本發(fā)明屬于多肽合成技術(shù)領域，具體涉及一種通過片段法合成艾塞那肽的方法。

背景技術(shù)：

艾塞那肽是一種含有39個氨基酸的活性多肽，氨基酸序列為：

H₂N-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-CONH₂，是GLP-1的類似物，能夠刺激胰島β細胞再生，促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素的釋放，具有控制血糖功效，艾塞那肽注射液通過減少2型糖尿病患者空腹和餐后血糖濃度，從而改善血糖控制。

艾塞那肽的制備方法目前主要采用傳統(tǒng)經(jīng)典的固相多肽合成法，此法合成效率低、純化成本高。

因此，開發(fā)一種高效率低成本合成艾塞那肽的方法成為本領域急需解決的技術(shù)問題。

張騰在《精細化工》，2014年10月公開艾塞那肽的合成，該合成方法將艾塞那肽分成六個片段進行固相合成法，該方法中使用了傳統(tǒng)的多肽合成碳端酰胺化，并使用價格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的方案，成本較高。片段數(shù)量較多，合成成本較高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種效率高、成本低、易流程化、易規(guī)?；钠畏ê铣砂请牡姆椒?，其克服了傳統(tǒng)經(jīng)典的固相多肽合成法合成長肽效率低、純化成本高的缺點。

具體來說，本發(fā)明提供了一種艾塞那肽的固相、液相相結(jié)合的合成方法，將艾塞那肽的39個氨基酸分成H-Ser(tBu)-CONH₂和3個全保護片段，先分別合成H-Ser(tBu)-CONH₂和3段全保護片段，再將H-Ser(tBu)-CONH₂和3段全保護片段依次進行液相片段組裝連接，得到側(cè)鏈保護的艾塞那肽，然后切割處理，得到艾塞那肽粗品，粗品經(jīng)純化得到艾塞那肽產(chǎn)品。

更具體來說，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。

一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過H-Ser(tBu)-CONH₂以及如下三個片段的全保護片段制備得到His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-COOH，Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-COOH，Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH。

其中，所述全保護的片段為Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH，F(xiàn)moc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH。

其中，所述制備方法包括如下步驟：

(1)片段合成

合成H-Ser(tBu)-CONH₂和3個全保護片段；

(2)片段組裝連接以及切割得到產(chǎn)品

將步驟(1)制備得到H-Ser(tBu)-CONH₂和3個全保護片段按照艾塞那肽的氨基酸序列進行液相片段組裝連接，得到氮端和側(cè)鏈保護的艾塞那肽，然后切割處理，得到艾塞那肽粗品，經(jīng)純化得到艾塞那肽產(chǎn)品。

其中，所述H₂N-Ser(tBu)-CONH₂的制備方法如下：將Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑與N,N-二異丙基碳二亞胺按照摩爾比為1:(2-4):(2-4)在有機溶劑中進行反應得到反應混合液，在該反應混合液中加入四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液的混合液，之后分離、純化得到產(chǎn)品；

其中，所述Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑和N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:3:3；所述四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液的體積比為1:(0.5-1.5)，優(yōu)選為1:1；所述有機溶劑為二氯甲烷。

其中所述全保護片段的是通過Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin制備得到的，其中所述Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin是以2-chlorotrityl chloride resin為原料制備得到。

其中所述全保護片段的制備方法包括如下步驟：

(1)氨基酸的連接：將N端氨基酸形成Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin結(jié)構(gòu)，之后依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸形成氨基酸鏈的2-CTC Resin結(jié)構(gòu)；所述N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的氨基酸表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH；以及

(2)切割處理：將步驟(1)得到的氨基酸鏈的2-CTC Resin結(jié)構(gòu)進行切割得到所述全保護片段。

其中，所述Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH

的制備方法如下：

將Fmoc-Pro-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH后得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin；對其切割得到所述產(chǎn)品；

所述Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH的制備方法如下：

將Fmoc-Gly-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH、Fomc-Ala-OH、Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin，經(jīng)切割得到所述產(chǎn)品；

所述Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH的制備方法如下：

將Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC Resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Phe-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH，得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，經(jīng)切割得到所述產(chǎn)品。

