本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

仿刺參(Apostichopus japonicus)屬棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)，海參綱(Holothuroidea)，楯手目(Aspidochirotida)，刺參科(Stichopodidae)，主要分布在北緯35°～44°的西北太平洋沿岸，山東、遼寧和河北是我國(guó)仿刺參的主要養(yǎng)殖區(qū)。仿刺參位列“海八珍”之首，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)藥價(jià)值。近年來(lái)，隨著人們社會(huì)生活條件的提高和健康意識(shí)的增強(qiáng)，仿刺參市場(chǎng)需求量逐年增加，不斷刺激養(yǎng)殖規(guī)模加大，仿刺參因此成為我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中單一產(chǎn)值最大的養(yǎng)殖品種。但是養(yǎng)殖過(guò)程中遇到的病害問(wèn)題一直是困擾產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要制約因素。利用生物技術(shù)的手段進(jìn)行疾病防治越來(lái)越引起人們的重視。

肽聚糖(Peptidoglycan)是存在于革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種復(fù)合糖類。主鏈?zhǔn)铅?1,4-糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的雜多糖。肽聚糖是許多細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，尤其在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，其所含的肽聚糖占細(xì)胞壁干重的50～80％。

肽聚糖識(shí)別蛋白(Peptidoglycan recognition protein,PGRP)是識(shí)別和結(jié)合肽聚糖的模式識(shí)別分子。通過(guò)識(shí)別入侵菌原菌的肽聚糖，進(jìn)而激活Toll信號(hào)通路(Toll-like receptors)途徑和免疫缺陷(Immune Deficiency,IMD)途徑等免疫信號(hào)通路并介導(dǎo)吞噬作用，因此在抵抗病原入侵的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1996年，Yoshida H首次在家蠶血淋巴中發(fā)現(xiàn)肽聚糖識(shí)別蛋白，隨后在魚類、軟件動(dòng)物和一些脊椎動(dòng)物中也相繼被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)它們的序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，肽聚糖識(shí)別蛋白可以分為兩個(gè)亞型，即長(zhǎng)型肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP-L)和短型肽聚糖識(shí)別蛋白(PGRP-S)。而目前對(duì)于仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白尚未有報(bào)道。發(fā)掘仿刺參的功能基因，制備生物抗菌藥物，有助于解決當(dāng)前養(yǎng)殖中抗生素抗藥性問(wèn)題，因此具有十分重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白的制備及應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白，仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白(AJ-PGRP)為序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。

肽聚糖識(shí)別蛋白(AJ-PGRP)的制備方法為：

(1)以仿刺參cDNA為模板，用引物F1和R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，待用；

(2)PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后與載體pEASY-E1載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，測(cè)序鑒定重組子；

(3)將上述表達(dá)載體pEASY-AJ-PGRP轉(zhuǎn)入Trans BL21(DE3)化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，而后用親和層析柱純化重組蛋白，即得到序列表SEQ ID No.1中氨基酸序列的肽聚糖識(shí)別蛋白AJ-PGRP。

所述引物分別為：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGTGCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTAT AATTTCTTG-3’。

本發(fā)明還公開了仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白的應(yīng)用，所述序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的AJ-PGRP用于制備廣譜抗菌類制劑或飼料添加劑。

本發(fā)明還公開了所述仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白用于制備抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、燦爛弧菌和枯草芽孢桿菌的制劑。

本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明利用體外重組表達(dá)技術(shù)首次獲得了仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白AJ-PGRP，該重組蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有凝集作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、燦爛弧菌和枯草芽孢桿菌具有抑制作用，在開發(fā)新型廣譜抗菌藥物開發(fā)和飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明獲得的仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白AJ-PGRP對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有凝集作用，同時(shí)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌具有明顯抑制作用，在開發(fā)新型廣譜抗菌藥物開發(fā)和飼料添加劑等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為SDS-PAGE檢測(cè)到的蛋白表達(dá)圖，其中1為誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白，2為MARKER；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)細(xì)菌的凝集作用圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的抑菌活性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1：仿刺參AJ-PGRP編碼區(qū)的原核重組表達(dá)，具體步驟如下：

1.原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

本發(fā)明采用北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司的pEASY-E1原核表達(dá)載體。利用特異性引物PCR擴(kuò)增AJ-PGRP的全部編碼區(qū)。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：①94℃預(yù)變性4min，②94℃變性30s；③52℃復(fù)性30s；④72℃延伸1min。⑤72℃終延伸10min。將步驟②③④進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pEASY-E1載體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans BL21(DE3)，挑選5～10個(gè)單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，并送測(cè)序公司測(cè)序，以驗(yàn)證閱讀框的正確性，所述特異性引物分別為：F1：5’-ATGGATGAACCGCCGCGT GCCTT-3’，R1:5’-ATGGTGATGTAT AATTTCTTG-3’。

重組蛋白的表達(dá)：將驗(yàn)證正確的菌株接種于50mL的LB液體培養(yǎng)基，置于振蕩培養(yǎng)箱中，37℃200rpm中培養(yǎng)12～16小時(shí)，然后將此培養(yǎng)液以1:100的比例接種于新LB的200mL液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600＝0.8。加入IPTG，使之終濃度達(dá)到1mM，18℃繼續(xù)培養(yǎng)10小時(shí)。使用His.Bind樹脂純化重組蛋白，pH梯度下洗脫，即可得到序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列的蛋白。

