本發(fā)明涉及基因的功能與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種Leg1蛋白及其在肥胖相關(guān)疾病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在過去的幾年里，肥胖癥病例在全世界范圍內(nèi)迅速增長，目前已是導(dǎo)致人類死亡的第五號威脅。在發(fā)達(dá)國家，肥胖癥早在20世紀(jì)80年代就已初露端倪，病例在其后持續(xù)增加，只是在過去8年里增加速度有所減緩；而在發(fā)展中國家，肥胖患者每年都以極快的速度在增加。盡管肥胖一般不會直接導(dǎo)致死亡，但是，肥胖導(dǎo)致的并發(fā)癥，尤其是心血管疾病卻可以是致命的。在2010年，肥胖大約導(dǎo)致了340萬人的死亡。此外，對美國本土的肥胖癥患者的研究表明，肥胖癥很可能會降低將來人類的平均壽命。據(jù)統(tǒng)計，為了治療肥胖癥，美國差不多每年要花費(fèi)1170億美元。同時，世界范圍內(nèi)對肥胖癥的關(guān)注也越來越多。但是，目前，對于有效治療肥胖癥的藥物的研究成果還比較少，且與肥胖癥或者調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)脂肪合成積累相關(guān)的藥物靶點也比較少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種Leg1蛋白，其氨基酸序列如(1)或(2)所示：(1)SEQ ID NO.2；(2)由SEQ ID NO.2所示的序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與SEQ ID NO.2具有相同生物活性的衍生序列。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的Leg1蛋白在制備用于治療脂肪缺少疾病或用于促進(jìn)人類脂肪積累的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述Leg1蛋白。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的Leg1蛋白在制備或篩選用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述Leg1蛋白。

本發(fā)明的目的在于還提供一種重組Leg1蛋白，上述重組Leg1蛋白由編碼上述的Leg1蛋白的Leg1基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)、純化后得到。

進(jìn)一步地，當(dāng)Leg1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示時，Leg1基因的堿基序列如SEQ ID NO.4所示。

進(jìn)一步地，上述原核表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)中的任意一種。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的重組Leg1蛋白在制備用于治療肥胖或減肥的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述重組Leg1蛋白。

本發(fā)明的目的在于還提供一種修飾化Leg1蛋白，其由上述的Leg1蛋白上的一個或多個氨基酸殘基經(jīng)修飾后得到，上述修飾為糖苷化修飾、乙?；揎棥⒓谆揎椇土姿峄揎椫械囊环N或多種。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的修飾化Leg1蛋白在制備用于治療肥胖或減肥的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述修飾化Leg1蛋白。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的修飾化Leg1蛋白在制備用于治療脂肪缺少疾病或用于促進(jìn)人類脂肪積累的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述修飾化Leg1蛋白。

本發(fā)明的目的在于還提供上述的修飾化Leg1蛋白在制備用于治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用，該藥物的活性成分是上述修飾化Leg1蛋白。

本發(fā)明提供的一種Leg1蛋白及其在肥胖相關(guān)疾病中的應(yīng)用的有益效果是：

本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)沒有研究過的Leg1基因為基礎(chǔ)，以mLeg1基因(SEQ ID NO.4)敲除小鼠為研究對象，利用遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段對mLeg1基因和mLeg1蛋白的功能進(jìn)行了非常全面的研究。本發(fā)明的研究結(jié)果顯示：mLeg1蛋白(SEQ ID NO.2)可以通過EGFR調(diào)控體內(nèi)Akt的信號，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體內(nèi)的脂肪合成，mLeg1基因(SEQ ID NO.4)和mLeg1蛋白的表達(dá)水平與機(jī)體內(nèi)的脂肪合成密切相關(guān)(增強(qiáng)mLeg1基因的表達(dá)水平或者mLeg1蛋白的表達(dá)水平或mLeg1蛋白的含量，可以促使脂肪合成積累；抑制mLeg1基因的表達(dá)水平或者mLeg1蛋白的表達(dá)水平或mLeg1蛋白的含量，可以抑制脂肪積累)，表明mLeg1蛋白(SEQ ID NO.2)、與mLeg1蛋白具有相同結(jié)構(gòu)域的Leg1蛋白(SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.5-8)、及其這些蛋白的編碼基因(包括SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.3)都可以作為與調(diào)節(jié)脂肪合成相關(guān)藥物的全新的靶點，可以將其應(yīng)用到制備用于治療肥胖癥或減肥的藥物、用于治療脂肪缺少疾病或用于增肥的藥物、制備或篩選用于治療糖尿病的藥物、制備用于調(diào)節(jié)脊椎動物脂肪積累的藥物等調(diào)節(jié)脂肪合成相關(guān)藥物領(lǐng)域中，并為開發(fā)研究用于調(diào)節(jié)脊椎動物體內(nèi)的脂肪合成積累的藥物或者治療脂肪相關(guān)疾病提供一個全新的思路。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當(dāng)理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1本發(fā)明實施例1-5的檢測結(jié)果圖(圖中：a為采用Northern印記分析檢測mLeg1在野生型小鼠的不同組織的表達(dá)情況的結(jié)果圖；b為采用Northern印記分析mLeg1在野生型小鼠的唾液腺的3個腺體中表達(dá)情況的檢測結(jié)果圖；c為采用Western Blot檢測mLeg1蛋白在野生型小鼠的不同的組織中分布情況的結(jié)果圖；d為野生型小鼠和mLeg1基因敲除型小鼠唾液中mLeg1蛋白含量的檢測結(jié)果圖)；

圖2為本發(fā)明實施例4的mLeg1基因敲除策略示意圖；

圖3為本發(fā)明本發(fā)明實施例4-5的凝膠電泳檢測結(jié)果圖(圖中：a為采用普通PCR方法檢測mLeg1^Δ/Δ小鼠中第三個外顯子被敲除的凝膠電泳結(jié)果圖；b為采用RT-PCR檢測mLeg1^Δ/Δ小鼠中第三個外顯子被敲除的凝膠電泳結(jié)果圖；c為采用Western blot方法檢測mLeg1蛋白在mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺的表達(dá)情況的結(jié)果圖)；

圖4為本發(fā)明實施例5的mLeg1^Δ/Δ小鼠的mLeg1基因的測序結(jié)果對比圖；

圖5為本發(fā)明實施例6的mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺的HE染色結(jié)果對比圖；

圖6為本發(fā)明實施例6采用唾液淀粉酶和細(xì)胞連接蛋白pan-Cadherin進(jìn)行蛋白免疫熒光標(biāo)記觀察mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺的結(jié)果對比圖；

圖7為本發(fā)明實施例6的mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺分泌的粘液的阿新藍(lán)染色檢測結(jié)果對比圖；

圖8為本發(fā)明實施例7-8的檢測結(jié)果圖(圖中：a為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的血指標(biāo)的檢測結(jié)果圖；b為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的葡糖糖耐受情況的檢測結(jié)果圖；c為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠血清中的三酰甘油和膽固醇含量的檢測結(jié)果圖；d為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠肝臟中的三酰甘油和膽固醇含量的檢測結(jié)果圖)；

圖9為本發(fā)明實施例9的mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的不同部位的脂肪大小對比圖(圖中：a為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠背部脂肪直觀對比圖；b為1mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠背側(cè)脂肪塊大小直觀對比圖；c為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠腹部脂肪直觀對比圖；d為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠腹部側(cè)脂肪塊大小直觀對比圖)；

圖10為本發(fā)明實施例9的mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的體重變化檢測結(jié)果圖(圖中：a為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠在正常飼料和高脂飼料飼養(yǎng)條件下的體重變化曲線圖；b為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠在高脂飼料飼養(yǎng)半年后的體型大小直觀對比圖)；

圖11為本發(fā)明實施例9的脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平檢測結(jié)果圖(圖中：a為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠肝臟中脂肪β氧化相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測結(jié)果圖；b為明mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠肝臟中脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)水平的檢測結(jié)果圖)；

圖12為本發(fā)明實施例10的小鼠肝臟中脂肪合成途徑的示意圖；

圖13為本發(fā)明實施例11的mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠肝臟中調(diào)控脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平的檢測結(jié)果圖；

圖14為本發(fā)明實施例12-14的Akt磷酸化水平檢測結(jié)果圖(圖中：a為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠肝臟中的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；b為mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠唾液腺中的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；c為經(jīng)野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液中mLeg1的蛋白水平；d為經(jīng)mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖)

圖15為本發(fā)明實施例15-16的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖(圖中：a為經(jīng)腹腔或者尾靜脈注射唾液腺原代培養(yǎng)上清后誘導(dǎo)mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；b為由野生型小鼠的唾液腺純化的不同mLeg1蛋白濃度激活HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖)

圖16為本發(fā)明實施例16-18的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖(圖中：a為通過柱層析和離子交換從唾液腺中純化得到的mLeg1蛋白激活HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；b為在抑制劑LY290004的作用條件下，經(jīng)mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠唾液腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；c為在抑制劑LY290004的作用條件下，通過柱層析和離子交換從唾液腺中純化得到的mLeg1蛋白激活HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化水平的檢測結(jié)果圖；d為經(jīng)mLeg1蛋白培養(yǎng)后的HepG2細(xì)胞的酪氨酸磷酸化水平的檢測結(jié)果圖)；

圖17為本發(fā)明實施例19的膜受體酪氨酸激酶(RTK)篩選檢測結(jié)果圖；

圖18為本發(fā)明實施例19-22的檢測結(jié)果圖(a為mLeg1蛋白對細(xì)胞內(nèi)EGFR受體蛋白的激活水平的檢測結(jié)果圖；b為在抑制劑AG1478作用條件下，mLeg1蛋白對細(xì)胞內(nèi)EGFR受體蛋白的激活水平的檢測結(jié)果圖；c為采用免疫共沉淀法檢測mLeg1蛋白與EGFR之間的相互作用的結(jié)果圖；d為mLeg1蛋白灌胃mLeg1^Δ/Δ小鼠后，不同時間點檢測mLeg1蛋白與EGFR之間的相互作用的結(jié)果圖)；

圖19為本發(fā)明實施例23的對重組mLeg1-Re蛋白的檢測結(jié)果及其功能檢測的結(jié)果圖(圖中：a為采用免疫印跡法檢測野生型mLeg1蛋白與由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組得到的mLeg1蛋白的分子量大小的對比結(jié)果圖；b為由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組的mLeg1蛋白激活HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化的結(jié)果圖)；

圖20為本發(fā)明實施例23的重組mLeg1蛋白對野生型小鼠的體重影響結(jié)果圖(a為在高脂食物飼養(yǎng)條件下，灌胃mLeg1-Re蛋白的野生型小鼠的體重增長結(jié)果圖；b為采用免疫共沉淀的方法檢測mLeg1-Re蛋白是否能到達(dá)mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟的結(jié)果圖)。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明的一種Leg1蛋白、Leg1基因及其在非人類中的應(yīng)用進(jìn)行具體說明。

本發(fā)明的發(fā)明人選取小鼠為研究模型動物，對Leg1基因(liver enriched gene 1、肝富集基因1，該基因編碼表達(dá)出的蛋白稱之為Leg1蛋白)和Leg1蛋白在小鼠中的同源基因mLeg1基因(如SEQ ID NO.4所示)和mLeg1蛋白(SEQ ID NO.2)進(jìn)行相關(guān)功能性研究。揭示了mLeg1基因及其編碼表達(dá)mLeg1蛋白的功能，也同時揭示了在所有脊椎動物中具有同源性的Leg1基因和相應(yīng)Leg1蛋白的功能。

mLeg1也稱2310057J18Rik RIKEN cDNA 2310057J18gene(GeneID：67719)，是Leg1在小鼠中的同源基因，其在小鼠中的功能研究幾乎空白。生物信息分析顯示，mLeg1基因位于10號染色體上，全長約14.016kb，包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，其中翻譯起始位點ATG位于第一個外顯子上。mLeg1基因編碼一個長為337個氨基酸的蛋白(如SEQ ID NO.2所示)，分析預(yù)測顯示其含有一具有20個氨基酸的前導(dǎo)信號肽，前導(dǎo)信號肽的序列為SEQ ID NO.2所示的第1-21位氨基酸序列，表明mLeg1是一個新型的分泌蛋白。

人(Homo sapiens)的hLeg1蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1)與小鼠中的同源蛋白mLeg1蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)具有71.2％的相似性，因此，通過對鼠的mLeg1蛋白的編碼基因即mLeg1基因(如SEQ ID NO.4所示)和mLeg1蛋白的功能研究能夠為人類的hLeg1基因(編碼序列即CDS序列如SEQ ID NO.3所示)和hLeg1蛋白的功能和應(yīng)用提供指導(dǎo)和參考的意義，同時為研發(fā)相關(guān)脂肪疾病的藥物提供理論依據(jù)。

Leg1蛋白在斑馬魚(Danio rerio)中具有兩個拷貝，分別是dLeg1a蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)和dLeg1b蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)，二者與mLeg1蛋白分別具有47.5％和48.6％的相似性；存在于綿羊(Ovis aries)中的oLeg1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)，其與mLeg1蛋白具有49.1％的相似性；存在于牛(Bos taurus)中的bLeg1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示)，其與mLeg1蛋白具有45.7％的相似性(本發(fā)明的相似性對比所用的方法是：使用歐洲生物信息中心(ebi)配對比對軟件needle，參數(shù)設(shè)置為：Matrix:EBLOSUM62，Gap_penalty:10.0，Extend_penalty:0.5進(jìn)行比對)。

由于，Leg1蛋白是在所有脊椎動物中保守存在的分泌蛋白高度，它們的Leg1蛋白具有相同的DUF結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO.2中第28位-337位、SEQ ID NO.1中的第28位-320位、SEQ ID NO.5中的第29位-362位、SEQ ID NO.6中的第29位-362位、SEQ ID NO.7中的第34位-354位、以及SEQ ID NO.8中的第1位-317位，這些氨基酸殘基序列在三維空間中都構(gòu)成一個功能相似的DUF結(jié)構(gòu)域)，因此，它們之間具有相似的功能和應(yīng)用前景。因此，對于所有脊椎動物的leg1蛋白及其編碼基因的與脂肪合成相關(guān)的應(yīng)用均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

還需要說明的是，由SEQ ID NO.2所示的序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的且與SEQ ID NO.2具有相同的生物活性的衍生序列所示的蛋白及其應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。只要在SEQ ID NO.2所示的leg1蛋白的基礎(chǔ)上，經(jīng)過上述的改造，使其改造后的突變體leg1與SEQ ID NO.2所示的leg1蛋白具有相同的DUF結(jié)構(gòu)域，使其與leg1蛋白具有相同或相似的生物活性，對于這些突變體蛋白及其編碼基因的脂肪合成相關(guān)的應(yīng)用同樣屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