其中，所述Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin的制備方法為：將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺反應得到，其中所述2-chlorotrityl chloride Resin與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4。

其中，所述依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸(結(jié)構(gòu)為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH)的反應條件為：將Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin脫Fmoc，后加入N,N-二甲基甲酰胺、待連接的Fmoc-氨基酸(保護基)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺反應得到Fmoc-氨基酸(保護基)-2-CTC Resin；

其中，所述待連接的各個Fmoc-氨基酸(保護基)-OH與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比分別均為(1.5-2.5):1，優(yōu)選該比例為2:1；1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比(2-4):(2-4):(2-4):1，優(yōu)選摩爾比為3:3:3:1。

其中，所述脫Fmoc的條件是用體積比為1:4的哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的混合液進行脫Fmoc。

其中，所述片段組裝連接以及切割得到產(chǎn)品的方法包括如下步驟：

(1)制備H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

將摩爾比為1:(1.03～1.07)的H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺在N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液中進行反應，經(jīng)分離、純化得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；將Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂用N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液溶解，加入哌啶并使哌啶與N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液的體積比為1:(3-5)，進行反應，后進行分離、純化得到H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；

(2)制備Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

將步驟(1)得到的H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH以摩爾比均為1:(1.03～1.07)的比例按照步驟(1)相同的方法連接得到H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；然后將得到的H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH以摩爾比為1:(1.03～1.07)的比例按照步驟(1)相同的方法連接得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；以及

(3)切割、純化獲得產(chǎn)品

將步驟(2)得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂加入切割液中反應，經(jīng)分離、純化得到艾塞那肽粗品，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽。

其中，步驟(1)中，所述N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液各成分的體積比為1:(0.5-1.5):(0.5-1.5)，優(yōu)選各成分的體積比為1:1:1；所述H₂N-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:(5-7):(5-7)，優(yōu)選該摩爾比為1:6:6；所述步驟(2)中，H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:(5-7):(5-7)，優(yōu)選該摩爾比為1:6:6；H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:(5-7):(5-7)，優(yōu)選該摩爾比為1:6:6。

其中，所述切割液為質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的混合溶液。

一種所述制備方法制備得到的艾塞那肽產(chǎn)品，其純度高于98％。

再具體來說，本發(fā)明提供一種艾塞那肽的固相片段合成方法，包括下述步驟：

(1)合成H₂N-Ser(tBu)-CONH₂

將Fmoc-Ser(tBu)-OH和1-羥基苯丙三唑加入燒瓶中，加入二氯甲烷，開啟攪拌，加入N,N-二異丙基碳二亞胺攪拌反應2小時，向反應液中加入四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液體積比為1:1的混合液繼續(xù)反應2小時，然后再向反應液中加入飽和食鹽水，至析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到H₂N-Ser(tBu)-CONH₂；

(2)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH

①合成Fmoc-Pro-2-CTC Resin

將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，加入二氯甲烷、Fmoc-Pro-OH、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌1小時，得到Fmoc-Pro-2-CTCResin；

②合成Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin

將Fmoc-Pro-2-CTC Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，加入N,N-二甲基甲酰胺、Fmoc-Pro-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌2小時，得到Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin；

③合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin

按照步驟②的方法向Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin；

④切割處理

向Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin中加入切割液，常溫攪拌1.5小時，過濾，將濾液用等體積的飽和食鹽水洗滌3次，加入切割液2倍體積的飽和食鹽水，碳酸氫鈉飽和溶液調(diào)pH＝7，35℃旋蒸濃縮，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH；

上述的切割液是三氟酸與二氯甲烷的體積比為1:99的混合液；

(3)合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH

按照步驟(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride resin上連接Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-2-CTC Resin，再按照步驟(2)中②的方法向Fmoc-Gly-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH、Fomc-Ala-OH、Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin，F(xiàn)moc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin按照步驟(2)中④的方法進行切割處理，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH；

(4)合成Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH

按照步驟(2)中①的方法，向2-chlorotrityl chloride Resin上連接Fomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC Resin，再按照步驟(2)中②的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Phe-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH，得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步驟(2)中④的方法進行切割處理，得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH；

