一種艾塞那肽衍生物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及治療性多肽領(lǐng)域，具體涉及新型長(zhǎng)效艾塞那肽衍生物及其制備方法， 同時(shí)還涉及這些衍生物的醫(yī)療用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 艾塞那肽是一種從美洲希拉巨蜥（Heloderma suspectum)唾液中分離得到的含有 39個(gè)氨基酸的天然多肽激素，序列結(jié)構(gòu)為：
[0003] HGEGT5FTSDL1CISKQME15EEAVR 2〇LFIEW25LKNGG3〇PSSGA35PPPS，與 GLP-1 有 53 % 的序列 同源性，不但具有類似GLP-1促胰島素分泌的功能，而且其體內(nèi)穩(wěn)定性也遠(yuǎn)高于GLP-1。根 據(jù)艾塞那肽的這一特點(diǎn)，美國(guó)Amylin公司和Eli Lilly公司聯(lián)合開(kāi)發(fā)了化學(xué)合成藥物艾塞 那肽，又稱Exenatide，商品名Byetta。Byetta是世界上首個(gè)腸促胰島素類似物藥物。于 2005年4月經(jīng)美國(guó)FDA比準(zhǔn)上市。研究表明，艾塞那肽不僅能很好的控制血糖，還可促進(jìn) 胰島細(xì)胞的新生和增值，減少0細(xì)胞凋亡，改善0細(xì)胞功能，具有非常明顯的臨床應(yīng)用優(yōu) 勢(shì)。此外，臨床研究中發(fā)現(xiàn)艾塞那肽還能夠減慢胃腸排空的速度，使人沒(méi)有饑餓感而減少攝 入食物，從而減輕體重。
[0004] 艾塞那肽需要每天注射兩次，在臨床使用中非常不方便。為了解決這一問(wèn)題，目前 已有許多研究，通過(guò)對(duì)艾塞那肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，來(lái)延長(zhǎng)其在體內(nèi)的藥效作用時(shí)間。比如，通 過(guò)其氨基酸側(cè)鏈進(jìn)行聚乙二醇化修飾，或與長(zhǎng)鏈脂肪酸偶聯(lián)，來(lái)延長(zhǎng)其半衰期；或者開(kāi)發(fā)艾 塞那肽緩釋微球制劑等。這些方法雖然能夠延長(zhǎng)藥效作用時(shí)間，但是改造后分子往往存在 藥效降低、副作用增加等問(wèn)題，因而需要開(kāi)發(fā)能夠有效延長(zhǎng)藥效時(shí)間，同時(shí)具有更好的活性 與療效的新的艾塞那肽衍生物。
[0005] 通過(guò)對(duì)艾塞那肽與其受體蛋白GLP-1R的結(jié)合方式與結(jié)合位點(diǎn)的研究表明，艾塞 那肽序列從Leu 1(l到Asn 28形成一段兩親性a -螺旋結(jié)構(gòu)，位于疏水面的Val 19Phe22、lie23、 Leu26與GLP-1R的疏水空腔相互作用，位于親水面的Arg 2°、Lys27通過(guò)氫鍵與GLP-1R相互 作用，這些氨基酸殘基是重要的活性位點(diǎn)。艾塞那肽這種a-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于保持其生物活 性極為重要。然而化學(xué)合成的多肽通常都是一段無(wú)序的結(jié)構(gòu)，很難保持其在生理?xiàng)l件下的 二級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，通過(guò)發(fā)展合適的化學(xué)修飾方法，來(lái)穩(wěn)定合成多肽的a-螺旋結(jié)構(gòu)，一方面 可以增強(qiáng)其與受體的親和力，另一方面，還能大幅提升多肽的抗蛋白水解能力，這種方法在 多肽藥物改造方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。通常可以通過(guò)在多肽序列合適的位置側(cè)鏈成 環(huán)的方式來(lái)穩(wěn)定多肽的a -螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈一般在多肽a -螺旋的同一面上，側(cè)鏈氨基酸的 位置一般為i/i+3, i/i+4, i/i+7, i/i+11等，其中應(yīng)用較多的是i/i+4和i/i+7。
[0006] 本發(fā)明以艾塞那肽為模板，通過(guò)用Cys替換i/i+4位置上的氨基酸，然后通過(guò)連接 臂側(cè)鏈成環(huán)的策略，來(lái)穩(wěn)定艾塞那肽的a-螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)這種方法得到的艾塞那肽衍生 物，在保留良好的體內(nèi)降糖活性的同時(shí)，解決了天然艾塞那肽體內(nèi)半衰期短的問(wèn)題，這種艾 塞那肽衍生物在治療和預(yù)防糖尿病的藥物中具有更大的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目的是針對(duì)臨床上艾塞那肽在體內(nèi)半衰期短，需要頻繁注射給藥的 缺陷，提供一種作用時(shí)間更長(zhǎng)、療效更好的艾塞那肽衍生物。
[0008] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該艾塞那肽衍生物的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供該艾塞那肽衍生物在治療/預(yù)防糖尿病的藥物中的 應(yīng)用。
[0010] 用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
[0011] 本發(fā)明提出了一種艾塞那肽衍生物，所述衍生物為在相對(duì)于序列艾塞那肽第i和 i+4的位置上的氨基酸用Cys替換，然后通過(guò)連接臂（linker)成環(huán)后形成的化合物，其中i 的取值為10,12,13,14,16, 20, 24,所述連接臂（linker)選自化學(xué)式1-4 :
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種艾塞那肽衍生物，所述衍生物為在相對(duì)于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的 氨基酸用Cys替換，然后通過(guò)連接臂（linker)成環(huán)后形成的化合物，其中i的取值為10， 12,13,14,16, 20, 24,所述連接臂（linker)選自化學(xué)式1-4 :
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾塞那肽衍生物，其特征在于： 當(dāng)i= 10時(shí)窠那肽衍牛物的結(jié)構(gòu)如式所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí),對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為la;當(dāng)連 接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為lb;當(dāng)連接臂（linker)的 結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Ic;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式4 時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Id; 當(dāng)i= 12時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（II)所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí),對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Ila;當(dāng)連 接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為lib;當(dāng)連接臂（linker) 的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為lie;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué) 式4時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為lid; 當(dāng)i= 