需要說明的是，本發(fā)明所指的脊椎動物包括人、鼠、斑馬魚、綿羊、牛，還包括兔、豬、馬、虎、豹、狼、狗、雞、鴨、魚、鵝、熊以及猴等，但不限于前述的動物。

本發(fā)明通過遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段，以模式生物小鼠及人類細(xì)胞系為研究模型，對新型分泌蛋白mLeg1的功能進(jìn)行全面系統(tǒng)的研究，通過提供大量證據(jù)證明分泌蛋白mLeg1是一個新的信號分子，建立從mLeg1到EGFR/PI3K，最后激活A(yù)kt的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并證明該網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)小鼠體內(nèi)脂肪合成。同時本發(fā)明的發(fā)明人證明mLeg1敲除的小鼠能正常生長，更為重要的是mLeg1敲除的小鼠可以抗高脂食物引起的肥胖癥。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實驗動物及飼養(yǎng)

實驗動物：選用背景為C57BL/6的野生型小鼠；利用Cre-loxP系統(tǒng)，選用C57BL/6-Tg(Zp3-cre)93Knw/Jnju的Cre工具鼠用于全身敲除mLeg1基因，以獲得全身敲除mLeg1基因的小鼠(mLeg1^Δ/Δ敲除小鼠)。(上述各品系的小鼠均購于南京生物醫(yī)藥研究院(NRI))。飼養(yǎng)條件：溫度22℃，濕度50％～60％，并給予12h光照/12h黑暗的光周期。小鼠的普通飼料為上海斯萊克公司生產(chǎn)的大小鼠輻照育成料(M02-F)，高脂飼料為上海斯萊克公司生產(chǎn)的大小鼠高脂實驗料(M04-F)。

1.Northern印跡分析mLeg1在不同組織的表達(dá)情況

以8周齡的雄性的背景為C57BL/6的小鼠作為研究對象，采用Northern印跡分析檢測mLeg1基因的表達(dá)譜。以mLeg1基因的反義鏈為探針，進(jìn)行Northern印記分析，分析mLeg1基因小鼠包含肝臟在內(nèi)的一系列消化器官(心臟(heart)、肝臟(liver)、胰腺(pancreas)、肺(lung)、腎(kidney)、胃(stomach)、腸(gut)、唾液腺(SG))中的表達(dá)情況。

Northern印跡分析的實驗方法如下。

1.1RNA提?。?/p>

1.1.1取需要提取RNA的組織，用液氮研碎至無明顯顆粒，研磨過程保持有液氮存在以防RNA降解。

1.1.2取50-100mg樣品加入1ml Trizol(Reagent，Life Technologies，Cat.no.15596-026)，通過26G針頭抽打充分勻漿。

1.1.3室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿用力混勻30秒，室溫靜置5min。4℃下12000g離心15min使各液相分離。

1.1.4取水相(即最上層液體)加入到0.5ml異丙醇中，顛倒混勻后室溫孵育10min，使RNA析出。4℃下12000g離心15min，棄上清。

1.1.5沉淀加入1ml 75％的乙醇(用DEPC水配置)清洗，并4℃下12000g離心5min棄上清。重復(fù)用75％的乙醇清洗一次，并充分除去上清。42℃烘干后加適量DEPC水溶解。提取的RNA馬上用于后續(xù)實驗或保存在-80℃冰箱中，需要時直接取出使用。

1.2地高辛(DIG)標(biāo)記探針制備：

(1)用DIG標(biāo)記的dNTP(10X PCR DIG Labeling Mix，Roche Cat.No.11585550910)代替dNTP，通過PCR反應(yīng)將DIG摻入到雙鏈DNA中作為Norhern的探針。PCR引物為：probeF：GGCTGTCCTGGCTTCCTG；probeR：CTCTCCATCTGTTCATTGTTCC。PCR采用普通的taq酶(反應(yīng)體系為：模板1ul，正反引物各0.3ul，taq酶0.3ul，10x的buffer2ul，2.5mM dNTP 1ul，水15.1ul)(taq酶反應(yīng)體系下同)，反應(yīng)程序：步驟1：94℃3分鐘；步驟2：94℃30秒；步驟3：58℃30秒；步驟4：72℃30秒；步驟5：重復(fù)步驟2到步驟4，33次；步驟6：72℃10分鐘。

(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測大小和純度，并通過PCR純化試劑盒進(jìn)行純化。純化后的探針在100℃中變性10min，并馬上在冰上冷卻至少2min，用DIG Easy Hyb(Roche Cat.No.11603558001)稀釋探針到25ng/ml，并保存在-20℃中備用。

1.3RNA變性凝膠制備：RNA凝膠電泳在在變性的緩沖液和凝膠中進(jìn)行。將10X的MOPS緩沖液(0.2M MOPS，50mM NaoAc，10mM EDTA，pH 7.0)用滅菌的去離子水稀釋到1X，并加入1.3％的瓊脂糖粉末，通過微波爐加熱充分融解，冷卻到50℃左右的時候加入5.3％的濃度為37％的甲醛，混勻后倒入制膠模具中，靜置冷卻凝固備用。

1.4RNA樣品處理：取適量RNA(即步驟1.1提取出的RNA樣品，10到30μg)加入到17.5μl RNA變性劑中(含10μl去離子甲酰胺，2μl 10X MOPS，3.5μl 37％甲醛，2μl RNA上樣緩沖液(Gel Loading Buffer II，Life Technologies，Cat.No.AM8546G)，65℃變性20min后馬上置于冰上10min。

1.5RNA變性凝膠電泳：取冷卻凝固的RNA變性膠置于1X MOPS電泳緩沖液中，加入RNA樣品進(jìn)行電泳，同時加入RNA分子Marker(Fermentas Cat.No.SM1821)進(jìn)行分子量估算，以4-10V/CM的電壓進(jìn)行電泳，根據(jù)片段大小決定電泳時間，一般為4～7小時。

1.6RNA轉(zhuǎn)膜：

1.6.1取出已完成RNA變性凝膠電泳的凝膠(RNA膠)，用滅菌的去離子水清洗，并置于10X的SSC中平衡。按膠大小裁取適當(dāng)大小的Hybond-N+膜(Amersham Bioscience Cat.No.RPN303B)和3MM濾紙(Whatman Cat.No.3030917)，同樣在10XSSC中平衡。

1.6.2取一干凈的敞口瓷盤容器，倒入10X的SSC緩沖液，并取一有機(jī)玻璃蓋于瓷盤上。裁取2層長度略長于有機(jī)玻璃，寬度略寬于RNA膠的3MM濾紙，用10X SSC浸潤后蓋于有機(jī)玻璃上，濾紙縱向兩端浸泡于瓷盤中的SSC緩沖液中。將RNA膠倒扣在濾紙上，再依次覆蓋上Hybond-N⁺膜和兩層3MM濾紙，以及多層吸水紙，并上壓重物，轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜完成后，取下膜在紫外交聯(lián)儀(UVP Ultraviolet Crosslinker Cat.No.CL-1000)下，150m j/cm2能量交聯(lián)。隨后用RNA亞甲基藍(lán)染色液(0.3M NaOAc，pH 5.2，0.03％Methylene Blue)染色，檢測RNA轉(zhuǎn)膜效果及質(zhì)量。

1.7探針雜交及顯影分析：

DIG探針的雜交和清洗用Roche公司的DIG洗滌和封閉試劑盒(Roche Cat.No.11585762001)依說明書進(jìn)行。具體如下。

1.7.1取一雜交管，將RNA膜(由1.6.2步驟得到的)置于其中，加入適量預(yù)雜交液(Roche Cat.No.11603558001)，50℃封閉2小時。期間，取-20℃保存的DIG標(biāo)記的探針，在100℃變性10min后在50℃平衡。封閉2小時后，加入平衡好的探針，50℃雜交過夜。

1.7.2次日，回收探針，RNA膜按以下次序依次清洗：2X SSC/0.1％SDS常溫清洗，每次10min；0.5X SSC/0.1％SDS 65℃清洗兩次，每次15min；0.1X SSC/0.1％SDS 65℃清洗兩次，每次15min；洗滌緩沖液室溫清洗10min。加入10％DIG blocking buffer封閉1小時，接著換入用10％DIG blocking buffer以1:20000稀釋的Anti-Digoxigenin-AP Fab fragments抗體(Roche Cat.No.11093274910)室溫孵育2小時。洗滌緩沖液清洗兩次，每次15。

1.7.3最后將膜用檢測緩沖液平衡5min。取膜夾于塑料膜中，并于其中滴入Ready-to-use CDP-star溶液(Roche Cat.No.12041677001)顯色，在熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(Clinx Science Instruments Cat.No.3400)里成像。結(jié)果如圖1中的(a)所示。

由圖1中的(a)可知(圖1的(a)中：SG代表唾液腺、liver代表肝臟、gut代表腸道、lung代表肺、heart代表心臟、stomach代表胃、kidney代表腎、pancrease代表胰腺)，mLeg1基因并沒有在肝臟中富集表達(dá)，卻在在唾液腺(SG)中有非常高的表達(dá)，而在其它組織(heat、liver、pancreas、lung、kidney、stomach、gut)中基本沒有檢測到mLeg1的表達(dá)。

小鼠的唾液腺主要包括三個部分：(頜下腺(submandibular gland)，舌下腺(sublingular gland)和腮腺(parotid)，因此，采用Northern blot印記分析(具體方法同實施例1)，本發(fā)明的發(fā)明人分別探究了mLeg1基因在這3個腺體中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1中的(b)所示。

由圖1中的(b)可知(圖1的(b)中：parotid代表腮腺、sub-lingual代表舌下腺、sub-maxillary代表頜下腺)，mLeg1基因在這3個腺體中均有明顯表達(dá)，其在腮腺組織中的表達(dá)高于頜下腺和舌下腺。

實施例2

由于mLeg1蛋白在斑馬魚中的同源蛋白Leg1是一個分泌蛋白，上述結(jié)果已表明mLeg1基因主要在唾液腺表達(dá)，但是其mLeg1蛋白也可能分泌運(yùn)輸?shù)絼e的組織中發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明的發(fā)明人提取小鼠不同組織的總蛋白，通過Western Blot檢測mLeg1蛋白在不同的組織中分布情況。

采用Western Blot檢測mLeg1蛋白在不同的組織中分布情況。實驗方法如下。

2.1蛋白提?。?/p>

小鼠猝死后，摘取目的組織(SG、liver、gut、blood、lung、heat、stomach、kindney、pancrease)，分別置于1.5ml離心管中，并迅速于液氮中冷凍，防止降解。提蛋白時，取出樣品，通過液氮研磨粉碎，將樣品粉末收集于離心管中，并加入蛋白裂解液(150mM NaCl，50mM PH7.6Tris-Hcl，0.1％SDS，1％Triton X100，1.5％脫氧膽酸鈉，1X的Complete(EDTA-free)(Roche Cat.No.11873580001)，100mg樣品加入100μl裂解液)，置于冰上，26G針頭抽打數(shù)次，4℃于垂直搖床孵育15min，4℃12000g離心15min，取上清，通過Braford法測蛋白濃度。

2.2蛋白免疫引跡(Western blot)：

2.2.1取制備的10～20μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，通過半干轉(zhuǎn)膜儀(TRANSSD SEMI-DRY TRANSFER CELL(Bio-Rad Cat.No.170-390)將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore Cat.No.IPVH00010)中。轉(zhuǎn)膜條件為20V，140mA，轉(zhuǎn)膜時間依蛋白大小而定，一般為50min到60min之間。

2.2.2轉(zhuǎn)膜后，用5％的脫脂牛奶封閉1小時，再加入稀釋于牛奶中的目的蛋白抗體(根據(jù)檢測的目標(biāo)蛋白來確定，本實施例為mLeg1抗體，其稀釋比例依抗體而定，一般為1:1000)，室溫孵育1小時或4℃孵育過夜。

2.2.3PBST(0.1％Tween 20in PBS)100～150rpm清洗5x5min。加入相應(yīng)的1:10000稀釋于牛奶中的二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(碧云天Cat.No.A0216)或辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天Cat.No.A0208))，室溫孵育1小時，PBST 100～150rpm清洗5x5min。

2.2.4加入顯色底物(Thermo Cat.No.34095)在熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(Clinx Science Instruments Cat.No.3400)里成像。結(jié)果如圖1中的(c)所示。

由圖1中的(c)可知(圖1的(c)中：SG代表唾液腺、liver代表肝臟、gut代表腸道、blood代表血清、lung代表肺、heart代表心臟、stomach代表胃、kidney代表腎、pancrease代表胰腺)，與RNA表達(dá)位置相一致的，mLeg1蛋白也主要存在于唾液腺(SG)中，其它組織包括肝臟，腸道，肺，心臟，位，腎，胰腺都沒有檢測到明顯的mLeg1蛋白的存在，同時，小鼠血液中并沒有存在大量的mLeg1，因此，在小鼠中，mLeg1的蛋白合成和儲存都主要發(fā)生在唾液腺中。

實施例3

由于唾液腺是一個分泌性腺體，其最重要功能是分泌唾液，而mLeg1也是一個分泌蛋白。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對mLeg1是否會分泌到唾液中進(jìn)行了研究。

采用Western Blot檢測mLeg1在唾液中的含量。具體步驟如下。

3.1唾液收集：于小鼠腹腔按0.5mg/kg的量注射匹羅卡品(Pilocarpine，Sigma)，將毛細(xì)管置于小鼠口腔引流收集分泌的唾液。匹羅卡品是一種用于治療口腔干燥的藥物，它能促進(jìn)唾液的大量分泌。分別收集野生型小鼠和mLeg1全身敲除小鼠(其獲得的方法見下文)分泌的唾液。

3.2唾液處理：收集的唾液，用1/5唾液體積的5x的Laemmli buffer(10％SDS，250mM Tris-HCl，0.1‰Bromphenol blue，500mM DTT，50％Glycerol)，100℃煮沸5分鐘。

3.3利用Western Blot印記分析唾液中mLeg1蛋白含量，具體操作參考實施例2的Western Blot檢測步驟。結(jié)果如圖1中的(d)所示。

由圖1中的(d)可知(圖1的(d)中：WT為野生型小鼠，mLeg1^Δ/Δ為mLeg1基因全身敲除型小鼠)，mLeg1蛋白確實大量存在于野生型小鼠的唾液中，而mLeg1全身敲除小鼠的唾液中并不存在mLeg1蛋白。

實施例4

mLeg1基因全身敲除小鼠(mLeg1^Δ/Δ)的獲得

為了獲得mleg全身敲除小鼠，本發(fā)明的發(fā)明人選用傳統(tǒng)的Cre-loxP系統(tǒng)將小鼠中的mLeg1基因進(jìn)行敲除。該系統(tǒng)主要是依賴Cre酶能夠識別loxP序列，并將兩個同向的loxP序列中的序列進(jìn)行刪除，從而達(dá)到基因敲除的目的。而當(dāng)Cre酶在特定時空表達(dá)時，即可以使mLeg1在特定時空敲除，從而避免胚胎致死造成的研究難點。這里本發(fā)明的發(fā)明人將loxP序列插入到mLeg1第三個外顯子的兩側(cè)，同時在第三個外顯子和其后面的loxP序列之間加入一個NEO基因，用于正向抗性篩選。通過同源重組，胚胎移植和遺傳篩選本發(fā)明的發(fā)明人獲取mLeg1第三個外顯子兩端加入loxP序列的mleg^fl/fl穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因小鼠。

