯(lián)反應(yīng)會較為困難，容易產(chǎn)生較多工藝雜質(zhì)而不利于后期純化。目前存在的替度魯肽固相合成方法主要分為兩類，其一為針對性控制重點(diǎn)雜質(zhì)，但忽視了長肽鏈偶聯(lián)困難，粗肽純度不高，工藝雜質(zhì)繁多，溶劑用量巨大的問題；其二為著重解決長鏈偶聯(lián)困難而采用片段法合成，但并未對重點(diǎn)雜質(zhì)進(jìn)行針對性控制，導(dǎo)致后期純化困難，總體收率不高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決替度魯肽合成中存在的以上缺陷，本發(fā)明提供了一種片段法固液結(jié)合制備替度魯肽的新方法。具體技術(shù)方案如下：
一種片段法固液結(jié)合制備替度魯肽的方法，包括如下步驟：
(a)液相條件下合成所需短肽片段：Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Gly-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Met-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Ile-OH；
(b)以Wang Resin或CTC樹脂為固相載體，在偶聯(lián)劑存在下，依次與Fmoc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Gly-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-OH，
得側(cè)鏈保護(hù)的替度魯肽肽樹脂，其結(jié)構(gòu)如下：
Fmoc-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(OtBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-Resin；
(c)替度魯肽肽樹脂經(jīng)過裂解，純化，凍干得到替度魯肽精肽。
其中步驟(a)中，
Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制備方法為：首先將Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-His(Trt)-OSu，然后將生成的Fmoc-His(Trt)-OSu和H-Gly-OH在堿A條件下生成Fmoc-His(Trt)-Gly-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu，然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Gly-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH；
Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Ser(tBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Ser(tBu)-OSu，然后將生成的Fmoc-Ser(tBu)-OSu和H-Phe-OH在堿A條件下生成Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH；
Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Glu(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-OSu，然后將生成的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu和H-Met-OH在堿A條件下生成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH；
Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-OSu，然后將生成的Fmoc-Thr(tBu)-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu，最后將生成的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH；
Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-OSu，然后將生成的Fmoc-Asn(Trt)-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu，將生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu和H-Ala-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu，將生成的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu和H-Ala-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH；
Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Asp(OtBu)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-OSu，然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu和H-Phe-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu，然后將生成的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH；
Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Trp(Boc)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-OSu，然后將生成的Fmoc-Trp(Boc)-OSu和H-Leu-OH在堿A條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu,最后將生成的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH；
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制備方法為：首先將Fmoc-Lys(Boc)-OH和HOSu在DCC條件下生成Fmoc-Lys(Boc)-OSu，然后將生成的Fmoc-Lys(Boc)-OSu和H-Ile-OH在堿A條件下生成Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH。
優(yōu)選的，步驟(a)中二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的具體制備方法為：
步驟1)首先制備Fmoc-His(Trt)-OSu：將Fmoc-His(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-His(Trt)-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-His(Trt)-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去80％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-His(Trt)-OSu。
步驟2)制備二肽片段Fmoc-His(Trt)-Gly-OH：將H-Gly-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶，完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟1)中制備Fmoc-His(Trt)-OSu的有機(jī)溶劑B溶液滴加到H-Gly-OH的溶液中，其中H-Gly-OH的摩爾量為Fmoc-His(Trt)-OSu的1.2～1.5倍；TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束后減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑B，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH。
其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種；有機(jī)溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、丙酮、乙腈中的一種或幾種。