13時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（III)所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Ilia; 當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Illb;當(dāng)連接臂 (linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為IIIc;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié) 構(gòu)為化學(xué)式4時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Illd; 當(dāng)i= 14時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（IV)所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí),對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為IVa;當(dāng)連 接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為IVb;當(dāng)連接臂（linker) 的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為IVc;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué) 式4時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為IVd; 當(dāng)i= 16時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（V)所示： 其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1
時(shí),對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Va;當(dāng)連 接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vb;當(dāng)連接臂（linker)的 結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vc;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式4 時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vd; 當(dāng)i= 20時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（VI)所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí),對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Via;當(dāng)連 接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為VIb;當(dāng)連接臂（linker) 的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vic;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué) 式4時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為VId; 當(dāng)i= 24時(shí)，艾塞那肽衍生物的結(jié)構(gòu)如式（VII)所示：
其中，當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式1時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vila; 當(dāng)連接臂（linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式2時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vllb;當(dāng)連接臂 (linker)的結(jié)構(gòu)為化學(xué)式3時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vile;當(dāng)連接臂（linker)的結(jié) 構(gòu)為化學(xué)式4時(shí)，對(duì)應(yīng)的艾塞那肽衍生物記為Vlld。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，包含以下步驟： (1) 相對(duì)于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替換的線性多肽的固相 合成； (2) 步驟（1)得到的Cys替換的線性多肽與連接臂反應(yīng)成環(huán)，經(jīng)HPLC純化、冷凍干燥得 到所述的艾塞那肽衍生物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步驟（1)中，先將 用于多肽合成的樹脂置于固相反應(yīng)器，再將帶保護(hù)的氨基酸單體按照權(quán)利要求1或2所述 序列，從C端到N端依次偶聯(lián)，合成帶側(cè)鏈保護(hù)基的線性多肽樹脂，再經(jīng)脫除保護(hù)基、切斷樹 月旨、HPLC純化，得到第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替換的艾塞那肽線性多肽衍生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，其特征在于，步驟（2)中，將步 驟（1)中得到的第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替換的艾塞那肽（7-37)線性多肽衍 生物溶解于體積比為（〇. 1~10) : 1的乙腈-水的混合溶液中，調(diào)節(jié)pH值至7. 5~8. 5， 然后加入5~10摩爾當(dāng)量的連接臂，室溫下反應(yīng)0. 5~4小時(shí)，經(jīng)HPLC純化、冷凍干燥得 到艾塞那肽衍生物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的艾塞那肽衍生物的合成方法，所述的帶保護(hù)的氨基酸單體選 自于：Fmoc-Ser(tBu)-〇H, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Asn(Trt)-〇H， Fmoc-Lys (Boc)-OH, Fmoc-Leu-〇H, Fmoc-Trp (Boc)-OH, Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Ile-〇H, Fmoc-Phe-〇H, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-〇H, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Met-〇H, Fmoc-Asp(OtBu) -OH, Fmoc-Thr(tBu) -OH, Fmoc-His(Trt)-OH。
7. 如權(quán)利要求1所述的艾塞那肽衍生物在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種艾塞那肽衍生物。本發(fā)明還公開(kāi)了上述艾塞那肽衍生物的制備方法和應(yīng)用，所述衍生物為在相對(duì)于序列艾塞那肽第i和i+4的位置上的氨基酸用Cys替換，其中i的取值為10，12，13，14，16，20，24，然后通過(guò)連接臂成環(huán)后形成的化合物。本發(fā)明制備的艾塞那肽衍生物具有長(zhǎng)于艾塞那肽的體內(nèi)降糖時(shí)間，特別適于在制備治療糖尿病和肥胖癥的藥物中作為該藥物的活性成分。
【IPC分類】A61K38-22, C07K14-575, A61P3-10
【公開(kāi)號(hào)】CN104693301
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510074773
【發(fā)明人】蘇賢斌, 李金科, 楊敏敏, 湯同洋, 郭倫迪
【申請(qǐng)人】南京工業(yè)大學(xué), 南京英沛生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日