Cre-loxP系統(tǒng)的另一個組成部分是Cre酶。當(dāng)Cre酶受特定空間或特定時間激活的啟動子驅(qū)動表達(dá)時，就能在特定空間或時間將loxP序列進(jìn)行刪除?；谠撛慝@取mLeg1敲除小鼠的敲除策略如圖2所示。這里，本發(fā)明的發(fā)明人選用zp3啟動子驅(qū)動Cre表達(dá)的小鼠對mLeg1進(jìn)行全身敲除。zp3是卵透明帶3(zona pellucida glycoprotein 3)基因，該基因只在第一次減數(shù)分裂前的卵母細(xì)胞中表達(dá)。

因此，將mLeg1^fl/fl小鼠與Zp3驅(qū)動Cre表達(dá)的小鼠(C57BL/6-Tg(Zp3-cre)93Knw/JNju)配種時，得到Zp3-CRE⁺mLeg1^fl/wt的小鼠。其中的母鼠產(chǎn)生的卵母細(xì)胞中，由于zp3啟動子的激活，誘導(dǎo)CRE酶的表達(dá)，從而將mLeg1基因的第三個外顯子進(jìn)行敲除。將得到的母鼠與野生型公鼠配種后，得到ZP3-CRE⁺mLeg1^Δ/WT和ZP3-CRE^-mLeg1^Δ/WT小鼠。ZP3-CRE^-mLeg1^Δ/WT小鼠自交即可得到mLeg1^Δ/Δ和mLeg1^WT/WT小鼠。mLeg1^Δ/Δ小鼠即為mLeg1基因全身敲除小鼠。

采用PCR法，從上述得到的mLeg1^Δ/Δ和mLeg1^WT/WT小鼠中，鑒定出mLeg1^Δ/Δ小鼠：

取小鼠并剪取腳趾用于編號，同時收集剪下腳趾用堿裂解法提取基因組DNA。往收集的腳趾中加入75μl的裂解液I(25mM NaOH，EDTA 0.2mM，PH 12)，95℃30min，冰上冷卻。再加入75μl的裂解液II(Tris 40mM，PH5)中合。充分反應(yīng)后作為PCR模板，每20μl PCR反應(yīng)中加入4μl模板進(jìn)行反應(yīng)?；蛐丸b定引物：上游引物mLeg1Fwd：CCTTTCTTAATGACACTTCAGTATGT；下游引物mLeg1Rv：CACATGCCTATTCACTCTCTCC。PCR采用普通的taq酶，反應(yīng)條件為：1、94℃3分鐘，2、94℃30秒，3、58℃30秒，4、72℃30秒，5、重復(fù)2到4步33次，6、72℃10分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳實驗，其中野生型小鼠產(chǎn)生一條685bp的條帶，突變體小鼠由于第三個外顯子和部分內(nèi)含子被刪除，產(chǎn)生一個293bp大小的條帶(如圖3中的(a)所示)。

將鑒定出的mLeg1^Δ/Δ小鼠按常規(guī)方法進(jìn)行飼養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

此外，雜交配種的結(jié)果顯示：當(dāng)對mLeg1^Δ/W自交配種時，mLeg1^Δ/Δ小鼠可以正常的出生，呈現(xiàn)正常的1:3孟德爾遺傳比例。幼鼠可生長發(fā)育為健康成鼠，且mLeg1^Δ/Δ成年小鼠可以正常的產(chǎn)生后代，其每胎小鼠個數(shù)與野生型沒有明顯差異。

實施例5

mLeg1^Δ/Δ小鼠的驗證

為了進(jìn)一步驗證mLeg1確實被敲除，本發(fā)明的發(fā)明人分別收取鑒定為mLeg1^Δ/Δ和mLeg1^WT/WT的小鼠的唾液腺，提取總RNA，進(jìn)一步合成cDNA。實驗方法如下。

5.1提取總RNA：分別提取mLeg1^Δ/Δ和mLeg1^WT/WT的小鼠的唾液腺的總RNA，提取方法同實施例1中的1.1步驟的RNA提取。

5.2RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA：取1μg提取的RNA樣品，加入1μl 50μM的OligodT，加入1μl10mM dNTP，用水補(bǔ)齊到10μl。65℃變性5min，冰上至少1分鐘。加入10μl cDNA混合物(4μl 5x First Line Buffer，2μl 0.1M DTT，1μl M-MLVRT酶，3μl DEPC水)。37℃反應(yīng)50min后在70℃15min終止反應(yīng)。合成的cDNA用于后續(xù)實驗或保存于-20冰箱中。

5.3PCR鑒定：

用mLeg1基因的第三個外顯子兩側(cè)的引物2qPCR F282：CCTCTGCAGTTTGGCTGGCAGT和3’ARM rev-1：TCCAAGGATGAGGCATGGGCTTC，分別對野生型和mLeg1敲除小鼠的cDNA進(jìn)行PCR。PCR采用普通的taq酶，反應(yīng)條件為:1、94℃3分鐘，2、94℃30秒，3、58℃30秒，4、72℃30秒，5、重復(fù)2到4步33次，6、72℃10分鐘。

5.4擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖3中的(b)所示(圖3的(b)中：WT為野生型小鼠，mLeg1^Δ/Δ為mLeg1基因全身敲除型小鼠)，野生型小鼠將產(chǎn)生一條約377bp大小的條帶，而突變體小鼠由于第三個外顯子的刪除將產(chǎn)生一條大小為192bp大小的條帶。同時擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)純化后測序，測序結(jié)果如圖9所示，經(jīng)測序驗證，mLeg1^Δ/Δ的PCR產(chǎn)物的第三個外顯子確實被刪除(如圖4所示)。

5.5采用Western blot檢測mLeg1^Δ/Δ和野生型的小鼠的唾液腺中的mLeg1蛋白水平，具體步驟可參考實施例2。檢測結(jié)果如圖3中的(c)所示。

由圖3中的(c)可知，mLeg1^Δ/Δ小鼠的唾液腺確實不表達(dá)出mLeg1蛋白，而野生型的小鼠唾液腺表達(dá)出mLeg1蛋白。

以上數(shù)據(jù)充分說明，本發(fā)明的發(fā)明人獲得了mLeg1^Δ/Δ小鼠，且mLeg1基因敲除后并不影響該小鼠的生存和繁殖，以此mLeg1^Δ/Δ小鼠作為研究mLeg1基因的功能的模型動物，所得到的研究結(jié)果可信度高。

實施例6

檢測mLeg1的敲除對唾液腺的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。

小鼠唾液腺的三個腺體中都表達(dá)mLeg1，而頜下腺是小鼠唾液腺的最大組成部分，因此，本發(fā)明的發(fā)明人以頜下腺為研究對象，研究mLeg1基因的敲除是否會對其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。

6.1采用HE染色法觀察mLeg1基因敲除是否會對唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

6.1.1制備頜下腺組織切片：小鼠頜下腺用4％的多聚甲醛(Sigma，目錄號：P6148，溶解于PBS)在室溫中固定1小時后，用PBS洗兩次，每次10分鐘。在一個小空間內(nèi)，如1.5ml Eppendorf管的帽子中，用溫度約45℃的1.5％的低熔點瓊脂糖溶液(用30％蔗糖PBS溶液煮沸溶化配制)冷卻固定。之后在30％的蔗糖PBS溶液中4℃平衡過夜。平衡后，這些小塊用O.C.T.復(fù)合物(Sakura目錄號：4583)固定在塑料模型的底部。取-80℃預(yù)冷的酒精加入干冰，將塑料模型置入其中冷凍。冰凍的樣品立即使用，或-80℃下于密封盒中儲存。切片時，冰凍的樣品塊用O.C.T.復(fù)合物固定在支撐物中。樣品切片前在切片機(jī)(Leica，HM505)-30℃下預(yù)冷平衡兩小時。樣品切成8～12μm厚度的薄片，多聚賴氨包被的玻璃載玻片(Menzel，目錄號：J2800AMNZ)收集切的薄片上，收集樣品馬上使用或置于-80℃下保存。

6.1.2HE染色：取出已經(jīng)切好的冰凍切片，蘇木素染色5min，流水沖洗5min，1％的鹽酸乙醇(1％的鹽酸+99％無水乙醇)分化5s，流水沖洗10min，伊紅染色5min，然后80％，95％，100％的乙醇一次清洗，每個2s，洗凈伊紅。放入二甲苯透明，滴上加拿大樹脂封片，鏡檢觀察。結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，mLeg1^Δ/Δ小鼠和野生型小鼠的唾液腺HE染色結(jié)果并無顯著差別，兩者都包含中空、伊紅染色較深的導(dǎo)管，以及伊紅染色稍淺的實質(zhì)腺泡組織，并且它們都有完整而緊湊的結(jié)構(gòu)，意味著mLeg1敲除后對唾液腺的管狀運(yùn)輸系統(tǒng)和唾液分泌單元的發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)并無顯著影響。

6.2采用蛋白免疫熒光標(biāo)記法觀察mLeg1基因敲除是否會對唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響。

為了進(jìn)一步驗證mLeg1敲除是否會對唾液腺的形態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響，本發(fā)明的發(fā)明人選取兩個唾液腺的標(biāo)記蛋白唾液淀粉酶(Amylase)和細(xì)胞連接蛋白(pan-cadherin)，進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，從細(xì)胞層面上分析研究mLeg1的敲除對唾液腺形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。實驗方法如下。

6.2.1制備頜下腺組織切片：方法同6.1.1步驟，或者直接采用步驟6.1.1已制備好的組織切片。

6.2.2取如上所述處理的組織切片用PBST(0.2％triton X100)滲透，增加膜的通透性，便于抗體穿過細(xì)胞膜，一般處理時間為5min，接著用PBB(0.5％BSA(Sangon Cat.No.A0332)溶于1×PBS)清洗10min。

6.2.3用PBB配置20％的山羊血清進(jìn)行封閉，按100:1的比例用PBB稀釋一抗即抗pan-cadherin抗體(Sigma C1821)，在4℃孵育樣品過夜。60rpm下，PBB清洗3x10min。以1:400比例用PBB稀釋熒光二抗(Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa Fluor Plus 647，Thermo，A32728)，并以1/500的比例加入DAPI(Beyotime Cat.No.C1002)，室溫孵育1小時。60rpm下，PBB清洗3x10min后，用80％的甘油進(jìn)行封片。

6.2.4激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000)采集數(shù)據(jù)。結(jié)果如圖7所示。

6.2.5Amylase蛋白免疫熒光標(biāo)記，方法與步驟6.2.1-6.2-4基本相同，區(qū)別在于，在6.2.3步驟中用抗Amylase抗體(Santa Cruz sc-9890)替換抗pan-cadherin抗體，熒光二抗替換為(Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa Fluor 488，Thermo，A-11034)。結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，mLeg1敲除并沒有影響唾液淀粉酶(Amylase)和細(xì)胞連接蛋白(pan-cadherin)的表達(dá)和分布，暗示著mLeg1的敲除確實沒有對唾液腺的組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞組成和分布產(chǎn)生明顯的影響。

6.4對mLeg1^Δ/Δ小鼠的唾液腺唾液產(chǎn)生功能進(jìn)行研究。

唾液腺的一個重要功能是產(chǎn)生和分泌唾液，因此，本發(fā)明的發(fā)明人也對mLeg1^Δ/Δ小鼠的唾液腺唾液產(chǎn)生功能進(jìn)行研究。腺泡細(xì)胞分泌產(chǎn)生的粘液(mucin)可以被阿新藍(lán)(Alcian Blue)染色。因此，本發(fā)明的發(fā)明人用阿新藍(lán)染色評估唾液腺的分泌能力。用阿新藍(lán)分別染色野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠的頜下腺切片。方法如下。

6.4.1制備頜下腺組織切片：同步驟6.1.1。

6.4.2阿新藍(lán)染色：切片用雙蒸水復(fù)水，之后用3％的乙酸處理3分鐘，接著阿新藍(lán)染色液(1％的阿新藍(lán)，3％的冰醋酸，PH 2.5)室溫染色30分鐘，流水沖洗2分鐘后，雙蒸水潤洗，用二甲苯潤洗脫水后用加拿大樹脂封片鏡檢觀察。結(jié)果如圖7所示。

由圖7顯示的結(jié)果可知，野生型小鼠和mLeg1^Δ/Δ小鼠的導(dǎo)管之間的腺泡都存在非常明顯的濃縮的阿新藍(lán)陽性信號(圖7中箭頭所指位置)，意味著頜下腺腺泡都可以正常的產(chǎn)生和分泌粘液。因此，mLeg1基因的敲除并沒有影響頜下腺分泌唾液的能力。

實施例7

7.1檢測mLeg1^Δ/Δ小鼠血漿脂肪含量。

由于mLeg1是一個分泌蛋白，而mLeg1的敲除似乎對小鼠的唾液腺的發(fā)育和功能并沒有造成影響，因此唾液腺可能并不是mLeg1的靶器官，也就是說，mLeg1可能運(yùn)輸?shù)絼e的器官進(jìn)而發(fā)揮功能。為了對mLeg1的功能進(jìn)行研究，本發(fā)明的發(fā)明人對小鼠進(jìn)行全身檢查，研究mLeg1^Δ/Δ小鼠是否會出現(xiàn)一些生理上的異常。本發(fā)明的發(fā)明人抽取小鼠的血液，對血清中的各項血指標(biāo)進(jìn)行檢測。實驗方法如下。

7.1.1將小鼠麻醉后，通過股動脈取血并置入抗凝管中，于1000g離心5min，取上清。

7.1.1將稀釋的上清通過自動生化分析儀(迪安診斷代檢)(奧林巴斯)檢測各項血指標(biāo)。檢測結(jié)果如圖8中的(a)所示。

由圖8中的(a)可知(圖8的(a)中：位于上方的大括號半框顯示的是降低的指標(biāo)項目，位于下方的大括號半框顯示的mLeg1^Δ/Δ小鼠中升高的指標(biāo)項目，WT1WT2為野生型，ZCBA1，ZGA2，ZGA3，為mLeg1^Δ/Δ小鼠)，mLeg1^Δ/Δ小鼠中三酰甘油的含量顯著減少。此外，3種膽汁酸(T-BIL，DBIL和IBIL)都有所減少，而膽汁酸也跟脂肪的吸收代謝相關(guān)，這暗示著mLeg1^Δ/Δ小鼠的代謝，尤其是脂肪代謝可能出現(xiàn)異常。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對小鼠進(jìn)行了甄別代謝是否紊亂的經(jīng)典實驗：葡萄糖耐受實驗。

7.2葡萄糖耐受實驗，具體方法如下。

7.2.1實驗前小鼠饑餓過夜使血糖降低到最低水平，按1g葡萄糖每kg小鼠體重的量腹腔注射葡萄糖液(葡萄糖溶于滅菌PBS中)，分別在注射后0min，15min，30min，60min和90min檢測小鼠血糖含量。血糖含量通過Roche血糖儀(ACCU CHEK)檢測。結(jié)果如圖8中的(b)所示。