優(yōu)選的，步驟(a)中三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制備方法為：
步驟1)首先制備Fmoc-Thr(tBu)-OSu：將Fmoc-Thr(tBu)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去80％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-OSu；
步驟2)然后制備Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH：將H-Ile-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶，完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟1)中制備的Fmoc-Thr(tBu)-OSu有機(jī)溶劑B溶液滴加入至H-Ile-OH溶液中，其中，H-Ile-OH的摩爾量為Fmoc-Thr(tBu)-OSu摩爾量的1.2～1.5倍，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸發(fā)去掉有機(jī)溶劑B后，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH；
步驟3)Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制備方法為：將步驟2)中的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-Thr(tBu)-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去60％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu；
步驟4)三肽片段Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH制備方法為：
將H-Leu-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶；完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟3)中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的有機(jī)溶劑B溶液滴加入H-Leu-OH溶液中，其中，H-Leu-OH的摩爾量為Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu摩爾量的1.2～1.5；TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑B后，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH。
其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種。有機(jī)溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、丙酮、乙腈中的一種或幾種。
優(yōu)選的，步驟(a)中四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH制備方法為，
步驟1)制備Fmoc-Asn(Trt)-OSu：將Fmoc-Asn(Trt)-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去80％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-OSu；
步驟2)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH：將H-Leu-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶。完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟1)中的Fmoc-Asn(Trt)-OSu的有機(jī)溶劑B溶液滴加入至H-Leu-OH溶液中，其中，H-Leu-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-OSu摩爾量的1.2～1.5倍；TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸發(fā)去掉有機(jī)溶劑B后，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH；
步驟3)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu：將步驟2)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h；反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去80％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu；
步驟4)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH：將H-Ala-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶。完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟3)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的有機(jī)溶劑B溶液滴加入至H-Ala-OH溶液中，其中，H-Ala-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu摩爾量的1.2～1.5倍；TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束，減壓蒸發(fā)去掉有機(jī)溶劑B后，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH；
步驟5)制備Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu：將步驟4)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH和HOSu按照1:1.0-1.2的物質(zhì)量比例溶于有機(jī)溶劑B中，冰水浴下將1.0-1.2倍物質(zhì)量的DCC/有機(jī)溶劑B(以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的量計(jì))溶液滴加到Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH/HOSu溶液中，1h內(nèi)滴加完畢，撤冰浴，25℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液濃縮，減壓蒸去60％的有機(jī)溶劑，剩余油狀物加入石油醚，直至上層溶液不再變白為止，析出白色固體，抽濾，干燥，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu；
步驟6)四肽片段Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備：將H-Ala-OH和堿A按照摩爾比1:1～2的比例溶解在水中，加入5～20％體積的有機(jī)溶劑B助溶；完全溶解后，冰浴攪拌下將步驟5)中的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的有機(jī)溶劑B溶液滴加入H-Ala-OH溶液中，其中，H-Ala-OH的摩爾量為Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu摩爾量的1.2～1.5倍。TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)，待反應(yīng)結(jié)束減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑B后，再以10％的檸檬酸/水將反應(yīng)液pH值調(diào)至2～3，乙酸乙酯萃取，析晶得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH。
其中以上步驟中堿A為碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀中的一種。有機(jī)溶劑B為四氫呋喃、二氧六環(huán)、丙酮、乙腈中的一種或幾種。
