本發(fā)明屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的特征肽組合及方法。

背景技術(shù)：

近年來，羊全脂奶粉由于它的低致敏性，高營養(yǎng)價(jià)值，易消化吸收及獨(dú)特的風(fēng)味等優(yōu)勢受到了市場的追捧，成為乳品行業(yè)熱銷產(chǎn)品。然而羊奶的產(chǎn)量較低并且受季節(jié)性變化影響，同時(shí)羊奶原料成本較高。因此受到經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，價(jià)格較低、產(chǎn)量較高的奶牛奶粉摻入羊奶粉的摻假現(xiàn)象頻繁出現(xiàn)。這種摻假行為不僅對(duì)消費(fèi)者的經(jīng)濟(jì)利益造成損害，摻入的奶牛奶過敏原更對(duì)奶牛奶過敏消費(fèi)者的健康造成威脅。

現(xiàn)階段定性鑒別奶牛奶和羊奶的方法主要是基于檢測DNA的PCR法和檢測蛋白質(zhì)的ELISA法。

申請(qǐng)?zhí)枮?01610363584.8的中國發(fā)明專利公開了一種羊奶粉中牛奶成分的粗放與精準(zhǔn)定量檢測方法，其是通過普通PCR對(duì)摻假模型進(jìn)行分級(jí)，利用熒光定量PCR獲得處于各個(gè)相應(yīng)等級(jí)的Ct值與摻假比例的關(guān)系式，之后通過普通PCR確定待檢樣品的等級(jí)，然后對(duì)待檢樣品進(jìn)行熒光定量PCR獲取Ct值，代入到相應(yīng)級(jí)別的關(guān)系方程中從而計(jì)算出羊奶粉中牛奶成分的百分含量。

PCR法操作簡單，具有較高的特異性，同時(shí)相比于檢測蛋白質(zhì)的ELISA法，DNA受到溫度和壓力的影響較小，PCR方法更為穩(wěn)定。但PCR法也存在明顯的缺陷，由于PCR法基于指數(shù)擴(kuò)增的檢測機(jī)理，其檢測誤差較大，定量不準(zhǔn)確；同時(shí)奶中的DNA主要來自白細(xì)胞與脫落的乳腺細(xì)胞，這與動(dòng)物的品種，飼養(yǎng)以及生理期有關(guān)，所以奶中的DNA含量不穩(wěn)定，難以建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法。

授權(quán)公告號(hào)為CN 101271107B的中國發(fā)明專利公開了一種羊乳及其乳制品中摻入牛乳的快速免疫學(xué)檢測方法，采用牛乳特異性酪蛋白免疫哺乳動(dòng)物產(chǎn)生抗體，將制備的血清抗體與羊乳的共同抗原反應(yīng)得到特異性抗體，再將待測羊乳(疑是摻假樣品)進(jìn)行脫脂處理，應(yīng)用制備特異抗體建立間接ELISA定量出羊乳中摻入的牛乳含量。

ELISA法利用抗原抗體技術(shù)檢測奶中的特異蛋白質(zhì)，但是由于兩種奶的蛋白質(zhì)種類一致，性質(zhì)接近，故抗體制備比較困難。另外ELISA法的主要缺陷是由于蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致測量結(jié)果的不準(zhǔn)確性。

液相色譜-質(zhì)譜法逐漸成為的物種鑒定主流方法。該方法通過比對(duì)選擇特異性多肽作為生物標(biāo)記物，對(duì)不同物種來源的食物進(jìn)行溯源調(diào)查。在過去的十年間，許多文獻(xiàn)報(bào)道了利用該方法可對(duì)雞肉、豬肉和魚肉等多種肉類進(jìn)行了定性鑒定，但是很少涉及到定量檢測方面的研究。與此同時(shí)，鮮有文獻(xiàn)對(duì)乳蛋白的物種溯源分析的方法進(jìn)行研究和報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的特征肽組合。使用該特征肽組合可以準(zhǔn)確檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例，具有較高的特異性、靈敏度、回收率和精密度。