(5)液相片段合成艾塞那肽

①組裝連接合成H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

將步驟(1)和(2)得到的H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH與1-羥基苯丙三唑加入N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液溶解，加入N,N-二異丙基碳二亞胺攪拌反應12小時，向反應液加入2倍體積的飽和食鹽水，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂，將Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂用N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液溶解，加入哌啶并使哌啶與N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液的體積比為1:4，反應40分鐘，向反應液加入2倍體積的飽和食鹽水，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；

②組裝連接合成H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

按照步驟(5)中①的組裝連接方法，向H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂連接Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH，得到H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；

③組裝連接合成Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

按照步驟(5)中①的組裝連接方法，向H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂連接Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，得到

④切割得到艾塞那肽

將步驟③得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂加入質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液中，常溫攪拌反應2小時，將反應液加入冷乙醚中，析出沉淀，過濾，乙醚洗滌2次，室溫真空干燥4小時，得到艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽。

其中所述的步驟(1)中，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH和1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:3:3。

其中所述的步驟(2)的①中，2-chlorotrityl chloride Resin與Fmoc-Pro-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4。

其中所述的步驟(2)的②、③中，F(xiàn)moc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比均為2:1，2-chlorotrityl chloride Resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:3。

所述的步驟(5)的①中，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH的摩爾比均為1:1.03～1.07，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:6:6。

所述的步驟(5)的②中，H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH的摩爾比均為1:1.03～1.07，H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:6:6。

所述的步驟(5)的③中，H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂和Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH的摩爾比均為1:1.03～1.07，H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:6:6。

本發(fā)明有益效果如下：

1.本發(fā)明克服了現(xiàn)有固相合成艾塞那肽使用高成本的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin的不利因素，使用低成本的2-chlorotrityl chloride resin克服了合成成本高、規(guī)?；щy的問題，有效的降低了合成成本，提高了合成效率，為解決艾塞那肽合成規(guī)?；?，降低了合成成本提供了一種新方法。

2.棄用了傳統(tǒng)的多肽合成碳端酰胺化使用價格昂貴的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的方案，先選擇碳端氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH為原料合成H2N-Ser(tBu)-CONH2的低成本方案，優(yōu)先解決多肽合成碳端酰胺化問題，可使成本降低30％-50％。

3.本發(fā)明最大限度的減少了片段數(shù)量，使唯一使用的成本較高的2-chlorotrityl chloride resin的使用量盡可能的減少以降低成本，同時兼顧片段的溶解性。并在此基礎上最大限度的減少合成步驟。

4.在氮端片段的合成中直接選用Boc-His(Trt)-OH而放棄使用Fmoc-His(Trt)-OH可以減少氮端片段合成時的處理步驟。

5.組裝階段采用低成本的液相合成法，相對于固相組裝處理量可大幅提高，提高了生產(chǎn)效率。

6.本發(fā)明不僅避免使用成本較高的原料，而且簡化了合成工藝，從而可以將總體成本降低40％-60％，合成步驟大幅的減少，也可大幅提高生產(chǎn)效率。

附圖說明

圖1是實施例1合成的艾塞那肽的質(zhì)譜圖。

圖2是實施例1合成的艾塞那肽的液相色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。

下面對說明書中的簡寫進行說明：

2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂

Fmoc：9-笏亞甲氧羰基

pbf、OtBu、Trt、Boc、tBu都是保護基，名稱分別是2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；⑹宥⊙趸?、三苯甲基、叔丁氧羰基、叔丁基。

本發(fā)明所述“全保護片段”是指對氨基酸中影響合成的基團進行保護后得到具有保護基的片段。

本發(fā)明提供一種艾塞那肽的制備方法，所述方法通過H-Ser(tBu)-CONH₂以及如下三個片段的全保護片段制備得到His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-COOH，Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-COOH，Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH。這是發(fā)明人對該序列分析并結(jié)合各個氨基酸的性質(zhì)，同時考慮到合成的成本，在各個因素之間進行選擇和實驗獲得的結(jié)果，及對39個氨基酸的位置進行拆分為如上所述的四個片段。上述選擇是發(fā)明人創(chuàng)造性勞動的結(jié)果，H-Ser(tBu)-CONH2的合成方案可以避免使用高成本的Rink Amide-AM Resin或Rink Amide-MBHA Resin等氨基樹脂的不利因素，有效降低成本；