其中步驟(b)中，以Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH投料偶聯(lián)30～31位，以Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH投料偶聯(lián)25～27，以Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH投料偶聯(lián)21～23位，以Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH投料偶聯(lián)16～19位，以Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH投料偶聯(lián)12～14位，以Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH投料偶聯(lián)9～10位，以Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH投料偶聯(lián)5～6位，以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH投料偶聯(lián)3～4位，以Fmoc-His(Trt)-Gly-OH投料偶聯(lián)1～2位。
步驟(b)中，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-Ile-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Met-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Gly-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-OH的摩爾投料比為樹脂的3～5倍，其余單個(gè)氨基酸的摩爾投料比為樹脂的2～3倍。
步驟(b)中的Wang Resin或CTC Resin初始替代度為0.3～0.5mmol/g，改造后樹脂替代度為0.25～0.45mmol/g，改造后樹脂優(yōu)選替代度為0.30～0.35mmol/g；步驟(b)中偶聯(lián)劑為HOBt/DIC，HOAt/DIC，HOBt/HBTU/DIEA，HOAt/HATU/DIEA，PyBOP/DIEA，TBTU/DIEA中的一種或幾種；步驟(c)中的裂解試劑為加入體積比1-5％清除劑的TFA溶液，所述清除劑為苯甲醚、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯酚、水中的一種或幾種。
相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果是：
1、本申請將替度魯肽中所有不帶功能側(cè)鏈的氨基酸Ile，Leu，Ala，Phe，Met，Gly做成二肽，三肽，及四肽片段，將固相合成步數(shù)由33步降低為19步，使31位，27位，26位，23位，22位，19位，18位，17位，14位，13位，10位，6位，4位，2位這些位點(diǎn)的固相偶聯(lián)效率達(dá)到了百分之百，提高了目標(biāo)肽純度，粗肽純度達(dá)到70％以上，同時(shí)避免了這些位點(diǎn)缺失肽的形成，降低了工藝雜質(zhì)的個(gè)數(shù)，提升了后期純化的效率，最終收率達(dá)到45.08％。
2、1位2位以Fmoc-His(OH)-Gly-OH的方式進(jìn)行投料，從原料角度上杜絕了1位His的消旋雜質(zhì)的產(chǎn)生；3位4位以Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的方式投料，同樣從原料角度上避免了引入3-Asu雜質(zhì)。
3、固相偶聯(lián)步數(shù)由33步縮短至19步，大大降低固相合成中溶劑的用量，降低了物料成本，減少了三廢排放。
4、選取Ile，Leu，Ala，Phe，Met，Gly這些不含側(cè)鏈功能基團(tuán)的氨基酸進(jìn)行短肽片段的合成，結(jié)合成熟的HOSu/DCC偶聯(lián)方法，可大大降低片段液相合成的成本，能夠應(yīng)用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。
說明書和權(quán)利要求書中所使用的縮寫含義如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
CTC樹脂 2-氯三苯甲基氯樹脂
Wang Resin 王樹脂
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
DCM 二氯甲烷
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
DIEA N,N-二異丙基乙胺
DIC N,N-二異丙基碳二亞胺
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTU O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HOBT 1-羥基苯并三唑
HOAT 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑
TFA 三氟乙酸
HOSu N-羥基琥珀酰亞胺
EA 乙酸乙酯
THF 四氫呋喃
PE 石油醚
DCC 二環(huán)己基碳二亞胺
具體實(shí)施方式
下面用具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不限定本專利；根據(jù)本發(fā)明改變原料的投料比，或是反應(yīng)溶劑或及縮合劑等，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
實(shí)施例1：Fmoc-His(Trt)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-His(Trt)-OH 1239.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-His(Trt)-OSu 1340.4g，收率93.5％。
實(shí)施例2：Fmoc-His(Trt)-Gly-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例1中制備的Fmoc-His(Trt)-OSu(1290.2g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，剩余油狀物加入2000ml甲醇，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中靜置過夜，析出大量白色固體，抽濾，干燥得Fmoc-His(Trt)-Gly-OH 916.1g，收率75.2％。
實(shí)施例3：Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml乙睛中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml乙睛中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu937.8g，收率92.3％。
實(shí)施例4：Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Gly-OH 202.7g(2.7mol)和碳酸鉀447.7g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例3中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.42g,1.8mol)的乙睛溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去乙睛，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，剩余油狀物加入2000ml甲醇，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中靜置過夜，析出大量白色固體，抽濾，干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH 686.6g，收率81.5％。
實(shí)施例5：Fmoc-Ser(tBu)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Ser(tBu)-OH 766.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六環(huán)中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml二氧六環(huán)中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Ser(tBu)-OSu884.2g，收率92.1％。