一種用于檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的特征肽組合，包括牛奶特征肽和羊奶特征肽，其中牛奶特征肽氨基酸序列為LSFNPTQLEEQCHI，羊奶特征肽氨基酸序列為LAFNPTQLEGQCHV。

基于上述特征肽組合，本發(fā)明又提供了一種用于檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的內(nèi)標(biāo)特征肽組合，包括內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽和內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽，所述內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的氨基酸序列為LSFNPTQL*EEQCHI*，內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽的氨基酸序列為LAFNPTQL*EGQCHV*，其中L*、I*和V*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸殘基。使用時(shí)，可以通過向樣品中添加內(nèi)標(biāo)特征肽組合，可以達(dá)到對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行校正的目的。

本發(fā)明還提供了一種檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的方法，包括以下步驟：

(1)向待檢測樣品中加入內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽；

(2)將添加內(nèi)標(biāo)特征肽的待檢測樣品經(jīng)蛋白變性處理后，使用胰蛋白酶酶解；

(3)酶解產(chǎn)物用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢測；

(4)計(jì)算待檢測樣品中所述的羊奶特征肽和牛奶特征肽與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)特征肽的峰面積比；

(5)將所述峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到其中羊奶比例和牛奶比例，

所述內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽分別為所述羊奶特征肽和牛奶特征肽經(jīng)同位素標(biāo)記所得。

待檢測樣品通過高效液相色譜能夠盡量分離純化為一個(gè)個(gè)單一組分的峰，然后將單一的峰分別通過質(zhì)譜分析確定成分，再通過質(zhì)譜的結(jié)果確定高效液相色譜結(jié)果中所述的羊奶特征肽和牛奶特征肽以及對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽各自的峰，而峰面積的大小即為各自成分的量。如果不加入內(nèi)標(biāo)特征肽，則通過配置已知濃度的牛奶粉標(biāo)準(zhǔn)樣品和羊奶粉標(biāo)準(zhǔn)樣品，檢測后獲得相應(yīng)峰面積結(jié)果，通過濃度與峰面積之間的關(guān)系獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線為線性。但是由于樣品在處理過程中存在樣品損失、高效液相色譜回收率存在損失和波動(dòng)等問題存在，使得沒有添加所述內(nèi)標(biāo)特征肽時(shí)，所得結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而且檢測結(jié)果波動(dòng)較大，使得檢測結(jié)果不夠可靠和準(zhǔn)確。

而通過加入已知濃度和量的內(nèi)標(biāo)特征肽，可以通過計(jì)算羊奶特征肽和牛奶特征肽與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的峰面積比，這樣就盡量避免了樣品在處理過程中存在樣品損失、高效液相色譜回收率存在損失和波動(dòng)等問題，因?yàn)閮?nèi)標(biāo)特征肽也是按相同比例在損失，所以可以通過內(nèi)標(biāo)特征肽來校準(zhǔn)。

優(yōu)選的，所述的方法中，所述內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的氨基酸序列為LSFNPTQL*EEQCHI*，內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽的氨基酸序列為LAFNPTQL*EGQCHV*，其中L*、I*和V*為碳氮全同位素標(biāo)記的氨基酸殘基。

優(yōu)選的，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線由以下方法獲得：

將標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉與標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉按不同比例混合獲得一系列標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)上述步驟(1)～(4)，計(jì)算得到各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品中內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和牛奶特征肽與對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)特征肽的峰面積比，最后繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過將標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉和標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉按不同比例混合獲得一系列標(biāo)準(zhǔn)品，相較于使用單一樣品的標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉和標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉來獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線更加接近實(shí)際，也能夠消除羊奶粉和牛奶粉相互之間對(duì)檢測結(jié)果可能存在的影響，因?yàn)榭偟鞍缀碗牡牧康亩嗌倏赡軙?huì)影響高效液相色譜的結(jié)果。