其中所述全保護的片段為Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，F(xiàn)moc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH，F(xiàn)moc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH。上述三個序列中各個氨基酸側(cè)鏈保護選擇的保護基可以是與Fmoc有正交保護效果的任意保護基，只要能夠達到所希望的可以保護的技術(shù)效果即可，但發(fā)明人經(jīng)過優(yōu)選上述取代基效果最好。

選擇Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH作為三個全保護片段的碳端及Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Met-OH作為二個全保護片段的氮端是兼顧氨基酸作為碳端和氮端的反應活性以利于片段的組裝反應，同時兼顧斷點的選擇以平衡全保護片段的長度、溶解性、數(shù)量，這樣可以有效減少合成步驟、提高效率、降低成本；Boc-His(Trt)-OH在氮末端的使用可以減少組裝完成后的處理步驟。

所述制備方法包括如下步驟：

(1)片段合成

合成H-Ser(tBu)-CONH₂和3個全保護片段；

在一種具體實施方式中，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂的制備方法如下：將Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑與N,N-二異丙基碳二亞胺按照摩爾比為1:(2-4):(2-4)在有機溶劑中進行反應得到反應混合液，在該反應混合液中加入四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液的混合液，之后分離、純化得到產(chǎn)品；優(yōu)選所述Fmoc-Ser(tBu)-OH、1-羥基苯丙三唑和N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比為1:3:3；所述四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液的體積比為1:(0.5-1.5)，優(yōu)選為1:1；所述有機溶劑為二氯甲烷。在制備過程中各個物質(zhì)之間的比例可以進行適當調(diào)節(jié)，獲得的產(chǎn)品仍舊能夠滿足要求，因此，對制備過程中的各個物質(zhì)之間的比例進行適當調(diào)整也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。例如：在一般的固相多肽合成中，如果以樹脂為基準取1，那么氨基酸和其它試劑的使用量都要過量，一般會取1.8-3倍，如出現(xiàn)難反應的步驟加量可能更高，1.8-3倍是一個經(jīng)濟的加量。

(2)片段組裝連接以及切割得到產(chǎn)品

將步驟(1)制備得到H-Ser(tBu)-CONH₂和3個全保護片段按照艾塞那肽的氨基酸序列進行液相片段組裝連接，得到側(cè)鏈保護的艾塞那肽，然后切割處理，得到艾塞那肽粗品，經(jīng)純化得到艾塞那肽產(chǎn)品。

其中所述全保護片段的制備方法包括如下步驟：

(1)氨基酸的連接：將N端氨基酸形成Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin結(jié)構(gòu)，之后依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸形成氨基酸鏈的2-CTC Resin結(jié)構(gòu)；所述N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH；

該步驟是氨基酸鏈增長的步驟，本發(fā)明中的Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin結(jié)構(gòu)是Fmoc-Pro-2-CTC Resin、Fmoc-Gly-2-CTC Resin和Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC Resin，所述依次連接的N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸，即表示為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH結(jié)構(gòu)的可以是Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH、Fomc-Ala-OH、Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，F(xiàn)omc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Phe-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH。

所述Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin的制備方法為：將2-chlorotrityl chloride resin用二氯甲烷溶脹后，與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺反應得到，其中所述2-chlorotrityl chloride Resin與Fmoc-氨基酸-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:1:4。

上述制備Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin的方法中使用的原料是2-chlorotrityl chloride Resin，其價格相對低廉，從而在原料上降低了成本。所述2-chlorotrityl chloride Resin，其名稱為2-氯三苯甲基氯樹脂，本發(fā)明使用的是取代度為0.75mmol/g，但其他取代度的2-chlorotrityl chloride Resin也可以達到相同或類似的技術(shù)效果，也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。2-chlorotrityl chloride Resin的取代度可以是現(xiàn)有商品化的所有取代度，本發(fā)明使用的取代度0.75mmol/g是從合成片段的產(chǎn)率、純度、樹脂的利用率等因素平衡的最佳取值。