實(shí)施例6：Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸氫鈉272.16g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例5中制備的Fmoc-Ser(tBu)-OSu(864.9g,1.8mol)的二氧六環(huán)溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去二氧六環(huán)，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮至3000ml，加入石油醚4000ml析晶，得Fmoc-Ser(tBu)-Phe-OH 838.2g，收率85.6％。
實(shí)施例7：Fmoc-Glu(OtBu)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Glu(OtBu)-OH 850.9g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml二氧六環(huán)中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml二氧六環(huán)中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Glu(OtBu)-OSu 941.7g，收率90.2％。
實(shí)施例8：Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Met-OH 402.3g(2.7mol)和碳酸氫鉀324.5g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例7中制備的Fmoc-Glu(OtBu)-OSu(940.6g,1.8mol)的二氧六環(huán)溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去二氧六環(huán)，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮至4000ml，加入石油醚4000ml析晶，得Fmoc-Glu(OtBu)-Met-OH 832.6g，收率83.2％。
實(shí)施例9：Fmoc-Thr(tBu)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 794.6g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml丙酮中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml丙酮中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Thr(tBu)-OSu910.9g，收率92.2％。
實(shí)施例10：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ile-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例9中制備的Fmoc-Thr(tBu)-OSu(1248.7g,1.8mol)的丙酮溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去丙酮，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油狀物加入2000ml甲醇復(fù)溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 773.8g，收率84.3％。
實(shí)施例11：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例10中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OH 765.2g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml丙酮中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml丙酮中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至3000～3500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu 812.2g，收率89.2％。
實(shí)施例12：Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Leu-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例11中制備的Fmoc-Thr(tBu)-Ile-OSu(728.4g,1.2mol)的丙酮溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去丙酮，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加熱至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH 607.1g，收率81.2％。
實(shí)施例13：Fmoc-Asn(Trt)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Asn(Trt)-OH 1193.4g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asn(Trt)-OSu 1279.3g，收率92.2％。
實(shí)施例14：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Leu-OH354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例13中制備的Fmoc-Asn(Trt)-OSu(1248.7g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油狀物加入2000ml甲醇復(fù)溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1100.2g，收率86.1％。
實(shí)施例15：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例14中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OH 1063.9g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至3000～3500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu 1079.6g，收率89.2％。
實(shí)施例16：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ala-OH 160.2g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例15中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-OSu(968.28g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加熱至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 760.1g，收率81.1％。
實(shí)施例17：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例16中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OH 702.9g(0.9mol)和HOSu 103.5g(0.9mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 185.7g(1.5mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至3000～3500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu 704.9g，收率89.2％。
實(shí)施例18：Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ala-OH 93.5g(1.05mol)和碳酸鈉133.5g(1.26mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例17中制備的Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-OSu(614.6g,0.7mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加熱至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH 510.5g，收率85.6％。