由圖8中的(b)所顯示的結(jié)果可知(圖8的(b)中：實線為mLeg1^Δ/Δ小鼠，虛線為野生型小鼠)，腹腔注射了葡萄糖的野生型小鼠由于葡萄糖被吸收，血糖先是上升，在注射后30min達(dá)到頂點，而為了維持機(jī)體的血糖平衡，機(jī)體會通過分泌胰島素降低血糖含量，因此在注射葡萄糖30min后，野生型小鼠的血糖開始緩慢下降。而注射了葡萄糖的mLeg1^Δ/Δ小鼠，葡萄糖卻以更快的速度被吸收并進(jìn)入血液循環(huán)，注射后10min，血糖含量就已達(dá)到最高點，且比野生型小鼠的血糖最高點更高。另一方面，mLeg1^Δ/Δ小鼠的血液中的葡萄糖也以更快的速率回到平衡狀態(tài)。因此，盡管mLeg1^Δ/Δ小鼠保留了的血糖吸收和調(diào)控機(jī)能，但mLeg1^Δ/Δ小鼠的代謝出現(xiàn)了某種程度的異常。

實施例8

檢測mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟脂肪含量

肝臟是哺乳動物體內(nèi)最大的器官，是機(jī)體代謝的中樞所在，是脂類合成代謝和分解代謝的重要場所。此外，當(dāng)肝臟合成脂肪時需要通過血液循環(huán)運(yùn)往脂肪組織，當(dāng)機(jī)體處于饑餓狀態(tài)，需要利用脂肪時，脂肪組織儲存的脂肪需要通過血液循環(huán)運(yùn)往肝臟進(jìn)行利用。通過對小鼠血清中的脂肪含量檢測來驗證mLeg1敲除影響了肝臟的功能。

8.1檢測血清中的脂肪含量。實驗方法如下。

8.1.1取10周齡野生型和mLeg1^Δ/Δ小小鼠的血清，在儀器上檢測血清中的三酰甘油和膽固醇含量，重復(fù)3次，結(jié)果以平均值表示。結(jié)果如圖8中的(c)所示。

由圖8中的(c)可知(圖8的(c)中：灰色柱狀為mLeg1^Δ/Δ小鼠，白色柱狀為野生型小鼠，TRIG代表三酰甘油，TCHOL代表膽固醇)，mLeg1^Δ/Δ小鼠血液中三酰甘油減少，只有野生型小鼠的一半左右。

8.2檢測肝臟組織中的脂肪含量。

上述結(jié)果暗示mLeg1敲除影響了肝臟的功能。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對肝臟進(jìn)行重點研究，對肝臟脂肪含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖8中的(d)所示。

由圖8中的(d)可知(圖8的(d)中：灰色柱狀為mLeg1^Δ/Δ小鼠，白色柱狀為野生型小鼠，TRIG代表三酰甘油，TCHOL代表膽固醇)，在肝臟中，三酰甘油也是顯著的減少，同時，mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中膽固醇的含量也顯著地減少。

實施例9

mLeg1敲除小鼠脂肪組織中脂肪儲存量減少。

mLeg1^Δ/Δ小鼠血液和肝臟中脂肪含量的減少促使本發(fā)明的發(fā)明人去研究脂肪的儲存場所，也即脂肪組織中的脂肪含量是否減少。小鼠的脂肪組織主要有腹部脂肪組織和背部脂肪組織。

10.1分別檢測小鼠的腹部脂肪組織和背部脂肪組織的脂肪含量，實驗方法如下。

10.1.1小鼠猝死后，采用常規(guī)方法解剖觀察腹部和背部脂肪。結(jié)果如圖9所示。

由圖9中的(a)和(b)的顯示結(jié)果可知，10周齡的mLeg1^Δ/Δ小鼠中，背部脂肪組織中的脂肪含量減少的尤為明顯，而腹部脂肪組織中脂肪含量也有一定程度的減少(如圖9中的(c)和(d)所示)。因此mLeg1的敲除，確實減少了小鼠體內(nèi)的脂肪儲存。

10.2小鼠在高脂喂食條件下的生長情況

上述結(jié)果，也進(jìn)一步促使本發(fā)明的發(fā)明人猜想小鼠是否會對高脂食物喂食引起的肥胖產(chǎn)生抵抗。通過對不同類型的小鼠持續(xù)地喂食高脂飼料。實驗方法如下。

10.2.1在鼠籠中提供充足的正常食物或高脂食物，讓小鼠自由采食。

10.2.2在不同的時間點(4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、22、24周齡)檢測其體重，重復(fù)兩次，每次每組3到6只小鼠，結(jié)果以平均值表示。以檢測時間點為橫坐標(biāo)，以體重值(單位為g)為縱坐標(biāo)，繪制小鼠的體重變化曲線圖，結(jié)果圖10中的(a)所示。

由圖10中的(a)可知(圖中：chow代表正常食物飼養(yǎng)、HFD代表高脂飼料飼養(yǎng)、mLeg1^Δ/Δchow代表采用正常食物飼養(yǎng)的mLeg1^Δ/Δ、mLeg1^Δ/ΔHFD代表采用高脂食物飼養(yǎng)的mLeg1^Δ/Δ、wt chow代表采用正常食物飼養(yǎng)的野生型小鼠、wt HFD代表采用高脂食物飼養(yǎng)的野生型小鼠)，當(dāng)給野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠進(jìn)行正常食物的喂食時，兩種小鼠的體重都隨著年齡增長而增長。而當(dāng)用高脂食物代替正常食物進(jìn)行喂食時，野生型的小鼠由于獲取過多的能量并將這些能量以脂肪的形式進(jìn)行儲存，因此，野生型的小鼠在高脂喂食的情況下，體重快速增長，并最終發(fā)展成為肥胖癥。同時，突變體小鼠在高脂喂食下，體重增長與正常飲食的小鼠并無明顯差別。

另外，當(dāng)用高脂食物進(jìn)行喂食六個月后，野生型小鼠體型增大，腹部和背部存在很厚的脂肪層，表現(xiàn)出非常明顯的肥胖癥狀，而mLeg1^Δ/Δ小鼠則繼續(xù)保持著在正常喂食情況下小鼠的體型(如圖10中的(b)所示)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實mLeg1的功能確實與脂肪代謝息息相關(guān)。

實施例10

脂肪酸合成能力的減弱導(dǎo)致mLeg1^Δ/Δ小鼠脂類減少

10.1檢測肝臟中β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平

脂肪含量的減少一方面可能是脂肪消耗增加，另一方面則可能脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。脂肪酸的分解代謝主要在肝臟中通過β氧化實現(xiàn)。因此，通過熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平來驗證mLeg1^Δ/Δ小鼠脂肪含量的減少是由脂肪消耗增加還是脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。實驗方法如下。

10.1.1采用qRT-PCR檢測野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟β氧化相關(guān)酶基因(FBP1/PCX/ACOX/PEPCK)的表達(dá)水平，每組取三只獨(dú)立的小鼠，基因表達(dá)量以β-actin為參照歸一化后，表達(dá)量以平均值表示。qRT-PCR的檢測方法如下(后文同此)：

(1)RNA提取：操作方法同實施例1中的1.1RNA提取步驟，或者直接采用實施例1中的1.1RNA提取步驟所提取出的RNA樣本進(jìn)行檢測。(2)RNA純化：由于Trizol法抽提的總RNA可能會含有基因組DNA的污染，因此，用于熒光定量PCR的RNA樣品先用DNA酶消化除去可能的存在的DNA。50μl反應(yīng)體系中，按每10μg總RNA加入2單位無RNA酶污染的DNaseI(NEB Cat.No.M0303S)，加入5μl 10x的反應(yīng)緩沖液，用DEPC水補(bǔ)齊到50μl。37℃反應(yīng)20min后用Mini Kit(QIAGEN Cat.NO.74106)進(jìn)行RNA純化。(3)RNA逆轉(zhuǎn)錄：純化后的RNA經(jīng)上述步驟逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(M-MLV First Strand Kit，Life Technologies，Cat.No.C28025-032)合成cDNA。(4)合成步驟如下：取1μg提取的RNA樣品，加入1μl 50μM的OligodT，加入1μl 10mM dNTP，用水補(bǔ)齊到10μl。65℃變性5min，冰上至少1分鐘。加入10μl cDNA混合物(4μl 5x First Line Buffer，2μl 0.1M DTT，1μl M-MLVRT酶，3μl DEPC水)。37℃反應(yīng)50min后在70℃15min終止反應(yīng)。合成的cDNA用于后續(xù)實驗或保存于-20冰箱中。

(5)熒光定量PCR：以得到的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。熒光定量反應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品說明書使用SsoFastTM EvaSupermix試劑盒(Bio-Rad Cat.No.172-5201)進(jìn)行。每個反應(yīng)以10μl體系進(jìn)行，其中含cDNA模板0.5μl，Supermix 5μl，10μM正反向引物各0.5μl，雙蒸水3.5μl。熒光定量PCR所用正反向引物為：正向引物beta actin Fwd：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA；反向引物beta actin Rv：GCCGGACTCATCGTACTCC。熒光信號的定量通過CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad C1000TM Thermal Cycler)進(jìn)行。各基因所用引物如表1所示。

檢測結(jié)果如圖11的(a)所示。

表1.本發(fā)明實施例進(jìn)行qRT-PCR所用的引物序列表

由圖11中的(a)可知(圖11的(a)中：縱坐標(biāo)為相對表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為相關(guān)的β氧化酶基因的相對表達(dá)水平)，脂肪酸的分解代謝主要在肝臟中通過β氧化實現(xiàn)，對比野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中β氧化相關(guān)酶類的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)mLeg1基因的敲除并沒有造成這些基因表達(dá)的異常升高，說明mLeg1的敲除并沒有加速β氧化的發(fā)生，即并沒有造成脂肪消耗的增加。mLeg1^Δ/Δ小鼠的脂肪減少由脂肪酸或三酰甘油合成減少所致。

10.2檢測肝臟中脂肪酸合成相關(guān)酶類的表達(dá)水平，實驗方法如下。

10.2.1采用與10.1.1類似的方法檢測野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟脂肪酸合成相關(guān)酶(ACC1/ACC2/FAS/SCD1/ACL/GPAT1/DGAT1/DGAT2)的表達(dá)水平，所用引物如下表1所示。

檢測結(jié)果如圖11中的(b)所示。

由圖11中的(b)可知(圖11的(b)中：縱坐標(biāo)為相對表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為脂肪酸合成相關(guān)酶)，通過比較野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中脂肪酸合成相關(guān)酶類的表達(dá)譜時，發(fā)現(xiàn)這些酶的表達(dá)均有不同程度的降低。脂肪酸從頭合成相關(guān)的幾個酶的表達(dá)都有不同程度的減少，基本為野生型的一半左右。其中，ACC1，ACC2，F(xiàn)AS和DGAT1在mLeg1^Δ/Δ敲除小鼠中都顯著減少。

當(dāng)進(jìn)一步的觀察這些基因在脂類合成過程中發(fā)揮的作用時，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這些基因編碼催化從三羧酸循環(huán)產(chǎn)物到脂肪酸合成一系列生化反應(yīng)的酶類(如圖12所示，圖中：方框標(biāo)注的是mLeg1敲除后差異表達(dá)的基因)。這些基因(SCD1/FASN/ACC/ACL)的表達(dá)下調(diào)，意味著mLeg1^Δ/Δ小鼠的肝臟中脂肪從頭合成能力的減弱，即將其它能源物質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸并進(jìn)行脂肪存儲的能力顯著減弱。肝臟內(nèi)合成脂肪的減少，解釋了肝臟內(nèi)部血管附近中性脂肪的減少，解釋了mLeg1^Δ/Δ小鼠血液中三酰甘油為何減少，也解釋了mLeg1^Δ/Δ小鼠脂肪組織脂肪減少的原因。

實施例11

11.1檢測調(diào)控脂類合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平

調(diào)控脂類合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子主要有4個，PPARγ，chrebp，PGC1α和srebp1c。因此，本發(fā)明的發(fā)明人先對肝臟中這幾個轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平進(jìn)行研究。實驗方法如下。

11.1.1采用與步驟11.1.1類似的方法檢測野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ，chrebp，PGC1α和srebp1c)表水平具體實驗方法可參考實施例2中的步驟2.1-2.4，所用的相關(guān)引物見表1，檢測結(jié)果如圖13所示。

由圖13可知(圖中：縱坐標(biāo)為相對表達(dá)水平，橫坐標(biāo)為調(diào)控脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子)，4種轉(zhuǎn)錄因子(PPARγ，chrebp，PGC1α和srebp1c)中只有srebp1c的表達(dá)在mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中顯著減少，因此，mLeg1^Δ/Δ小鼠中肝臟的脂類合成酶的表達(dá)下降是srebp1c表達(dá)減少所致。

實施例12

12.1mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中的Akt的磷酸化水平

Srebp1c的活性調(diào)控主要有兩種方式：其一是未被磷酸化的Srebp1c通常駐留在細(xì)胞質(zhì)中，而Akt通過mTORC1調(diào)控Srebp1c的磷酸化，從而使得其從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核中，并發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性；其二是Akt可以以一種不是特別明了的機(jī)制正向調(diào)控srebp1c的轉(zhuǎn)錄水平。因此Srebp1c的活性調(diào)控主要是通過Akt的活性來實現(xiàn)的。

本實施例中，本發(fā)明的發(fā)明人檢測脂類合成中心肝臟，以及mLeg1表達(dá)的唾液腺中Akt活性水平。而Akt的活性可以用其磷酸化水平來指示。因此，可通過檢測磷酸化水平來反應(yīng)Akt的活性。實驗方法如下。

12.1.1按步驟3.1方法提取肝臟，唾液腺蛋白，通過Western blot，使用Akt磷酸化抗體(Cell signalling#4060P)檢測Akt的磷酸化水平。

檢測結(jié)果如圖14中的(a)和(b)所示。

由圖14中的(a)和(b)可知(圖中：WT代表野生型小鼠，mLeg1^Δ/Δ代表mLeg1基因敲除小鼠)，mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中的Akt的磷酸化水平顯著低于野生型小鼠(如圖14的(a)所示)。而唾液腺中的Akt磷酸化的差異更為顯著，野生型小鼠中存在明顯的磷酸化Akt蛋白，而mLeg1^Δ/Δ小鼠的唾液腺中基本檢測不到Akt的磷酸化(如圖14的(b)所示)。這些結(jié)果都證明，mLeg1^Δ/Δ小鼠Akt的活性受到了抑制，也給出了srebp1c表達(dá)減少的解釋。

實施例13

唾液腺細(xì)胞分泌到上清液的因子可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞Akt磷酸化

為了驗證mLeg1的敲除是否和肝臟中Akt活性減弱直接相關(guān)，本發(fā)明的發(fā)明人首先采取體外的實驗系統(tǒng)檢測mLeg1能否能夠激活A(yù)kt。由于mLeg1是在小鼠唾液腺中豐富表達(dá)的分泌蛋白，如果對唾液腺細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，則可以在細(xì)胞培養(yǎng)上清中得到分泌出來的mLeg1。因此，本發(fā)明的發(fā)明人對唾液腺原代培養(yǎng)的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行Western blot檢測。實驗方法如下。