所述依次連接N端被Fmoc保護的，支鏈也被保護的羥基氨基酸(結(jié)構(gòu)為Fmoc-氨基酸(保護基)-OH)的反應條件為：將Fmoc-氨基酸-2-CTCResin脫Fmo，后加入N,N-二甲基甲酰胺、待連接的Fmoc-氨基酸(保護基)-OH、1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟，硼酸、N,N′-二異丙基乙胺反應得到Fmoc-氨基酸(保護基)-2-CTC Resin；

其中所述待連接的各個Fmoc-氨基酸(保護基)-OH與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比分別均為(1.5-2.5):1，優(yōu)選該比例為2:1；1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺與2-chlorotrityl chloride Resin的摩爾比(2-4):(2-4):(2-4):1，優(yōu)選摩爾比為3:3:3:1。

所述脫Fmoc的條件是用體積比為1:4的哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的混合液進行脫Fmoc。該步驟中各個物質(zhì)的投料量均是以制備Fmoc-氨基酸-2-CTC Resin結(jié)構(gòu)過程中加入的2-chlorotrityl chloride resin作為參比，通過這種控制有助于對投料量有效控制，從而達成保持產(chǎn)品品質(zhì)，同時控制成本。

(2)切割處理：將步驟(1)得到的氨基酸鏈的2-CTC Resin結(jié)構(gòu)進行切割得到所述全保護片段。

具體來說三個片段的合成方法分別如下：

將Fmoc-Pro-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH后得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin；對其切割得到所述產(chǎn)品Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH；

將Fmoc-Gly-2-CTC Resin上依次連接Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fomc-Trp-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fomc-Val-OH、Fomc-Ala-OH、Fomc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin，經(jīng)切割得到所述產(chǎn)品Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH；

將Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC Resin上依次連接Fomc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fomc-Phe-OH、Fomc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Boc-His(Trt)-OH，得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，經(jīng)切割得到所述產(chǎn)品Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。

所述片段組裝連接以及切割得到產(chǎn)品的方法包括如下步驟：

(1)將摩爾比為1:(1.03～1.07)的H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺在N,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液中進行反應，經(jīng)分離、純化得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；將Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂用N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液溶解，加入哌啶并使哌啶與N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的混合液的體積比為1：4進行反應，后進行分離、純化得到H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；然后將其與Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH以摩爾比均為1:(1.03～1.07)的比例按照相同的方法連接得到H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；然后再將其與Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH以摩爾比為1:(1.03～1.07)的比例按照相同的方法連接得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；以及

(3)切割、純化獲得產(chǎn)品

將步驟(2)得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂加入切割液中反應，經(jīng)分離、純化得到艾塞那肽粗品，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到艾塞那肽。

另外，本發(fā)明還提供所述制備方法制備得到的艾塞那肽產(chǎn)品，其純度高于98％。

實施例

下面對實施例中使用的各個物質(zhì)的來源進行說明，如果沒有特別說明，所使用的原料和儀器均是商購獲得，是本領域常規(guī)使用儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

固相多肽合成反應器為通用的多肽合成反應器，可以購自成都斯諾進出口貿(mào)易有限公司的CS936X CSBio Peptide Synthesizer。

本發(fā)明的2-chlorotrityl chloride resin的取代度為0.75mmol/g，均由天津南開和成科技有限公司。

分析型高效液相色譜儀為日立全自動L2000。

制備型高效液相色譜儀為創(chuàng)新恒通LC3000，C18分析色譜柱為大連物理化學研究所4.6mm×250mm，C18制備色譜柱為成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。

所用各型氨基酸及1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺購自上海吉爾生化有限公司。

LTQ-XL電噴霧電離質(zhì)譜儀為美國Thermo Finnigan公司。

哌啶、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮、二氯甲烷、三氟乙酸、苯酚、苯甲硫醚、三異丙基硅烷等其它試劑均為國產(chǎn)AR或CP。