優(yōu)選的，所述內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的添加比例分別為8～12μmol/L。最優(yōu)選的，所述內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的添加比例分別為10μmol/L。當(dāng)然，兩種內(nèi)標(biāo)特征肽的使用量可以在較寬范圍內(nèi)選擇，只要結(jié)果能夠檢測到。但是，最優(yōu)的情況是所添加的內(nèi)標(biāo)特征肽的量與所檢測樣品中相應(yīng)的特征肽的量接近，這樣可以使校準(zhǔn)結(jié)果最準(zhǔn)確。

優(yōu)選的，所述內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽和內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽按質(zhì)量比1∶1進(jìn)行添加。

優(yōu)選的，使用DTT進(jìn)行蛋白變性。

優(yōu)選的，高效液相色譜的條件為：

色譜柱：Acquity BEH 300C18柱，1.7μm，2.1×100mm；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：10μL；流動(dòng)相A：0.1％甲酸/水；流動(dòng)相B：0.1％甲酸/乙腈；流速：0.3mL/min。

優(yōu)選的，質(zhì)譜的條件為：

電噴霧離子源電離模式：ESI+，毛細(xì)管電壓：3.5kv，錐孔電壓：35kv，脫溶劑溫度：500℃，脫溶劑氣流量：900L/min，錐孔反吹氣流量：30L/hr，碰撞室壓力：3.0×10^-3Mbar；低端分辨率1：2.5V，高端分辨率1：15.0V，離子能量1：0.5；低端分辨率2：2.8V，高端分辨率2：15.0V，離子能量2：1.0；離子源溫度：150℃，提取器電壓：3.0V，入口透鏡電壓：0.5V，出口電壓：0.5V，碰撞梯度：1.0。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)羊奶粉中牛奶粉摻假定性，而且實(shí)現(xiàn)了對(duì)羊奶粉與牛奶粉的摻假比例的定量。本發(fā)明選擇了牛奶和羊奶中的β-乳球蛋白作為候選標(biāo)記物，篩選出代表牛奶和羊奶的特異特征肽，并設(shè)計(jì)合成對(duì)應(yīng)的內(nèi)標(biāo)物，以具有代表性的牛奶和羊奶作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)樣品中羊奶粉與牛奶粉的摻假比例定量，該方法具有較好的線性、靈敏度、回收率和精密度；

(2)本發(fā)明選擇蛋白中的特征肽段作為檢測物質(zhì)，適用于變性蛋白質(zhì)的檢測，因此可以滿足同時(shí)檢測樣品中的變性與非變性蛋白，保證了方法的準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為DTT還原反應(yīng)條件優(yōu)選結(jié)果柱狀圖，其中黑色、灰色、白色分別為DTT在反應(yīng)液中的終濃度分別為1.0、2.5和5.0mmol/L時(shí)得到的檢測值；

圖2為含有0.1％牛奶粉的羊奶粉樣品檢測結(jié)果圖，其中曲線a為內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽的高效液相色譜檢測峰，曲線b為羊奶特征肽的高效液相色譜檢測峰，曲線c內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽的高效液相色譜檢測峰，曲線d為牛奶特征肽的高效液相色譜檢測峰。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

β-乳球蛋白具有較為緊密的空間結(jié)構(gòu)，其空間結(jié)構(gòu)主要通過在半胱氨酸之間形成的二硫鍵以及其他的非共價(jià)鍵維持。如果不破壞β-乳球蛋白的空間結(jié)構(gòu)，酶切位點(diǎn)無法暴露將導(dǎo)致酶切無法完全進(jìn)行。通過使用二硫蘇糖醇(DTT)可水解二硫鍵達(dá)到破壞蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用。利用胰蛋白酶只作用于精氨酸(R)和賴氨酸(K)的專一性，將蛋白質(zhì)分解為多肽進(jìn)行檢測。本發(fā)明通過優(yōu)化還原溫度和DTT濃度，最終達(dá)到酶切效率最高的目的。