13.1唾液腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)：

13.1.1小鼠斷頸處死后，迅速的取下唾液腺，并用滅菌的PBS清洗兩次，除盡粘附的毛發(fā)。用剪刀將取下的唾液腺剪碎。

13.1.2以40mg/ml的比例將剪碎的唾液腺收集到buffer中(體積為V)。每2ml buffer中加入25μl透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase)，25μl二型膠原酶(collagenase II)和250μl 50mM的CaCl₂，于37℃孵育40min。

13.1.3 1500rpm離心去上清，并重復(fù)步驟13.1.2。

13.1.4 1500rpm離心去上清，并用V體積的buffer清洗，離心去上清，再用1/2V的buffer重復(fù)清洗一次，離心去上清。

13.1.5用1/2V的buffer重懸浮離心下來的組織，并用細(xì)胞過濾器(Cell strainer，BD Cat.NO.352340)過濾取濾液用MSG培養(yǎng)液培養(yǎng)。

其中，所用溶液配方如下：

Buffer：(1％BSA(Amresco Cat.NO.0332)in Hank’s buffer(Beyotime，Cat.NO.C0218))。

重組酶配方：用buffer溶解透明質(zhì)酸酶(Sangon Biotech，Cat.NO.A002594)，濃度為40mg/ml；用buffer溶解二型膠原酶(GIBCO Cat.NO.17101-015)，濃度為23mg/ml。酶溶液均新鮮配置為宜。

MSG培養(yǎng)液：DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO Cat.NO.11965-092)，1X的青霉素和鏈霉素(Beyotine，Cat.NO.C0222)，1X的insulin-transferin-Selenium-X(GIBCO，Cat.NO.41400-045)，1μM的dexamethasone(Sigma D4902)，10％的胎牛血清(GIBCO Cat.NO.16000-044)。

13.2提取經(jīng)原代培養(yǎng)后的唾液腺細(xì)胞的總蛋白：取上述步驟得到的培養(yǎng)液，于1000g離心5min，棄上清后加入SDS裂解液(63mM Tris-Hcl，PH6.8，10％甘油，5％β-巰基乙醇，3.5％SDS，1X的Complete)裂解，100℃變性7min后進(jìn)行后續(xù)Western blot檢測分析或保存于-20℃中。(對于貼壁細(xì)胞，按如下進(jìn)行：去培養(yǎng)上清后，加入SDS裂解液，用細(xì)胞刮刮下貼壁細(xì)胞后收集于1.5ml離心管中。100℃變性7min后進(jìn)行后續(xù)Western blot檢測分析或保存于-20℃中)。

13.3直接取原代培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)上清用于后續(xù)進(jìn)行Western blot檢測。

13.4Western blot檢測的方法同步驟實施例3的步驟3.2。檢測結(jié)果如圖14中的(c)所示。

由圖14中的(c)可知(圖14的(c)中：CK media代表未培養(yǎng)唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，salivary media代表培養(yǎng)了野生型唾液腺細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)液，salivary cell代表唾液腺原代培養(yǎng)的細(xì)胞)，細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中都存在mLeg1蛋白，并且通過檢測細(xì)胞中的Akt蛋白量確證細(xì)胞培養(yǎng)上清中的mLeg1并不是由于細(xì)胞污染導(dǎo)致的。

實施例14

在實施例13的實驗基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人用這種含有mLeg1的培養(yǎng)液(來自野生型唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)和不含mLeg1蛋白的培養(yǎng)液(來自mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)去培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，研究唾液腺分泌物能否直接促進(jìn)肝癌細(xì)胞Akt的磷酸化，并且這種誘導(dǎo)激活磷酸化Akt的能力在有無mLeg1蛋白條件下是否存在差異。實驗方法如下。

14.1人肝癌細(xì)胞HepG2培養(yǎng)：用DMEM高糖型培養(yǎng)基加入10％的新生牛血清(GIBCO Cat.NO.16010-159)培養(yǎng)在5％CO₂，37℃的恒溫及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時，除盡培養(yǎng)液，用0.25％胰酶(EDTA-free，Sigma Cat.NO.T4549)適時消化，取適量細(xì)胞傳代培養(yǎng)或后續(xù)實驗。

14.2以原代培養(yǎng)野生型小鼠唾液腺細(xì)胞和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育貼壁生長的HepG2細(xì)胞，分別在20分鐘和10小時后收集細(xì)胞樣品。

14.3通過Western blot，用Akt磷酸化抗體檢測p-Akt的含量，以反應(yīng)Akt的磷酸化水平。

14.4結(jié)果如圖14中的(d)所示。

由圖14中的(d)可知(圖14的(d)中：CK代表mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，mLeg1代表野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)，不論是培養(yǎng)HepG2細(xì)胞10小時，還是20分鐘，用野生型唾液腺細(xì)胞上清培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的Akt的磷酸化水平都顯著高于用mLeg1^Δ/Δ上清培養(yǎng)的細(xì)胞，并且在短短的20分鐘內(nèi)mLeg1就可以誘導(dǎo)Akt的磷酸化，證明野生型小鼠唾液腺分泌物確實能夠促進(jìn)Akt磷酸化，而當(dāng)mLeg1敲除后，唾液腺分泌物對Akt激活的能力顯著下降，證明唾液腺分泌的mLeg1可以直接或間接的對Akt進(jìn)行活性調(diào)節(jié)。

實施例15

唾液腺細(xì)胞分泌到上清液的因子可以誘導(dǎo)mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟Akt的磷酸化

上述體外實驗證明野生型唾液腺細(xì)胞分泌物能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的Akt的磷酸化。進(jìn)一步的，本發(fā)明的發(fā)明人對這些分泌物能否對體內(nèi)的肝臟Akt的磷酸化水平進(jìn)行調(diào)控進(jìn)行研究。實驗方法如下。

15.1分別采用腹腔注射和尾靜脈注射方法將野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞分泌的上清注射到mLeg1^Δ/Δ小鼠中。

15.2注射后1小時猝死小鼠，收集肝臟，并通過Western Blot，使用Akt磷酸化抗體檢測肝臟中Akt的磷酸化水平是否發(fā)生變化。結(jié)果如圖15中的(a)所示。

由圖15中的(a)可知(圖15的(a)中：WT代表野生型小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，mLeg1^Δ/Δ代表mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清，lumbar代表腹腔注射，vein代表尾靜脈注射)，不論是腹腔注射或尾靜脈注射的野生型的唾液腺細(xì)胞分泌物都能促進(jìn)mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟Akt的磷酸化。以上結(jié)果證明，含mLeg1的唾液腺分泌物同樣可以對體內(nèi)肝臟中的Akt磷酸化進(jìn)行調(diào)控，此外，該結(jié)果還暗示唾液腺分泌物可以通過血液運(yùn)輸最終到達(dá)肝臟發(fā)揮作用。

實施例16

從唾液腺純化所得的不同濃度的mLeg1蛋白誘導(dǎo)Akt的磷酸化

野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞最直接的差別在于它們能否表達(dá)mLeg1，那么，野生型和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞分泌物造成的Akt磷酸化差異是否是由mLeg1直接造成的，即mLeg1蛋白是否能夠直接誘導(dǎo)Akt的磷酸化。本發(fā)明的發(fā)明人通過如下實驗方法進(jìn)行研究。

16.1柱層析分離純化的mLeg1蛋白誘導(dǎo)Akt的磷酸化水平。實驗方法如下。

16.1.1取兩到三只野生型小鼠的唾液腺，置于預(yù)冷的PBS緩沖液中漂洗，取出后用剪刀剪成細(xì)小的碎片，之后轉(zhuǎn)移到組織勻漿器中。加入4ml裂解液(50mM的Tris-Hcl，PH 8.0，150mM的NaCl，0.5％的NP40，2x的complete)，冰上充分勻漿。之后用23G針頭反復(fù)抽碎，4℃垂直搖床孵育30min，4℃離心機(jī)12000g離心15min，取上清。

16.1.2將上清在4℃中勻速通過sephalose 6B分子篩，其中洗脫用PBS緩沖液。以4ml/管收集不同洗脫組分。

16.1.3并通過Western blot檢測各組分中mLeg1的含量。取mLeg1含量最高的一管為純化的mLeg1，并以大腸桿菌中重組表達(dá)的mLeg1蛋白為對照，估算mLeg1的濃度，并用于后續(xù)實驗。

16.1.4將純化的mLeg1蛋白稀釋至不同的濃度(分別為3.14x10^-2ng/μl、0.314ng/μl和3.14ng/μl)分別加入HepG2培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2中，37℃孵育20分鐘后，然后提取細(xì)胞總蛋白(提取方法參考步驟13.2)，并通過Western blot檢測各濃度下的Akt的磷酸化水平(參考步驟14.3，相應(yīng)抗體選用抗p-Akt抗體(S473，Cell signalling#4060P)，使用時稀釋比例為1:1000)。結(jié)果如圖15中的(b)所示。

由圖15中的(b)可知(圖15的(b)中：A代表3.14ng/μl、B代表0.314ng/μl、C代表3.14x10^-2ng/μl、“-”代表未加入)，mLeg1蛋白可以誘導(dǎo)Akt的磷酸化，并且納克級的mLeg1即可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化。

16.2來自野生型小鼠和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺的組分誘導(dǎo)Akt的磷酸化水平。實驗方法如下。

16.2.1分別提取野生型小鼠和mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺富含mLeg1蛋白的組分。

16.2.2將16.2.1提取的組分分別加入到HepG2培養(yǎng)基中培養(yǎng)HepG2，37℃孵育20分鐘后，然后提取培養(yǎng)后的細(xì)胞的總蛋白(提取方法可參考步驟13.2)。

16.2.3通過Western blot檢測各濃度下的Akt的磷酸化水平(具體可參考步驟13.2，相應(yīng)抗體選用抗p-Akt抗體(S473，Cell signalling#4060P)，使用時稀釋比例為1:1000)。結(jié)果如圖16中的(a)所示。

由圖16中的(a)可知(圖16的(a)中：“-”代表mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺總蛋白，“+”代表野生型小鼠唾液腺總蛋白)，野生型小鼠唾液腺含mLeg1組分誘導(dǎo)Akt磷酸化顯著強(qiáng)于mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺相應(yīng)組分。

實施例17

mLeg1激活A(yù)kt依賴PI3K通路

由于mLeg1是一個細(xì)胞分泌蛋白，而用mLeg1培養(yǎng)HepG2細(xì)胞的實驗中，mLeg1相當(dāng)于一個細(xì)胞外蛋白，同時Akt的磷酸化是細(xì)胞內(nèi)的一個重要的信號傳遞過程，因此，這里涉及細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)化為激活細(xì)胞內(nèi)信號的過程?？v觀已知的細(xì)胞外信號誘導(dǎo)的Akt磷酸化，主要依賴于PI3K磷酸化PIP2，并將其轉(zhuǎn)化為PIP3，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)Akt的磷酸化。因此，mLeg1誘導(dǎo)的Akt磷酸化可能也依賴PI3K通路。本發(fā)明的發(fā)明人選用PI3K的特異性抑制劑LY290004抑制PI3K信號通路，并觀察PI3K通路被抑制后，mLeg1對Akt激活能力是否發(fā)生改變。實驗方法如下。

17.1處理前，HepG2細(xì)胞用0.1％血清饑餓培養(yǎng)過夜，用0.25％胰酶(EDTA-free，Sigma Cat.NO.T4549)適時消化，取適量細(xì)胞置于離心管中，

17.2用野生型(含mLeg1)和mLeg1^Δ/Δ(不含mLeg1)小鼠唾液腺細(xì)胞原代培養(yǎng)的上清液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，并在野生型小鼠唾液腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中加入不同濃度(低到高依次為10μM，20μM和40μM)的PI3K抑制劑LY290004(cell signaling)抑制PI3K通路。

17.3通過Western blot檢測各濃度下的Akt的磷酸化水平，具體操作可參考步驟18.2.2。檢測結(jié)果如圖16中的(b)所示。

17.4另外，在步驟17.1之后，用柱層析純化的mLeg1和10μM的LY290004培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min，1000g離心5min去上清。加入SDS裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白(具體操作可參考步驟13.2)。

17.5通過Western blot檢測HepG2細(xì)胞的Akt的磷酸化水平。檢測結(jié)果如圖16中的(c)所示。

由圖16中的(b)可知(圖16的(b)中：WT media代表野生型小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清，“-”代表未加入，A代表加入濃度為10μM，B代表加入濃度為10μM，C代表加入濃度為10Μm，CK media代表mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清)，野生型小鼠唾液腺原代培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清(WT media)激活A(yù)kt的能力顯著強(qiáng)于mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺細(xì)胞培養(yǎng)上清(CK media)，當(dāng)在WT media里面加入不同濃度PI3K抑制劑LY29004時，均可以非常顯著地抑制野生型小鼠的唾液腺成分引起的Akt的磷酸化。說明，當(dāng)加入LY290004時，含mLeg1的培養(yǎng)液不再能誘導(dǎo)Akt的磷酸化，并且細(xì)胞內(nèi)的Akt磷酸化保持在非常低的水平。而PTEN的磷酸化水平并沒有隨著LY290004的加入升高，證明這種Akt磷酸化水平的抑制并不是由于PTEN引起的。

同時，由圖16中的(c)可知(圖16的(c)中：上排中的“-”代表mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺，“+”代表野生型小鼠唾液腺；下排中的“-”代表加入LY29004，“+”代表未加入LY29004)，本發(fā)明的發(fā)明人在HepG2培養(yǎng)基中加入柱層析純化的mLeg1和10μM LY290004，發(fā)現(xiàn)LY290004能夠完全的抑制mLeg1對Akt磷酸化的誘導(dǎo)。因此，mLeg1誘導(dǎo)的Akt磷酸化依賴于PI3K信號通路。

實施例18

mLeg1通過RTK激活A(yù)kt

細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)需要經(jīng)過細(xì)胞膜，而連接細(xì)胞外信號與細(xì)胞內(nèi)PI3K信號的一類膜蛋白即受體酪氨酸激酶(Receptor tyrosine kinase，RTK)。RTK與相應(yīng)配體結(jié)合后能夠自身磷酸化并磷酸化下游底物，并且這種磷酸化發(fā)生在酪氨酸殘基上，因此，可以通過檢測細(xì)胞內(nèi)總酪氨酸磷酸化的水平差異來甄別mLeg1誘導(dǎo)的Akt磷酸化是否是通過RTK來實現(xiàn)的。實驗方法如下。

18.1往HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基中加入mLeg1并培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，然后提取細(xì)胞總蛋白。

18.2通過酪氨酸磷酸化抗體4G10(Millipore，05-321)檢查細(xì)胞內(nèi)的總的酪氨酸磷酸化的水平。結(jié)果如圖16中的(d)所示。