實(shí)施例19：Fmoc-Asp(OtBu)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 822.3g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asp(OtBu)-OSu 926.6g，收率91.2％。
實(shí)施例20：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Phe-OH 483.3g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例19中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-OSu(914.4g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，剩余油狀物加入2000ml甲醇復(fù)溶，溶液澄清透明，置于-20℃冰箱中析晶，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 877.2g，收率85.2％。
實(shí)施例21：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例20中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OH 858.3g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至3000～3500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu 915.2g，收率91.2％。
實(shí)施例22：Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例21中制備的Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-OSu(802.8g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加熱至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH 676.6g，收率82.3％。
實(shí)施例23：Fmoc-Trp(Boc)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Trp(Boc)-OH 1053.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Trp(Boc)-OSu 1135.3g，收率91.6％。
實(shí)施例24：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Leu-OH 354.2g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例23中制備的Fmoc-Trp(Boc)-OSu(1115.5g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸濃縮除去乙酸乙酯，加入2500ml甲醇復(fù)溶，溶液澄清，置于-20℃析晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 905.1g，收率78.6％。
實(shí)施例25：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例24中制備的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OH 896.4g(1.5mol)和HOSu 172.5g(1.5mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 309.6g(1.5mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu 1096.3g，收率90.2％。
實(shí)施例26：Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ile-OH 235.8g(1.8mol)和碳酸鈉228.9g(2.16mol)溶于2000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例25中制備的Fmoc-Trp(Boc)-Leu-OSu(932.5g,1.2mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取，合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸除去乙酸乙酯，加入3500ml甲醇，加熱至40℃溶液澄清透明，置于-20℃析晶，得Fmoc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH 725.5g，收率81.6％。
實(shí)施例27：Fmoc-Lys(Boc)-OSu的制備
準(zhǔn)確稱取Fmoc-Lys(Boc)-OH 937.2g(2mol)和HOSu 230g(2mol)溶于4000ml四氫呋喃中，冰水浴攪拌。準(zhǔn)確稱取DCC 412.8g(2mol)，溶于2400ml四氫呋喃中，緩慢滴加到上述溶液中，冰浴攪拌1h后25度繼續(xù)反應(yīng)2h。反應(yīng)完成后抽濾，濾液旋蒸濃縮至2000～2500ml。濃縮完成后抽濾，濾液加入8000ml石油醚，析出大量白色固體，溶液-20度冰箱靜置1h。靜置后抽濾，濾餅以2000ml乙酸乙酯溶解，加入6000ml石油醚，溶液澄清。置于-20度冰箱中，2h后析出大量白色固體，抽濾，濾餅干燥，稱重，得Fmoc-Lys(Boc)-OSu 1036.8g，收率92.3％。
實(shí)施例28：Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH的制備
準(zhǔn)確稱取H-Ile-OH 355.6g(2.7mol)和碳酸鈉343.4g(3.24mol)溶于4000mL水中，冰浴下(2～8℃)緩慢加入實(shí)施例28中制備的Fmoc-Lys(Boc)-OSu(1010.3g,1.8mol)的四氫呋喃溶液3000ml，攪拌反應(yīng)，TLC監(jiān)測反應(yīng)終點(diǎn)。反應(yīng)完全后，減壓旋蒸除去四氫呋喃，剩余水溶液抽濾后冰水浴下加入10％的檸檬酸水溶液調(diào)溶液pH值至2～3，8000ml乙酸乙酯分三次萃取,合并有機(jī)相，以3000ml飽和食鹽水分三次洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋蒸抽去乙酸乙酯，新加入2000ml四氫呋喃復(fù)溶，加入4000ml石油醚析晶，得Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH 871.2g，收率83.2％。
實(shí)施例29:Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin的合成
稱取30.0g(Sub＝0.47mmol/g)Wang Resin置于固相反應(yīng)器，以DMF洗滌樹脂兩次，200ml/次，重新加入DCM 200ml溶脹樹脂30min。樹脂溶脹的同時(shí)，稱取Fmoc-Asp(OtBu)-OH 17.38g(42.3mmol,3eq),HOBt 6.28g(46.5mmol,3.3eq)，以150ml體積比為1:1的DMF和DCM的混合溶液溶解，冰浴10min，加入DIC 7.25ml(46.5mmol,3eq)活化5min。樹脂溶脹及氨基酸活化完成后，投料反應(yīng)，氮?dú)鈹嚢瑁?0min后加入DMAP 0.51g(4.23mmol,0.3eq)，繼續(xù)反應(yīng)5h。5h后，抽掉反應(yīng)液，DMF洗滌樹脂4次，200ml/每次；DCM洗滌樹脂2次，200ml/次。加入封端試劑180mL(50ml乙酸酐和42.5ml吡啶溶解于87.5mL DMF中)將剩余未反應(yīng)羥基乙?；?h。反應(yīng)完成后抽濾反應(yīng)液，分別以DMF，DCM，甲醇洗滌樹脂3次，200ml/次，真空干燥后得Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 36.7g，改造后替代度為0.31mmol/g。
實(shí)施例30:Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin的合成