本發(fā)明設(shè)計(jì)了一套DTT濃度和還原溫度的正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化還原反應(yīng)條件。其中DTT在反應(yīng)液中的終濃度分別為1.0、2.5和5.0mmol/L，還原反應(yīng)的溫度為60、70、80、90℃，碘乙酰胺(IAA)溶液的濃度也須與DTT溶液保持一致，保證過量的DTT溶液不會(huì)對(duì)后續(xù)的酶解過程產(chǎn)生影響。結(jié)果表明在70℃的條件下加入100mmol/L的DTT溶液進(jìn)行還原反應(yīng)后的酶解效率最高，見圖1。最終的優(yōu)化前處理步驟如下：準(zhǔn)確稱取約100mg混合均勻的樣品于10mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度。取10μL稀釋液，加入10μL內(nèi)標(biāo)溶液(兩種同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)濃度分別為10μmol/L)，10μL的100mM DTT溶液與825μL水，在70℃水浴鍋中反應(yīng)30min。待冷卻后加入30μL的100mM IAA溶液，在暗處室溫靜置30min。加入100μL 500mM的碳酸氫銨緩沖液與10μL 200μg/mL的堿性胰蛋白酶，在37℃水浴鍋中反應(yīng)2h。最后加入5μL甲酸溶液終止反應(yīng)，用0.22μm微孔濾膜過濾，待測。

實(shí)施例2特征肽的篩選和確定

牛和羊同屬于牛屬，但分屬于不同的亞屬：牛亞屬(Subfamily Bovidae)和羊亞屬(Subfamily Caprinae)。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在奶牛奶與羊奶中的蛋白質(zhì)同源性高，氨基酸序列差異小。本發(fā)明選擇奶中含量較高的乳清蛋白β-乳球蛋白作為標(biāo)記物，通過數(shù)據(jù)庫篩選比對(duì)，選擇奶牛奶和羊奶中氨基酸序列具有差異性的特異性多進(jìn)行檢測，最終達(dá)到定量檢測全脂羊奶粉中全脂奶牛奶粉的摻假比例的目的。

本發(fā)明同時(shí)滿足山羊奶和綿羊奶中的奶牛奶摻假檢測，因此所選擇的羊奶特征肽段滿足山羊奶和綿羊奶的一致性，同時(shí)與所選擇的牛奶特征性肽段具有差異性的特點(diǎn)。根據(jù)Uniprot數(shù)據(jù)庫比對(duì)，發(fā)現(xiàn)滿足以上條件的氨基酸多肽共有兩對(duì)，分別是VYVEELKPTPEGDLEILLQK(牛奶)和VYVEELKPTPEGNLEILLQK(羊奶)、LSFNPTQLEEQCHI(牛奶)和LAFNPTQLEGQCHV(羊奶)。特異性特征多肽的長度理論上應(yīng)該小于15個(gè)氨基酸，如果過長將導(dǎo)致多肽靈敏度低、較差的色質(zhì)譜性質(zhì)和高昂的合成費(fèi)用。多肽VYVEELKPTPEGDLEILLQK和VYVEELKPTPEGNLEILLQK在篩選過程中未檢出。因此本發(fā)明最終選擇了多肽LSFNPTQLEEQCHI和LAFNPTQLEGQCHV分別作為牛奶和羊奶的特征肽。其質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1：MRM檢測參數(shù)。

實(shí)施例3內(nèi)標(biāo)特征肽的設(shè)計(jì)與確定

由于多肽在不同樣品中基質(zhì)效應(yīng)不同，因此通過外標(biāo)法測得的峰面積響應(yīng)值差異較大，同時(shí)由于蛋白質(zhì)在酶解過程中可能受到基質(zhì)效應(yīng)的干擾，導(dǎo)致酶解不完全，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以有必要設(shè)計(jì)內(nèi)標(biāo)，使之能夠校正基質(zhì)效應(yīng)在酶解效率以及檢測過程中帶來的影響。故本發(fā)明按照天然蛋白質(zhì)序列，在特異肽LSFNPTQLEEQCHI和LAFNPTQLEGQCHV的基礎(chǔ)上，利用同位素標(biāo)記的多肽合成了內(nèi)標(biāo)牛奶特征肽LSFNPTQL*EEQCHI*和內(nèi)標(biāo)羊奶特征肽LAFNPTQL*EGQCHV*，L*指[13C6,15N]-leucine(亮氨酸)，I*指[13C6,15N]-isoleucine(異亮氨酸)，V*指[13C5,15N]-Valine(纈氨酸)。