由圖16中的(d)可知(圖16的(d)中：CK為未加入mLeg1)，mLeg1蛋白加入后，細(xì)胞內(nèi)的酪氨酸磷酸化水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照組。此外，Western結(jié)果也指示，發(fā)生酪氨酸磷酸化的蛋白的分子量都較大，這與RTK的分子量都較大非常吻合。進(jìn)一步暗示著mLeg1促進(jìn)Akt的磷酸化是很可能是通過RTK來實現(xiàn)的。

實施例19

mLeg1激活EGFR

人類基因組中，總共有58個基因編碼RTK，因此，本發(fā)明的發(fā)明人決定研究mLeg1是具體通過激活哪個RTK來傳遞信號的，這里本發(fā)明的發(fā)明人選取了R&D的RTK篩選系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過將49個RTK的抗體分別交聯(lián)在同一張膜上，通過這些抗體將細(xì)胞裂解液中的相應(yīng)的RTK蛋白拉下并附著在膜上?；赗TK激活會在自身的酪氨酸上發(fā)生磷酸化特性，可以通過酪氨酸磷酸化抗體檢測各個附著的RTK酪氨酸磷酸化水平，用以指示RTK的激活情況。實驗方法如下。

19.1受體酪氨酸激酶的的篩選通過RTK assay kit(Proteome Profiler Human Phospho-RTK Array Kit，R&D Cat.no.ARY001B)依說明書進(jìn)行操作。該kit總共可以檢測58個RTK中的49個，操作步驟簡而言之，用mLeg1和對照分別處理細(xì)胞(長滿于10cm培養(yǎng)皿)，用500μl lysis buffer17裂解細(xì)胞。RTK篩選膜經(jīng)Assay buffer1封閉1小時后，敷上細(xì)胞裂解液結(jié)合過夜，通過1X Wash Buffer洗3次，每次10分鐘，加入用1X Array Buffer2以1：5000倍稀釋的Anti-Phospho-Tyrosine-HRP Detection Antibody，室溫孵育2小時。1X Wash Buffer洗3次，每次10分鐘后，敷上Chemi Reagent Mix顯影，通過熒光化學(xué)發(fā)光成像儀(Clinx Science Instruments Cat.No.3400)里成像收集信號。結(jié)果圖17所示。

由圖17可知，HepG2細(xì)胞中大部分RTK的活性并不受是否加入mLeg1的影響，都保持在較低的水平，而只有EGFR(如圖17中圓圈圈出的點所示)在mLeg1摻入后，其酪氨酸磷酸化顯著增加，意味著mLeg1加入，激活了EGFR，并進(jìn)一步激活下游Akt信號。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的發(fā)明人通過EGFR的磷酸化特異性抗體檢測mLeg1對細(xì)胞內(nèi)EGFR的激活水平的影響，由圖18的(a)的結(jié)果也顯示(圖18的(a)中：“-”代表未加入，“+”代表加入)，mLeg1的摻入可以非常迅速地激活EGFR受體，并在之后激活A(yù)kt信號。

實施例20

mLeg1激活A(yù)kt依賴EGFR的激活

由實施例21的RTK的篩選結(jié)果顯示mLeg1很可能通過EGFR的激活來誘導(dǎo)Akt的磷酸化，如果通過EGFR的抑制劑抑制EGFR的活性能阻斷mLeg1誘導(dǎo)的Akt的磷酸化，則將進(jìn)一步證實mLeg1是通過EGFR來激活A(yù)kt的。這里本發(fā)明的發(fā)明人選取EGFR的特異性抑制劑AG1478來抑制EGFR的活性。實驗方法如下。

20.1HepG2細(xì)胞培養(yǎng)，具體可參考步驟18.1。

20.2往細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入添加物(BSA、mLeg1、AG1478)，進(jìn)行處理，培養(yǎng)15分鐘后，提取總蛋白(參考步驟13.2)，并進(jìn)行Western blot檢測各處理組中的各蛋白(p-Akt、Akt、P-EGFR)水平(參考步驟2.2)。結(jié)果如圖18中的(b)所示。

由圖18中的(b)可知，當(dāng)HepG2細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入柱層析分離的mLeg1時，可以誘導(dǎo)Akt磷酸化，而加入牛血清白蛋白的BSA對照組，Akt磷酸化基本不受影響。當(dāng)往培養(yǎng)基中再加入1μM的AG1478抑制EGFR活性時，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)mLeg1誘導(dǎo)的Akt磷酸化被阻斷。同時，對EGFR的磷酸化水平研究發(fā)現(xiàn)，mLeg1處理誘導(dǎo)了EGFR的磷酸化，而加入AG1478后，EGFR的激活則被抑制。因此，mLeg1誘導(dǎo)Akt的磷酸化依賴于細(xì)胞膜表面的EGFR受體的激活。

實施例21

mLeg1與EGFR受體存在蛋白與蛋白間的互作

以上的結(jié)果顯示mLeg1可以通過EGFR激活PI3K信號，從而誘導(dǎo)Akt的磷酸化。EGFR是細(xì)胞膜表面的一個受體蛋白，而mLeg1是一個分泌蛋白，因此mLeg1可能直接與EGFR結(jié)合，作為一個信號分子直接激活下游信號。因此，本發(fā)明的發(fā)明人接著通過免疫共沉淀檢測mLeg1與EGFR之間是否存在互作。

由于以上結(jié)果顯示mLeg1能夠影響肝臟的功能，本發(fā)明的發(fā)明人通過將柱層析分離純化的mLeg1蛋白去孵育肝臟勻漿分離得到的細(xì)胞。由于mLeg1激活EGFR的反應(yīng)非常迅速，而激活后的EGFR很快走向降解，因此，本發(fā)明的發(fā)明人用mLeg1在4℃孵育肝細(xì)胞，同時加入交聯(lián)劑DSP穩(wěn)定mLeg1和其潛在互作蛋白的相互作用，隨后將mLeg1洗凈并通過NP40裂解液裂解肝細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀。實驗方法如下。

21.1抗體交聯(lián)：取30μl proteinA/G(beyotime Cat.NO.P2012)，低速(500～1000g)離心去上清。4℃預(yù)冷的PBS清洗兩次后加入抗體(20μg抗體溶于1X 100μl PBS中)，室溫孵育30min。離心去上清。用300μl PBS清洗3次珠子，加入50μl DSS溶液(5μl 10x PBS，36μl H2O，9μl 2.5mM DSS(Thermo，Cat.No.21655)，室溫孵育50分鐘。離心去上清后，用50μl 100mM PH2.2甘氨酸清洗珠子3次，300μl含1％NP40的PBS清洗兩次，最后用300μl PBS清洗一次。交聯(lián)抗體的珠子保持濕潤，使用前離心棄盡上清。

21.2通過柱層析分離，得到野生型唾液腺的含mLeg1的組分以及mLeg1^Δ/Δ小鼠唾液腺不含mLeg1的組分。

21.3用上述組分分別孵育肝臟勻漿分離得到的細(xì)胞，4℃孵育肝細(xì)胞，同時加入交聯(lián)劑DSP穩(wěn)定mLeg1和其潛在互作蛋白的相互作用。

21.4免疫共沉淀：組織或細(xì)胞通過NP40裂解液(50mM的Tris-Hcl，PH 8.0，150mM的NaCl，1％的NP40，2Mm EDTA，1mM PMSF，2x的complete)充分勻漿，4℃垂直搖床充分裂解15min，4℃下12000g離心15min，取上清用于后續(xù)操作。往上清中加入交聯(lián)了抗體的珠子，4℃孵育過夜后。用4℃預(yù)冷的PBST(0.1％Tween 20)清洗3次，再用預(yù)冷PBS清洗兩次。加入50μl 100mM PH2.2甘氨酸洗脫珠子上結(jié)合的蛋白，加入2μl 1M PH9.5的甘氨酸中和PH后于-20℃保存或是直接后續(xù)分析。

21.5通過Western Blot檢測mLeg1抗體拉下來的蛋白。結(jié)果如圖18中的(c)所示。

由圖18中的(c)可知(圖18的(c)中：input代表用于免疫共沉淀實驗的蛋白；“-”代表為灌胃mLeg1蛋白的對照組；“+”代表灌胃mLeg蛋白的實驗組；IP:α-mLeg1代表mLeg1抗體結(jié)合并拉下mLeg1蛋白及其相互作用蛋白)，未加入mLeg1的肝細(xì)胞中的EGFR并不能被mLeg1的抗體拉下，而加入mLeg1后，mLeg1抗體共沉淀組分中除了含有mLeg1蛋白外，還含有EGFR蛋白，因此，mLeg1與EGFR之間確實存在相互作用。

實施例22

上述的研究表明mLeg1調(diào)節(jié)肝臟Akt活性的功能是通過結(jié)合并激活EGFR來實現(xiàn)的，這需要mLeg1能夠到達(dá)肝臟并與EGFR相結(jié)合。本發(fā)明的發(fā)明人知道m(xù)Leg1在唾液腺中表達(dá)，并分泌入唾液中。那么這種口腔中的mLeg1是否能到達(dá)肝臟并與肝臟中的EGFR發(fā)生相互作用呢？為了模擬這一情況，通過如下實驗方法進(jìn)行了研究。

22.1將柱層析純化的mLeg1按每克小鼠體重用50ng的mLeg1從口腔灌胃入mLeg1^Δ/Δ小鼠中。

22.2灌胃后不同時間點(0、10、20、40、60min)將小鼠猝死并收集肝臟樣品，通過mLeg1的抗體對肝臟可能存在的mLeg1蛋白進(jìn)行免疫沉淀實驗，以檢測處理后mLeg1^Δ/Δ小鼠mLeg1蛋白與EGFR相互作用的結(jié)果，具體可參考步驟21.2-21.5。

借助上述方法模擬唾液腺分泌的mLeg1進(jìn)入消化道后的行為。

基于以上理論，mLeg1需要在肝臟中發(fā)揮作用，那么灌胃后小鼠的肝臟理應(yīng)存在mLeg1蛋白。結(jié)果如圖18中的(d)所示。

由圖18中的(d)可知，小鼠灌胃10分鐘后即可在其肝臟中檢測到mLeg1蛋白，并且蛋白量在灌胃20分鐘后達(dá)到最大值，灌胃40分鐘和60分鐘后肝臟中的mLeg1開始減少。同時，本發(fā)明的發(fā)明人觀察到灌胃10分鐘后，mLeg1結(jié)合的EGFR最多，之后結(jié)合的EGFR蛋白量隨著時間的延續(xù)不斷減少。這可能是由于mLeg1與EGFR快速結(jié)合并迅速傳遞下游信號所致：體外實驗中mLeg1在1分鐘之內(nèi)就可以激活EGFR，EGFR在3分鐘之內(nèi)磷酸化水平就開始減少。同時，本發(fā)明的發(fā)明人也檢查了這種灌胃的mLeg1蛋白對下游Akt的激活情況。mLeg1灌胃后10分鐘后，肝臟中的Akt磷酸化就有所增加，并且這種增加灌胃后40分鐘到60分鐘更為明顯。綜合以上結(jié)果，唾液腺分泌表達(dá)的mLeg1可以通過消化道被血液吸收，并最終到達(dá)臟并激活肝臟中的EGFR，從而激活A(yù)kt，最終對肝細(xì)胞的生理功能進(jìn)行調(diào)控。

實施例23

修飾缺陷的mLeg1蛋白有競爭性的抑制野生型mLeg1的功能

生物體內(nèi)的蛋白往往需要被正確的修飾才能發(fā)揮正確的功能。因此，修飾缺陷的mLeg1蛋白有可能也散失其激活A(yù)kt的能力，并同時有可能競爭性的抑制野生型mLeg1的功能。為了驗證這一猜想，本發(fā)明的發(fā)明人用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)重組的mLeg1蛋白(mLeg-Re)。由于大腸桿菌為原核生物，在該表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的真核蛋白往往會失去正確的修飾。實驗方法如下。

23.1以唾液腺cDNA為模板，采用引物mLeg1ATG BamHI fw：CTCAGTggatccATGGCTGTCCTGGCTTCC和mLeg1TAA XhoI Rv：TACCTCGAGAGAAGATGTTGCCAGGAACTCTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃3分鐘，95℃30秒，58℃30秒，72℃1分鐘，34個循環(huán)后，72℃10分鐘。將PCR產(chǎn)物純化，之后和Pet30(a)載體用BamHI和XhoI進(jìn)行酶切過夜。將酶切產(chǎn)物純化后，取PCR產(chǎn)物和載體各50ng，用T4DNA進(jìn)行連接。室溫反應(yīng)10分鐘后，將連接產(chǎn)物用感受態(tài)細(xì)胞DH5α轉(zhuǎn)化。步驟為冰上30秒，42℃熱激90秒，冰上2分鐘，之后加入1ml LB培養(yǎng)基，37℃搖菌1小時。取100ul菌液涂含KANA抗性的LB平板過夜。選取單克隆，測序確定單克隆中mLeg1片段的正確插入。將正確的單克隆用含KANA抗性的LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒。

表達(dá)mLeg1-Re蛋白的過程如下：將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入DE3表達(dá)感受態(tài)中，同樣的涂板，挑單克隆并測序驗證單克隆中含有正確的mLeg1質(zhì)粒。用含KANA抗性的LB過夜培養(yǎng)單克隆。取10ml過夜培養(yǎng)的菌液稀釋入1L的含KANA抗性的LB中，37℃下?lián)u菌培養(yǎng)至菌液OD值為0.5后，加入1mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)mLeg1-Re蛋白的表達(dá)。繼續(xù)搖菌培養(yǎng)4小時后離心收集菌體。加入10ml的裂解液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl和10mM咪唑，PH8.0)重懸浮菌液，加入1mg/ml的溶菌酶冰上反應(yīng)1小時。超聲破碎菌體后，加入4ml的Ni-NTA(QIAGEN，30230)的珠子，反應(yīng)過夜。4℃下1000g離心去上清，用4ml清洗液緩沖液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl和20mM咪唑，PH8.0)清洗兩次后，用4ml洗脫液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl和250mM咪唑，PH8.0)洗脫。將洗脫產(chǎn)物置入半透膜(Thermo，SnakeSkin Dialysis Tubing，#68100)，用PBS透析3天，每12小時更換一次PBS。最后得到的蛋白為mLeg1-Re蛋白，測濃度后保存于-80℃。

23.2通過Western blot檢測mLeg1-Re蛋白的大小。結(jié)果如圖19中的(a)所示。

23.3用提取的重組蛋白mLeg1-Re和野生型mLeg1蛋白孵育HepG2細(xì)胞，檢測HepG2細(xì)胞的Akt磷酸化的水平。具體可參考步驟18.2.2。結(jié)果如圖19中的(b)所示。