實施例1

艾塞那肽的制備方法

1、合成H₂N-Ser(tBu)-CONH₂

將2.80gFmoc-Ser(tBu)-OH和2.96g1-羥基苯丙三唑加入燒瓶中，加入60mL二氯甲烷，開啟攪拌，加入3.5mL N,N-二異丙基碳二亞胺攪拌反應2小時，向反應液中加入四氫呋喃與氨的甲醇飽和溶液體積比為1:1的混合液60mL繼續(xù)反應2小時，然后再向反應液中加入飽和食鹽水，至析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，每次20mL，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到1.02gH₂N-Ser(tBu)-CONH₂；

2、合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH

(1)、合成Fmoc-Pro-2-CTC Resin

將12.0g 2-chlorotrityl chloride resin加入反應器中，加入60mL二氯甲烷浸泡樹脂30分鐘，使樹脂充分溶脹，抽濾除去二氯甲烷，向反應器中加入60mL二氯甲烷、3.04g Fmoc-Pro-OH、6.3mL N,N′-二異丙基乙胺，2-chlorotrityl chloride resin與Fmoc-Pro-OH、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比為1:1:4，在氮氣保護下，常溫攪拌反應1小時，抽濾，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次60mL，得到Fmoc-Pro-2-CTC Resin。

(2)合成Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin

將Fmoc-Pro-2-CTC Resin用哌啶與N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:4的混合液脫Fmoc-兩次，每次60mL，加入60mL N,N-二甲基甲酰胺、6.08g Fmoc-Pro-OH、3.65g 1-羥基苯丙三唑、8.67g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、4.8mL N,N′-二異丙基乙胺，在氮氣保護下，常溫攪拌反應2小時，得到Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin；

(3)合成Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin

按照步驟(2)的方法向Fmoc-Pro-Pro-2-CTC Resin上依次連接6.08gFmoc-Pro-OH、5.60gFmoc-Ala-OH、5.35gFmoc-Gly-OH、6.90gFmoc-Ser(tBu)-OH、6.90gFmoc-Ser(tBu)-OH、6.08gFmoc-Pro-OH、5.35g Fmoc-Gly-OH，其他試劑的用量為：3.65g1-羥基苯丙三唑、8.67g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、4.8mLN,N′-二異丙基乙胺，用異丙醇和N,N-二甲基甲酰胺各洗滌樹脂2次，每次60mL，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin。

上述的Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH與2-chlorotrityl chloride resin的摩爾比均為2:1，2-chlorotrityl chloride resin與1-羥基苯丙三唑、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸、N,N′-二異丙基乙胺的摩爾比1:3:3:3。

(4)、切割處理

向Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-2-CTC Resin中加入切割液120mL，常溫攪拌1.5小時，過濾，將濾液用飽和食鹽水洗滌3次，每次120mL，加入切割液2倍體積的飽和食鹽水240mL，碳酸氫鈉飽和溶液調(diào)PH＝7，35℃旋蒸濃縮，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到7.18gFmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH。

上述的切割液是三氟酸與二氯甲烷的體積比為1:99的混合液。

3、合成Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向10.0g2-chlorotrityl chloride resin上連接2.23gFmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-2-CTC Resin，再按照步驟2中(2)的方法向Fmoc-Gly-2-CTC Resin上依次連接8.95gFmoc-Asn(Trt)-OH、7.03gFmoc-Lys(Boc)-OH、5.30gFmoc-Leu-OH、6.40gFomc-Trp-OH、6.38gFmoc-Glu(otBu)-OH、5.30gFmoc-Ile-OH、5.81gFmoc-Phe-OH、5.30gFmoc-Leu-OH、9.73gFmoc-Arg(pbf)-OH、5.09gFomc-Val-OH、4.67gFomc-Ala-OH、6.38gFomc-Glu(otBu)-OH、6.38gFmoc-Glu(otBu)-OH、6.38gFmoc-Glu(otBu)-OH、5.57gFomc-Met-OH，得到Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin，F(xiàn)moc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-2-CTC Resin按照步驟2中(4)的方法進行切割處理，得到20.19gFmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH。