為了驗(yàn)證內(nèi)標(biāo)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的抗干擾能力，本發(fā)明進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)奶粉添加法實(shí)驗(yàn)。取標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉與非標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉按比例10∶90、50∶50及90∶10配制混合樣品溶液，按照最優(yōu)方法進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)樣分析，同時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉和標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉按比例0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2和10∶1混合后，分別按照外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法計(jì)算該樣品的牛奶比例。標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉添加法同標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉添加法。

檢測結(jié)果見表2：當(dāng)檢測非標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉中的標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉時(shí)，外標(biāo)法計(jì)算所得結(jié)果的RSD分別為20.42％、17.00％和3.47％。內(nèi)標(biāo)法計(jì)算所得結(jié)果的RSD分別為0.71％、2.93％和1.76％。當(dāng)檢測實(shí)際樣品中的低比例濃度標(biāo)準(zhǔn)牛奶時(shí)，外標(biāo)法的檢測值波動(dòng)較大，精密度較差，而內(nèi)標(biāo)法精密度較好。當(dāng)檢測非標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉中的標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉時(shí)，外標(biāo)法所測得結(jié)果的回收率分別為48.16％、73.68％和97.65％，內(nèi)標(biāo)法所得結(jié)果回收率分別為107.85％、100.45％和98.13％。當(dāng)檢測實(shí)際樣品中的低比例濃度標(biāo)準(zhǔn)牛奶時(shí)，外標(biāo)法的回收率偏低，而內(nèi)標(biāo)法的回收率滿足實(shí)驗(yàn)要求。因此可得，無論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度上，內(nèi)標(biāo)法都明顯優(yōu)于外標(biāo)法。

表2：標(biāo)準(zhǔn)添加回收實(shí)驗(yàn)回收率(n＝3)。

實(shí)施例4方法學(xué)驗(yàn)證

取標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉和標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉按比例0∶10、2∶8、4∶6、6∶4、8∶2和10∶1混合后，建立內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線，在4天內(nèi)分別配制4條標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表3，線性R²均在0.99以上。

表3：回歸方程與線性。

分別取100mg標(biāo)準(zhǔn)牛奶粉與標(biāo)準(zhǔn)羊奶粉配制標(biāo)準(zhǔn)牛羊奶溶液。分別按1∶9、3∶7、5∶5、7∶3和9∶1比例混合制備混合樣品溶液后進(jìn)行預(yù)處理。每天平行處理6個(gè)樣品，共進(jìn)行5天，計(jì)算回收率，結(jié)果見表4。

表4：不同比例的混合牛奶粉和羊奶粉樣品的測定(n＝30)。

由表4可得，在牛羊奶粉混合比例在10％到90％之間時(shí)，本發(fā)明方法所測得回收率在96.15％～102.34％之間，RSD在3.75％～6.47％之間。本發(fā)明所建立方法在靈敏度、線性、回收率和精密度方面均滿足檢測需求，本發(fā)明方法可以檢測全脂牛奶粉摻假量在0.1％的全脂羊奶粉，見圖2。

實(shí)施例5實(shí)際樣品的檢測

選擇了不同品牌不同類型的羊奶粉按照上述檢測方法進(jìn)行檢測，分析計(jì)算結(jié)果見表5。

表5：樣品檢測結(jié)果。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省疾病預(yù)防控制中心

<120> 一種用于檢測羊奶粉中牛奶粉摻假比例的特征肽組合及方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ala Phe Asn Pro Thr Gln Leu Glu Gly Gln Cys His Val

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Ser Phe Asn Pro Thr Gln Leu Glu Glu Gln Cys His Ile

1 5 10

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asn Leu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Val Tyr Val Glu Glu Leu Lys Pro Thr Pro Glu Gly Asp Leu Glu Ile

1 5 10 15

Leu Leu Gln Lys

20