免疫印跡結(jié)果顯示，mLeg1-Re蛋白的大小確實顯著小于野生型mLeg1蛋白(如圖19中的(a)所示)。當(dāng)用重組蛋白mLeg1-Re去單獨(dú)孵育HepG2細(xì)胞時，mLeg1-Re蛋白確實散失了誘導(dǎo)Akt磷酸化的能力。當(dāng)在純化野生型mLeg1蛋白(50ng)中加入過量的mLeg1-Re蛋白(500ng)，并室溫孵育10分鐘后，共同孵育HepG2細(xì)胞，結(jié)果顯示mLeg1蛋白仍然可以誘導(dǎo)Akt的磷酸化。這意味著mLeg1-Re蛋白并不能和mLeg1蛋白結(jié)合并抑制mLeg1蛋白的功能。當(dāng)用等量的mLeg1-Re蛋白先孵育HepG2細(xì)胞10分鐘后，再加入mLeg1蛋白，結(jié)果顯示，mLeg1蛋白激活A(yù)kt的能力被完全抑制(如圖19中的(b)所示)。這很可能是mLeg1-Re蛋白也能夠競爭性的與EGFR受體結(jié)合，從而阻斷野生型mLeg1與EGFR受體結(jié)合并激活下游Akt的能力。

進(jìn)一步的，mLeg1-Re蛋白是否在小鼠體內(nèi)也能競爭性的抑制野生型mLeg1的功能，從而抑制脂肪合成的通路，最終阻斷肥胖的發(fā)生。通過如下實驗方法驗證。

23.4取10周齡的體重(t1)一致的野生型小鼠，隨機(jī)分為3個組，每個組3到4只小鼠。給野生型小鼠喂食高脂食物，并每天通過口腔灌喂20ug的mLeg1-Re蛋白，作為灌喂mLeg1-Re的實驗組。給另一組同樣年齡的野生型小鼠喂食同樣的高脂食物，并每天通過口腔灌喂等量的牛血清白蛋白(BSA)，作為灌喂BSA的實驗組。再給另一組同樣年齡的野生型小鼠喂食同樣的正常食物，作為對照組。一個月后，稱其體重(t2)，結(jié)果以增加的體重(t2-t1)表示。實驗重復(fù)兩次，最終體重改變?nèi)∑骄?。結(jié)果如圖20中的(a)所示。

由圖20中的(a)可知，由于高脂食物的喂食，灌喂BSA的實驗組相比于喂食正常食物的小鼠，體重出現(xiàn)明顯的增長，而同時灌喂mLeg1-Re蛋白的實驗組小鼠則體重增長與喂食正常食物小鼠相差不大，都顯著的少于對照組。表明mLeg1-Re蛋白具有抑制由過度飲食高脂食物引起的肥胖或體重增長。

這些結(jié)果，進(jìn)一步暗示mLeg1-Re蛋白能夠與肝臟中的EGFR受體結(jié)合，并阻斷正常mLeg1的功能。為了進(jìn)一步驗證這個猜想，發(fā)明人用mLeg1-Re蛋白去灌胃mLeg1^Δ/Δ小鼠，并免疫共沉淀的方法檢測mLeg1-Re蛋白是否能到達(dá)肝臟，并于肝臟中的EGFR結(jié)合。結(jié)果如圖20中的(b)所示(圖中：input代表用于免疫共沉淀實驗的蛋白“-”代表為灌胃mLeg1-Re的對照組；“+”代表灌胃mLeg-Re的實驗組；IP:α-mLeg1代表mLeg1抗體結(jié)合并拉下mLeg1蛋白及其相互作用蛋白)：灌胃兩小時后，可以在mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中檢測到mLeg-Re的蛋白，并在用mLeg1抗體拉下的蛋白中可以檢測到明顯的EGFR蛋白的存在。結(jié)果證實，mLeg1-Re蛋白確實可以從口腔進(jìn)入肝臟，并于EGFR結(jié)合，阻斷正常mLeg1的功能，最終減少脂肪的合成。

綜上所述，在給正常小鼠持續(xù)喂食高脂肪含量(10％)的食物時，該小鼠的體重將持續(xù)增重，最終導(dǎo)致肥胖，以及一系列肥胖綜合癥的發(fā)生。而當(dāng)敲除mLeg1基因，即抑制mLeg1的功能時，即使持續(xù)喂食高脂肪含量食物，小鼠體重增長跟喂食正常食物并無明顯差別，并未發(fā)展出肥胖的癥狀。這意味著mLeg1的功能抑制，可以抑制過度飲食所引起的肥胖。mLeg1的功能是通過EGFR-Akt-Srebp1c信號軸來發(fā)揮調(diào)控脂肪合成的，意味著干擾mLeg1，EGFR，Akt，Srebp1c中的任意一個因子功能的化合物，都有可能作為發(fā)展抑制飲食引起的肥胖的藥物。因此，抑制mLeg1-EGFR-Akt-Srebp1c信號軸的作用，阻斷新的脂肪的合成，有可能成為治療肥胖癥的新手段。而在農(nóng)業(yè)動物中敲除Leg1同源基因或通過特定化合物下調(diào)Leg1的表達(dá)或活性，可以減少脂肪積累。

此外，mLeg1蛋白能夠通過EGFR-Akt-Srebp1c信號軸來促進(jìn)脂肪合成，因此，mLeg1可以用于制備促進(jìn)脂肪合成的藥劑，一方面用于治療脂肪缺少的疾病，包括化療引起的脂肪缺少等，另一方面也可以用于增肥作用，包括用于瘦弱人群的增肥、飼養(yǎng)動物的增肥等。

另外，mLeg1蛋白可以通過與EGFR相互作用激活A(yù)kt信號。同時，前人研究指出糖尿病發(fā)生的一個重要機(jī)制是肝臟對胰島素信號發(fā)生抵抗，使得胰島素不能很好的激活A(yù)kt信號，從而無法使肝細(xì)胞胞漿中的GLUT2蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞膜表面，導(dǎo)致血糖無法運(yùn)輸進(jìn)入肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)換，最終血糖含量過高。而mLeg1蛋白可以不通過胰島素激活A(yù)kt，這意味著mLeg1蛋白同時是一種潛在的治療糖尿病的藥物。

由于mLeg1(Leg1)蛋白在所有脊椎動物中都保守存在，因此，這些物種中的Leg1蛋白，包含人類中的hLeg1蛋白，將具相似的功能。因此，在這些物種中的Leg1蛋白以及關(guān)于Leg1-EGFR-Akt-Srebp1c信號軸的功能與應(yīng)用都是都在本發(fā)明專利的保護(hù)范圍之內(nèi)。

綜上所述研究結(jié)果，本發(fā)明的主要結(jié)論如下：

(1)mLeg1^Δ/Δ小鼠體內(nèi)脂肪含量減少，并對高脂喂食導(dǎo)致的肥胖癥產(chǎn)生抵抗。

(2)mLeg1^Δ/Δ小鼠肝臟中由于Akt活性的減弱導(dǎo)致脂肪合成能力的減弱。

(3)mLeg1能夠促進(jìn)人肝癌細(xì)胞HepG2和小鼠肝臟的Akt磷酸化。

(4)mLeg1通過與EGFR相互作用，激活EGFR，再經(jīng)EGFR/PI3K信號軸激活A(yù)kt。當(dāng)抑制EGFR或是PI3K信號中其中一個時，mLeg1則不再能激活A(yù)kt。

(5)在小鼠體內(nèi)，肝臟外源性的mLeg1參與調(diào)控肝臟Akt活性水平。唾液腺表達(dá)的mLeg1被分泌到唾液中，并經(jīng)過消化道進(jìn)入血液循環(huán)，并最終到達(dá)肝臟發(fā)揮作用。體外灌胃進(jìn)入消化道中的mLeg1蛋白可以在10分鐘之內(nèi)進(jìn)入血液到達(dá)肝臟，并與EGFR結(jié)合激活下游Akt信號。

本研究對從未報道過相關(guān)功能的mLeg1進(jìn)行了詳實的研究。研究指出mLeg1蛋白是機(jī)體內(nèi)一個脂肪代謝調(diào)控因子。它由mLeg1基因編碼，并主要在唾液腺中富集表達(dá)，轉(zhuǎn)錄翻譯后的mLeg1蛋白可以被運(yùn)輸?shù)礁闻K，通過與肝臟表面的EGFR受體結(jié)合，激活PI3K—Akt—Srebp1c信號通路，調(diào)控肝臟中脂肪的從頭合成途徑，從而對整個機(jī)體的脂肪代謝進(jìn)行調(diào)控。

本研究指出mLeg1蛋白主要在唾液腺中富集表達(dá)，因此mLeg1蛋白可以作為唾液腺形態(tài)結(jié)構(gòu)及疾病診斷的一個分子標(biāo)記。

本研究指出mLeg1主要由唾液腺表達(dá)，因此mLeg1的啟動子可以用于制備在唾液腺特異性表達(dá)某種基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因動物，包括用于制備唾液腺特異性表達(dá)Cre的工具鼠等。

總之，本發(fā)明以現(xiàn)有技術(shù)沒有研究過的mLeg1基因為基礎(chǔ)，以mLeg1基因敲除小鼠為研究對象，利用遺傳學(xué)，分子生物學(xué)，生物化學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)的手段對mLeg1基因的功能進(jìn)行了非常全面的研究，研究結(jié)果表明mLeg1蛋白可以通過EGFR調(diào)控體內(nèi)Akt的信號，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體內(nèi)的脂肪合成，該結(jié)果表明mLeg1基因和蛋白與機(jī)體內(nèi)的脂肪合成密切相關(guān)，也進(jìn)一步表明脊椎動物包括人類的Leg1基因或Leg1蛋白可以作為靶點基因或靶點蛋白用于制備與脂肪合成相關(guān)的藥物中去，該研究結(jié)果為后期人為對人類肥胖癥的治療或預(yù)防、癌癥病人化療后的體質(zhì)恢復(fù)或增肥、糖尿病治療等領(lǐng)域的藥物、以及脊椎動物的脂肪積累相關(guān)藥物領(lǐng)域的研發(fā)供了一個全新的藥物靶點以及新的治療手段和思路。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 浙江大學(xué)

<120> 一種Leg1蛋白及其在肥胖相關(guān)疾病中的應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Ala Phe Leu Pro Ser Trp Val Cys Val Leu Val Gly Ser Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Leu Ala Gly Thr Ser Asn Leu Ser Glu Thr Glu Pro Pro Leu

20 25 30

Trp Lys Glu Ser Pro Gly Gln Leu Ser Asp Tyr Arg Val Glu Asn Ser

35 40 45

Met Tyr Ile Ile Asn Pro Trp Val Tyr Leu Glu Arg Met Gly Met Tyr

50 55 60

Lys Ile Ile Leu Asn Gln Thr Ala Arg Tyr Phe Ala Lys Phe Ala Pro

65 70 75 80

Asp Asn Glu Gln Asn Ile Leu Trp Gly Leu Pro Leu Gln Tyr Gly Trp

85 90 95

Gln Tyr Arg Thr Gly Arg Leu Ala Asp Pro Thr Arg Arg Thr Asn Cys

100 105 110

Gly Tyr Glu Ser Gly Asp His Met Cys Ile Ser Val Asp Ser Trp Trp

115 120 125

Ala Asp Leu Asn Tyr Phe Leu Ser Ser Leu Pro Phe Leu Ala Ala Val

130 135 140

Asp Ser Gly Val Met Gly Ile Ser Ser Asp Gln Val Arg Leu Leu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Lys Asn Glu Arg Lys Phe Cys Tyr Asp Val Ser Ser Cys Arg

165 170 175

Ser Ser Phe Pro Glu Thr Met Asn Lys Trp Asn Thr Phe Tyr Gln Tyr

180 185 190

Leu Gln Ser Pro Phe Ser Lys Phe Asp Asp Leu Leu Lys Tyr Leu Trp

195 200 205

Ala Ala His Thr Ser Thr Leu Ala Asp Asn Ile Lys Ser Phe Glu Asp

210 215 220

Arg Tyr Asp Tyr Tyr Ser Lys Ala Glu Ala His Phe Glu Arg Ser Trp

225 230 235 240

Val Leu Ala Val Asp His Leu Ala Ala Val Leu Phe Pro Thr Thr Leu

245 250 255

Ile Arg Ser Tyr Lys Phe Gln Lys Gly Met Pro Pro Arg Ile Leu Leu

260 265 270

Asn Thr Asp Val Ala Pro Phe Ile Ser Asp Phe Thr Ala Phe Gln Asn

275 280 285

Val Val Leu Val Leu Leu Asn Met Leu Asp Asn Val Asp Lys Ser Ile

290 295 300

Gly Tyr Leu Cys Thr Glu Lys Ser Asn Val Tyr Arg Asp His Ser Glu

305 310 315 320

Ser Ser Ser Arg Ser Tyr Gly Asn Asn Ser

325 330

<210> 2

<211> 337

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met Ala Val Leu Ala Ser Trp Val Trp Val Leu Ala Gly Cys Phe Cys

1 5 10 15

Ala Ala Val Ala Glu Val Ser Asp Ser Ser Asp Pro Tyr Pro Pro Leu

20 25 30

Trp Glu Asp Ser Pro Glu Gln Leu Ser Asp Tyr Met Met Glu Asp Gly

35 40 45

Asn Tyr Ile Ile Asn Pro Trp Val Tyr Thr Asp Arg Met Gly Met Tyr

50 55 60

Arg Ile Leu Leu Glu Glu Thr Ala Met Tyr Phe Ala Lys Tyr Gly Pro

65 70 75 80

Glu Asn Glu Gln Asn Leu Leu Trp Gly Leu Pro Leu Gln Phe Gly Trp

85 90 95

Gln Tyr Gln Ser Gly Arg Leu Ala Asp Pro Thr Gly Met Thr Asp Cys

100 105 110

Gly Asn Glu Leu Asn Glu Ser Leu Cys Val Ser Val Asp Ser Trp Trp

115 120 125

Ala Asp Ile Asn Tyr Tyr Leu Ser Val Ile Pro Phe Leu Ala Ala Val

130 135 140

Asp Ser Gly Ile Thr Gly Ile Ser Pro Asn Gln Ile Thr Ile Leu Pro

145 150 155 160

Pro Pro Lys Asp Gln Met Arg Phe Cys Tyr Asn Val Ser Asp Cys Gln

165 170 175

Ser Ala Val Pro Gly Thr Met Asn Arg Trp Arg Asp Phe Phe Gln Tyr

180 185 190

Met Gln Leu Asn Ser Ser Asp Phe Asp Gly Leu Leu Asn Tyr Leu Trp

195 200 205

Glu Ala His Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Pro Thr Ser Ala Phe Gly Asp