4、合成Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH

按照步驟2中(1)的方法，向10.0g2-chlorotrityl chloride Resin上連接4.58gFomc-Gln(Trt)-OH，得到Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC Resin，再按照步驟2中(2)的方法向Fmoc-Gln(Trt)-2-CTC resin上依次連接7.03gFomc-Lys(Boc)-OH、5.75gFmoc-Ser(tBu)-OH、5.30gFmoc-Leu-OH、6.17gFmoc-Asp(otBu)-OH、5.75gFmoc-Ser(tBu)-OH、5.96gFomc-Thr(tBu)-OH、5.81gFomc-Phe-OH、5.96gFomc-Thr(tBu)-OH、4.46gFmoc-Gly-OH、6.38gFmoc-Glu(otBu)-OH、4.46gFmoc-Gly-OH、7.46gBoc-His(Trt)-OH，得到Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin，Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-2-CTC Resin按照步驟2中(4)的方法進行切割處理，得到16.14gBoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH。

5、液相片段合成艾塞那肽

(1)組裝連接合成H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

將步驟1和2得到的0.97g H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和7.13g Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH與5.73g1-羥基苯丙三唑加入80mLN,N-二甲基甲酰胺與二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液中溶解，加入6.7mLN,N-二異丙基碳二亞胺攪拌反應12小時，向反應液加入160mL飽和食鹽水，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂，F(xiàn)moc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂用80mL N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液溶解，加入20mL哌啶并使哌啶與N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、N-甲基吡咯烷酮的體積比為1:1:1的混合液的體積比為1:4，反應40分鐘，向反應液加入160mL飽和食鹽水，析出沉淀，抽濾，用水洗滌2次，收集沉淀，45℃真空干燥4小時，得到5.23gH₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂。

上述的H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH的摩爾比均為1:1.07，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:7:7。

(2)、組裝連接合成H₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

按照步驟(1)的組裝連接方法，向5.23g H₂N-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂連接16.49g Fmoc-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-COOH，得到17.49gH₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；

(3)、組裝連接合成Boc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂

按照步驟(1)的組裝連接方法，向17.49gH₂N-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂連接12.00gBoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-COOH，得到22.82gBoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂；

(4)、切割得到艾塞那肽

將步驟(3)得到22.82gBoc-His(Trt)-Gly-Glu(otBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(otBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Met-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Glu(otBu)-Ala-Val-Arg(pbf)-Leu-Phe-Ile-Glu(otBu)-Trp-Leu-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Gly-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser(tBu)-CONH₂加入110mL質(zhì)量百分比組成為三氟乙酸83％、苯酚5％、苯甲硫醚4％、水3％、三異丙基硅烷5％的切割液中，常溫攪拌反應2小時，將反應液加入700mL冷乙醚中，析出沉淀，過濾，乙醚洗滌2次，每次110mL，室溫真空干燥4小時，得到17.26g艾塞那肽粗品，艾塞那肽粗品經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到白色、易溶于水固體4.34g，即艾塞那肽。

采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果見圖1，由圖可見，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致，說明合成產(chǎn)物為艾塞那肽。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，液相色譜圖見圖2，由圖2可見，艾塞那肽的純度大于98％。

實施例2

本實施的步驟5中，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH的摩爾比均為1:1.03，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:6:6，該步驟的其他步驟與實施例1相同，得到艾塞那肽粗品16.89g，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到4.22g艾塞那肽，采用實施例1相同的條件對產(chǎn)品采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。

實施例3

本實施的步驟5中，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂和Fmoc-Gly-Pro-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-COOH的摩爾比均為1:1.05，H₂N-Ser(tBu)-CONH₂與1-羥基苯丙三唑、N,N-二異丙基碳二亞胺的摩爾比1:6:6，該步驟的其他步驟與實施例1相同，得到艾塞那肽粗品17.08g，經(jīng)反相色譜純化、冷凍干燥，得到4.40g艾塞那肽，采用實施例1相同的條件對產(chǎn)品采用質(zhì)譜儀對合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行表征，所合成的產(chǎn)物的分子量及分子離子峰與艾塞那肽的分子量及分子離子峰一致。采用液相色譜儀對合成的艾塞那肽進行純度測定，純度大于98％。