稱取CTC樹脂30.0g(sub＝0.40mmol/g)置于合成柱中，用200mL DMF洗滌兩次,加入200mL DCM溶脹30min；抽去DCM后，加入溶有9.86g(24mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH的DCM/DMF(3/1,體積比)溶液100ml，N2攪拌5min后加入DIPEA 4.0ml(24mmol)，繼續(xù)鼓N2攪拌反應(yīng)60min。反應(yīng)完成后抽掉反應(yīng)液，加入DCM/CH3OH/DIPEA(體積比17：2：1)混合溶液封端3次，每次200ml，反應(yīng)10min；然后用DMF、DCM、甲醇分別洗滌3次，真空干燥得Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 37.1g，測改造后替代度為0.30mmol/g。
實(shí)施例31：替度魯肽肽樹脂的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例29中制備的替代度為0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-Wang Resin 32.25g(合成規(guī)模10mmol)置于固相反應(yīng)器中，DMF洗滌樹脂2次，150ml/次，加入150ml DCM溶脹30min；樹脂溶脹完畢后以20％的哌啶/DMF脫Fmoc 2次，150ml/次，分別反應(yīng)5min和10min；脫保護(hù)完成后以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測，樹脂呈深藍(lán)色。
稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol，3eq)，HOBt 4.05g(30mmol，3eq)，以120ml體積比為1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10min，加入DIC 4.68ml(30mmol，3eq)活化5min?；罨瓿珊笸读戏磻?yīng)，氮?dú)鈹嚢?h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測結(jié)果為準(zhǔn)，檢測反應(yīng)完成后，抽濾除去反應(yīng)液，以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，200ml/次。以20％的哌啶/DMF脫Fmoc 2次，150ml/次，分別反應(yīng)5min和10min；脫保護(hù)完成后以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測，樹脂呈深藍(lán)色，32位Thr偶聯(lián)完成。
按照32位Thr的偶聯(lián)方法，依照替度魯肽肽序，依次連接氨基酸及短肽片段：
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Gly-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-OH。肽樹脂合成結(jié)束后，依次以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌3次，200ml/次，樹脂25度真空干燥8h，稱重得96.33g。
實(shí)施例32：替度魯肽肽樹脂的制備
準(zhǔn)確稱取實(shí)施例30中制備的替代度為0.31mmol/g的Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin 33.33g(合成規(guī)模10mmol)置于合成柱中，DMF洗滌樹脂2次，150ml/次，加入150ml DCM溶脹30min；樹脂溶脹完畢后以20％的哌啶/DMF脫Fmoc 2次，150ml/次，分別反應(yīng)5min和10min；脫保護(hù)完成后以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測，樹脂呈深藍(lán)色。
稱取Fmoc-Thr(tBu)-OH 11.91g(30mmol，3eq)，HOBt 4.05g(30mmol，3eq)，以120ml體積比為1:1的DMF，DCM溶液溶解，冰水浴10min，加入DIC 4.68ml(30mmol，3eq)活化5min?；罨瓿珊笸读戏磻?yīng)，氮?dú)鈹嚢?h，反應(yīng)終點(diǎn)以Kaiser試劑檢測結(jié)果為準(zhǔn)，檢測反應(yīng)完成后，抽濾除去反應(yīng)液，以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，200ml/次。以20％的哌啶/DMF脫Fmoc 2次，150ml/次，分別反應(yīng)5min和10min；脫保護(hù)完成后以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，150ml/次。取小樣以Kaiser試劑檢測，樹脂呈深藍(lán)色，32位Thr偶聯(lián)完成。
按照32位Thr的偶聯(lián)方法，依照替度魯肽肽序，依次連接氨基酸及短肽片段：
Fmoc-Lys(Boc)-Ile-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-Leu-Ile-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Phe-Ile-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-Ile-Leu-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(OtBu)-Met-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-Phe-OH，F(xiàn)moc-Asp(OtBu)-Gly-OH，F(xiàn)moc-His(Trt)-Gly-OH。肽樹脂合成結(jié)束后，依次以DMF洗滌4次，DCM洗滌2次，甲醇洗滌3次，200ml/次，樹脂25度真空干燥8h，稱重得92.12g。
實(shí)施例33：替度魯肽粗肽的制備
將實(shí)施例31所制備的替度魯肽肽樹脂90g置于2000ml圓底燒瓶中，冰浴預(yù)冷。配置裂解試劑900ml，其體積比為TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O＝82.5:5:5:2.5:5，置于-20冰箱中預(yù)冷30min。按照1g樹脂10ml的比例將裂解試劑加入到肽樹脂中，冰水浴攪拌2h，25度攪拌2h，停止反應(yīng)后抽濾，樹脂以TFA洗滌兩次，100ml/次，合并濾液，緩慢傾倒至9L預(yù)冷的乙醚中，攪拌，置于-20冰箱中靜置1h。將乙醚沉降液離心，并以乙醚洗滌六次，離心所得固體干燥，得39.88g，收率106.3％。取粗肽樣品分析，純度為73.1％。
實(shí)施例34：替度魯肽粗肽的制備
將實(shí)施例32所制備的替度魯肽肽樹脂90g置于1000ml圓底燒瓶中，冰浴預(yù)冷。配置裂解試劑900ml，其體積比為TFA:PhSC:Phenol:EDT:H2O＝82.5:5:5:2.5:5，置于-20冰箱中預(yù)冷30min。按照1g樹脂10ml的比例將裂解試劑加入到肽樹脂中，冰水浴攪拌2h，25度攪拌2h，停止反應(yīng)后抽濾，樹脂以TFA洗滌兩次，100ml/次，合并濾液，緩慢傾倒至9L預(yù)冷的乙醚中，攪拌，置于-20冰箱中靜置1h。將乙醚沉降液離心，并以乙醚洗滌六次，離心所得固體干燥，得34.33g，收率91.5％。取粗肽樣品分析，純度為71.3％。
實(shí)施例35：替度魯肽粗肽的純化
稱取實(shí)施例33所得粗肽10.0g，以500ml 5％的乙腈/水溶解，超聲助溶，0.45um濾膜過濾。內(nèi)徑為100mm的C18制備柱，流動相A為0.1％TFA/水，流動相B為0.1％TFA/乙腈，上樣量為10g/針，流速300ml/min，檢測波長210nm。梯度洗脫，峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣，得到中控分析純度為98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水體系轉(zhuǎn)鹽后凍干得替度魯肽精肽4.23g，純度99.5％以上，總收率45.08％。
實(shí)施例36：替度魯肽粗肽的純化
稱取實(shí)施例34所得粗肽10.0g，以500ml 5％的乙腈/水溶解，超聲助溶，0.45um濾膜過濾。內(nèi)徑為100mm的C18制備柱，流動相A為0.1％TFA/水，流動相B為0.1％TFA/乙腈，上樣量為10g/針，流速300ml/min，檢測波長210nm。梯度洗脫，峰前和峰后循環(huán)進(jìn)樣，得到中控分析純度為98.5％以上的精肽溶液；以醋酸/乙腈/水體系轉(zhuǎn)鹽后凍干得替度魯肽精肽4.19g，純度99.5％以上，總收率38.36％。