210 215 220

Arg Tyr Asn Phe Tyr Ser Glu Lys Glu Ala Asn Phe Glu Glu Asn Trp

225 230 235 240

Ala Ile Ala Val Asn Tyr Leu Ala Ala Ala Arg Leu Pro Thr Thr Gln

245 250 255

Asn Arg Thr Tyr Ser Phe Gln Arg Gly Leu Pro Pro Arg Val Leu Val

260 265 270

Asp Thr Asp Ile Ala Pro Phe Ile Pro Asp Phe Thr Pro Leu Gln Asn

275 280 285

Glu Val Leu Val Ser Leu Lys Leu Leu Gly Asp Thr Asp Arg Asn Ser

290 295 300

Gly Ser Leu Ser Leu Thr Leu Trp Glu Asn Leu Met Ser Thr Lys Leu

305 310 315 320

Ala Arg Thr Leu Phe Leu Lys Ala Phe Glu Glu Phe Leu Ala Thr Ser

325 330 335

Ser

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

atggcttttc ttccttcctg ggtttgtgta ctagttggtt ccttttctgc ttccttagca 60

gggacttcca atctctcaga gacagagccc cctctgtgga aggagagtcc tggtcagctc 120

agtgactaca gggtggagaa cagcatgtac attattaatc cctgggtata ccttgagaga 180

atggggatgt ataaaatcat attgaatcag acagccaggt attttgcaaa atttgcacca 240

gataatgaac agaatatttt atgggggttg cctctgcagt atggctggca atataggaca 300

ggcagattag ctgatccaac ccgaaggaca aactgtggct atgaatctgg agatcatatg 360

tgcatctctg tggacagttg gtgggctgat ttgaattatt ttctgtcttc attacccttt 420

cttgctgcgg ttgattctgg tgtaatgggg atatcatcag accaagtcag gcttttgccc 480

ccacccaaga atgagaggaa gttttgttat gatgtttcta gctgtcgttc atccttccct 540

gagacaatga acaagtggaa caccttttac cagtatttgc agtcaccttt tagtaagttt 600

gatgatctgt tgaagtactt atgggctgca cacacttcaa ccttggcaga taatatcaaa 660

agttttgaag acagatatga ttattattct aaagcagaag cgcattttga gagaagttgg 720

gtactggctg tggatcattt agctgcagtc ctctttccta caaccttgat tagatcatat 780

aagttccaga agggcatgcc accacgaatt cttcttaata ctgatgtagc ccctttcatc 840

agtgacttta ctgcttttca gaatgtagtc ctggttcttc taaatatgct tgacaatgtg 900

gataaatcta taggttatct ttgtacagaa aaatctaatg tatatagaga tcattcggaa 960

tctagctcta gaagttatgg aaataactcc tga 993

<210> 4

<211> 1132

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

atggctgtcc tggcttcctg ggtctgggta ctggctggct gcttctgtgc agctgtagca 60

gaggtttctg atagctcaga tccatatcct cctttatggg aagacagccc tgagcagttg 120

agtgactaca tgatggagga tgggaactac ataattaatc cttgggtata cactgacaga 180

atggggatgt acagaatctt actggaagag acagctatgt attttgcaaa atatggtcca 240

gaaaatgaac aaaatcttct ttggggattg cctctgcagt ttggctggca gtatcaatca 300

ggtagattag ctgatcccac tggaatgaca gactgtggca atgaacttaa tgagagtctg 360

tgtgtctctg tggacagttg gtgggcagat ataaattatt atctgagtgt gatacctttc 420

cttgctgctg ttgattctgg aataacagga atatcaccaa accaaatcac gatcctgcct 480

ccacccaagg atcagatgag gttttgttat aatgtttctg actgtcaatc tgccgtccct 540

ggaacaatga acagatggag agactttttt cagtacatgc agttgaattc cagtgacttt 600

gatggccttc ttaactactt atgggaagcc catgcctcat ccttggacta tcccaccagt 660

gcctttggag acagatataa tttctattct gaaaaagaag caaattttga ggaaaactgg 720

gctattgctg tgaactattt agcggcagcc cgtcttccta caacccaaaa tagaacatac 780

agctttcaga ggggcctgcc cccacgagtc cttgttgata ctgacatagc cccttttatt 840

cctgacttca ctcctcttca gaacgaagtc ctggtatcac tcaaacttct tggtgatact 900

gacagaaatt caggatcatt atctttgact ctatgggaaa atctcatgag tacaaaactt 960

gcaagaacat tatttctaaa agcctttgaa gagttcctgg caacatcttc ttaa 1014

<210> 5

<211> 364

<212> PRT

<213> 斑馬魚（Danio rerio）

<400> 5

Met Ser Glu Met Gly Phe Leu Arg Ser Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Phe Ser His Ala Ala Val Val Thr Glu Asn Gly Leu Pro Ile

20 25 30

Gln Trp Gly Lys Ala Pro Ser Asp Leu Ser His Leu Pro Ile Ser Asp

35 40 45

Thr Gly Val Gln Val Asn Pro Trp Asp Tyr Ser Gln Arg Met Thr Met

50 55 60

Tyr Lys Met Leu Ile Asn Ala Thr Asn Ala Tyr Met Ser Ser Met Gly

65 70 75 80

Pro Gly Glu Gln Glu Asn Pro Leu Trp Ser Leu Pro Leu Gln Leu Gly

85 90 95

Trp Lys Leu Lys Ser Gly Arg Leu Ala Asp Pro Thr Leu Asp Ser Ser

100 105 110

Ser Thr Cys Gly Ser Glu Ala Ser Asp Pro Val Cys Ile Ser Pro Leu

115 120 125

Ser Trp Phe Ala Cys Val Asn Tyr Tyr Leu Ser Val Leu Pro Phe Leu

130 135 140

Ala Ala Val Glu Thr Gly Val Val Ser Ser Gly Gly His Gln Val Leu

145 150 155 160

Ile Gln Val Pro Ala Glu Val Ala Gln Asp Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser

165 170 175

Asp Cys Ser Thr Lys His Pro Asn Ala Met Ala Lys Trp His Leu Phe

180 185 190

Phe Gln Ser Leu Arg Gln Val Ser Gln Ser Glu Asp Ser Asp Phe Asn

195 200 205

Lys Lys Asp Ser Ile Leu Gly Leu Met Trp Ala Ala Glu Glu Glu Ser

210 215 220

Leu Gln Thr Ala Ser Gly Ala Cys Thr Glu Arg Gln Lys Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Ser Pro Glu Val Ser Phe Gln Gln Ser Trp Leu Asn Ser Ala Ala Phe

245 250 255

Val Ser Ala Ala His Phe His Ala Asn Ile Glu Arg Ser Glu Lys Phe

260 265 270

Met Ala Pro Leu Pro Ser Arg Val Leu Gln Glu Ala Asp Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Ile Ala Asp Leu Ser Thr Glu Glu Asn His Thr Leu Tyr Ile Phe

290 295 300

Gly Trp Met Asn Ser Val Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ser Leu Val Asn

305 310 315 320

Leu Trp Arg Lys Ala Met Cys Ser Ala Gln Ala Arg Glu Lys Gly Gln

325 330 335

Ala Leu Leu His Asp Leu Ile Leu Asp Pro Lys Phe Pro Gly Ser Ser

340 345 350

Leu Trp Ser Ile Leu Ser Glu Met Ser Thr Ser Cys

355 360

<210> 6

<211> 364

<212> PRT

<213> 斑馬魚（Danio rerio）

<400> 6

Met Ser Glu Met Gly Phe Leu Arg Ser Val Ala Ala Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Val Phe Ser His Ala Ala Val Val Thr Glu Asn Gly Leu Pro Ile

20 25 30

Gln Trp Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Ser His Leu Pro Ile Ser Asn

35 40 45

Thr Gly Val Gln Val Asn Pro Trp Val Tyr Ser Gln Arg Met Thr Met

50 55 60

Leu Lys Met Val Ile Asn Ala Thr Asn Ala Tyr Met Ser Ser Met Gly

65 70 75 80

Pro Gly Glu Gln Glu Asn Pro Leu Trp Ser Leu Pro Leu Gln Leu Gly

85 90 95

Trp Lys Leu Lys Ser Gly Arg Leu Ala Asp Pro Thr Pro Asp Ser Ser

100 105 110

Ser Thr Cys Gly Ser Glu Ala Ser Asp Pro Val Cys Ile Ser Pro Leu

115 120 125

Ser Phe Phe Gly Cys Val Asn Tyr Tyr Leu Ser Val Leu Pro Phe Leu

130 135 140

Ala Ala Val Glu Thr Gly Val Val Ser Ser Gly Gly His Gln Met Leu

145 150 155 160

Ile Gln Val Pro Ala Glu Val Ala Gln Asp Tyr Cys Ser Ser Tyr Ser

165 170 175

Asp Cys Ser Thr Lys His Pro Asn Thr Met Ala Lys Trp His Leu Phe

180 185 190

Phe Gln Ser Leu Arg Gln Val Ser Gln Ser Lys Glu Ser Asp Phe Asn

195 200 205

Lys Lys Asp Ser Ile Leu Gly Leu Met Trp Ala Ala Glu Glu Glu Ser

210 215 220

Ile Gln Thr Ala Ser Gly Ala Cys Thr Glu Arg Gln Lys Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Ser Pro Glu Val Ser Phe Gln Gln Ser Ser Val Asn Leu Gly Ala Phe

245 250 255

Ile Ser Ala Ala His Tyr His Ala Ser Ile Glu Arg Ser Gly Lys Phe

260 265 270

Met Ser His Leu Pro Ser Arg Val Leu Gln Glu Ala Asp Ser Pro Pro

275 280 285

Asn Ile Ala Asp Leu Ser Thr Glu Glu Asn His Ala Leu Tyr Met Leu

290 295 300

Ser Trp Met Asn Ser Ile Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ser Leu Val Asp

305 310 315 320

Leu Trp Arg Lys Ala Met Cys Ser Ala Gln Ala Arg Glu Lys Gly Gln

325 330 335

Ala Phe Leu Asp Asp Leu Ile Leu Asp Pro Lys Phe Pro Gly Ser Ser

340 345 350

Leu Trp Ser Ile Ile Cys Val Met Ser Thr Ser Cys

355 360

<210> 7

<211> 355

<212> PRT

<213> 綿羊（Ovis aries）

<400> 7

Met Trp Ser Ser Leu Val Ile Pro Thr Phe Leu Phe Leu Ser Phe Ser

1 5 10 15

Ser Val Gly Leu Ala Pro Asp Pro Gly Ser Thr Thr His Glu Asn Asp

20 25 30

Asn Tyr Pro Pro Phe Trp Gly Gln Thr Asp Gly Asp Ile Ala Glu Phe

35 40 45

Pro Val Gln Asn Asn Lys Ile Ile Val Asp Pro Trp Lys Tyr Met Asp

50 55 60

Arg Leu Arg Ile Phe Lys Ile Leu Ile Thr Glu Ser Asn Lys Tyr Phe

65 70 75 80

Ala Ser Phe Gly Lys Asn Asp Thr Gly Asn Val Phe Trp Ala Leu Thr

85 90 95

Leu Leu Tyr Gly Ser Leu Phe Lys Ser Asp Arg Phe Ser Glu Pro Pro

100 105 110

Asn Ser Ser Arg Cys Ala Tyr Glu Ser Gly Val Ser Ser Cys Ile Ser

115 120 125

Ile Asn Ser Gly Trp Gly Gly Ile Ser Tyr Tyr Val Val Ile Met Tyr

130 135 140

Phe Leu Ala Ala Ile Glu Ser Glu Phe Leu Gly Asn Leu Pro Tyr Glu

145 150 155 160

Val Glu Leu Leu Ser Arg Lys Glu Tyr Arg Ser Asn Phe Cys Tyr Ser

165 170 175

Val Glu Glu Cys Arg Ala Ala Tyr Pro Gln Ala Met Asp Ile His Asn

180 185 190

Arg Phe Tyr Lys Tyr Leu Gln Ser Arg Lys Ile Val Ser Thr Thr Ser

195 200 205

Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Thr Asp Glu Asp Thr Ala Ile Phe Lys Met

210 215 220

Trp Ala Ala His Gln Ala Ala Leu Asp Val Ala Lys Pro Lys Phe Arg

225 230 235 240

Asp Val Ser Phe Tyr Ser Ser Glu Thr Glu Arg Asp Phe Thr Met Asp

245 250 255

Phe Leu Leu Ala Ala Glu Phe Ile Glu Ala Val Leu Tyr Arg Pro Tyr

260 265 270

Phe Glu Ser Ser Ala Glu Phe Leu Ala Gly Phe Pro His Arg Leu Leu

275 280 285

Thr Asp Gln Asp Arg Asn Val Leu Thr Ser Asn Phe Ser Arg Arg Glu

290 295 300

Lys Ala Leu Ile Thr Val Val Lys Leu Ile Thr Lys Ile Asn Lys Ser

305 310 315 320

Thr Gly Gly Leu Leu Leu Thr Ile Trp Lys Lys Leu Met Thr Ser Lys

325 330 335

Phe Ala Arg Ala Met Gly Arg Phe Phe Ile Lys Arg Leu Leu Leu Ile

340 345 350

Pro Val Glu

355

<210> 8

<211> 317

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 8

Pro Pro Phe Trp Asp Gln Ile Asp Gly Asp Ile Ala Glu Phe Pro Val

1 5 10 15

Gln Asn Asn Lys Ile Ile Val Asp Pro Trp Lys Tyr Met Asp Arg Leu

20 25 30

Arg Ile Phe Lys Ile Leu Ile Thr Glu Ser Asn Lys Tyr Phe Ala Ser

35 40 45

Phe Gly Lys Asn Asn Thr Gly Asn Val Phe Trp Ala Leu Thr Leu Leu

50 55 60

Tyr Gly Arg Leu Phe Lys Thr Asp Arg Phe Ala Glu Pro Pro Asn Ser

65 70 75 80

Ser Arg Cys Ala Tyr Glu Ser Gly Ile Ser Ser Cys Ile Ser Ile Asn

85 90 95

Ser Gly Trp Gly Gly Ile Ser Tyr Tyr Val Val Met Met Tyr Phe Leu

100 105 110

Ala Ala Ile Glu Ser Glu Phe Leu Gly Ser Leu Pro Tyr Glu Val Glu

115 120 125

Leu Leu Ser Arg Glu Glu Tyr Arg Ser Asn Phe Cys Tyr Ser Ile Glu

130 135 140

Glu Cys Arg Ala Ala His Pro Gln Ile Met Asp Ile Ala Asn Arg Phe

145 150 155 160

Tyr Lys Gln Thr Lys Lys Ile Val Ser Thr Thr Ser Gly Ile Pro Gln

165 170 175

Tyr Asp Thr Asp Glu Asp Thr Ala Ile Phe Lys Met Trp Ala Ala His

180 185 190

Gln Ala Ala Ile Asp Val Ala Lys Pro Met Phe Ser Asp Val Ser Phe

195 200 205

Tyr Ser Ser Glu Thr Glu Arg Asp Phe Thr Met Asp Phe Leu Leu Ala

210 215 220

Ala Glu Phe Phe Glu Ala Ala Leu Tyr Arg Pro Tyr Phe Glu Ser Ser

225 230 235 240

Ala Glu Phe Leu Val Gly Phe Pro His Arg Leu Leu Thr Asp Gln Asp

245 250 255

Arg Asn Val Leu Met Ser Asn Phe Ser Arg Arg Glu Lys Ala Leu Ile

260 265 270

Thr Val Ala Lys Leu Thr Thr Lys Ile Asn Lys Ser Thr Gly Gly Leu

275 280 285

Leu Leu Thr Ile Trp Lys Lys Leu Met Thr Ser Lys Phe Ala Arg Ala

290 295 300

Thr Gly Arg Phe Phe Ile Lys Arg Leu Leu Leu Ile Pro

305 310 315