SEQ ID NO.1

MDEPPRAFPITLVVLGIILAMSCADKSAYAKTDAACPVIVSRSDWQAKPPKNRTDMATPVPFVILHHTLWDECYDFESCCAEMRKIQDFHQGNRSWDDIGYNFCVGQDGRIYEGRGWDTVGAHAPWYNLRSIGICIMGNFTVKLPNQKSVDAVSSLIKCAIEENKLKDSYILYGHRQVRDTGCPGDALFKEIQSWPHWKPGQHYPPNQSKPVSQQEIIHHH

序列特征：

長(zhǎng)度：221個(gè)氨基酸

類型：氨基酸

鏈型：?jiǎn)捂?/p>

拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線型

特征：分子量為25.07kDa，等電點(diǎn)為6.54，具有一個(gè)保守的PGRP結(jié)構(gòu)域。

來(lái)源：仿刺參

實(shí)施例2：仿刺參AJ-PGRP編碼區(qū)的原核重組蛋白的細(xì)菌凝集活性分析

對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(G⁺菌)和燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、大腸桿菌(Escherichia coli)(G^-菌)的凝集實(shí)驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD值至0.6，燦爛弧菌采用TCBS培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)至OD值至0.6，然后用生理鹽水稀釋至OD值為0.001，然后5000rpm離心10分鐘收集菌體沉淀，用含10mM ZnCL₂的TBS緩沖液洗滌兩次后重懸，使菌濃度調(diào)至2×10⁹個(gè)細(xì)胞/mL。將20μL重組蛋白分別加入96孔板中，然后加入10μL菌液，室溫孵育1h，陰性對(duì)照組將重組蛋白用牛血清白蛋白(BSA)代替。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白可以凝集上述4種檢測(cè)菌。

實(shí)驗(yàn)表明重組AJ-PGRP蛋白能夠有效凝集革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。

實(shí)施例3：仿刺參AJ-PGRP原核重組蛋白的抑菌活性分析

對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌(G⁺菌)和燦爛弧菌、大腸桿菌(G^-菌)的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD值至0.6，燦爛弧菌接種到TCBS培養(yǎng)基在25℃培養(yǎng)至OD值至0.6，取200uL培養(yǎng)液加入到事先高溫滅菌、冷卻至50℃的35ML LB固體培養(yǎng)基中，倒入90mm的玻璃平皿中，待其完全凝固后，用打孔器打2個(gè)直徑為5mm的孔，分別加入45uL的空載體表達(dá)蛋白和重組蛋白(含20uM ZnCl2)。將平皿30℃培養(yǎng)48小時(shí)。觀察發(fā)現(xiàn)在加了重組蛋白的孔周圍形成了明顯的抑菌圈，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌圈比革蘭氏陰性菌大。只加了空白載體的孔周圍沒(méi)有形成抑菌圈。

實(shí)驗(yàn)表明重組AJ-PGRP蛋白能夠有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，對(duì)革蘭氏陰性菌也有明顯的抑制作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東大學(xué)

<120> 一種具有殺菌活性的仿刺參肽聚糖識(shí)別蛋白及其制備方法和應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 221

<212> PRT

<213> 仿刺參（Apostichopus japonicus）

<400> 1

Met Asp Glu Pro Pro Arg Ala Phe Pro Ile Thr Leu Val Val Leu Gly

1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Met Ser Cys Ala Asp Lys Ser Ala Tyr Ala Lys Thr

20 25 30

Asp Ala Ala Cys Pro Val Ile Val Ser Arg Ser Asp Trp Gln Ala Lys

35 40 45

Pro Pro Lys Asn Arg Thr Asp Met Ala Thr Pro Val Pro Phe Val Ile

50 55 60

Leu His His Thr Leu Trp Asp Glu Cys Tyr Asp Phe Glu Ser Cys Cys

65 70 75 80

Ala Glu Met Arg Lys Ile Gln Asp Phe His Gln Gly Asn Arg Ser Trp

85 90 95

Asp Asp Ile Gly Tyr Asn Phe Cys Val Gly Gln Asp Gly Arg Ile Tyr

100 105 110

Glu Gly Arg Gly Trp Asp Thr Val Gly Ala His Ala Pro Trp Tyr Asn

115 120 125

Leu Arg Ser Ile Gly Ile Cys Ile Met Gly Asn Phe Thr Val Lys Leu

130 135 140

Pro Asn Gln Lys Ser Val Asp Ala Val Ser Ser Leu Ile Lys Cys Ala

145 150 155 160

Ile Glu Glu Asn Lys Leu Lys Asp Ser Tyr Ile Leu Tyr Gly His Arg

165 170 175

Gln Val Arg Asp Thr Gly Cys Pro Gly Asp Ala Leu Phe Lys Glu Ile

180 185 190

Gln Ser Trp Pro His Trp Lys Pro Gly Gln His Tyr Pro Pro Asn Gln

195 200 205

Ser Lys Pro Val Ser Gln Gln Glu Ile Ile His His His

210 215 220