本發(fā)明屬于生殖調(diào)控制劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑。
背景技術(shù)：
虎斑烏賊（Sepia pharaonis）是重要的經(jīng)濟(jì)頭足類，在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有重要地位。其肉質(zhì)新鮮可口，富含豐富的營養(yǎng)元素，還具有潛在的藥用價值，經(jīng)常食用對提高身體的免疫力有重要作用。
GnRH是一種古老而廣泛分布于動物體內(nèi)的生殖激素。GnRH對動物體的生殖調(diào)控起非常重要的作用。人體若缺乏GnRH將會引起一系列機(jī)體病變的發(fā)生，如卡爾曼式綜合癥（Kallmann Syndrome，KS），該病有多種發(fā)病機(jī)制，但主要是由于缺少GnRH導(dǎo)致可能伴有嗅覺缺失的促性腺激素型性腺功能衰退。然而對養(yǎng)殖動物注射GnRH或GnRH類似物能夠降低動物體自身產(chǎn)生的相關(guān)激素水平，最終喪失全部或部分生育能力。GnRH除了調(diào)控動物體生殖生理功能外，同時還有一些其他的生理功能。在魚類中，GnRH能夠影響生長激素的分泌，在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中充當(dāng)神經(jīng)遞質(zhì)，行使神經(jīng)調(diào)節(jié)的功能。在魚的性腺及消化道中，起到旁分泌的調(diào)節(jié)因子作用。在斑馬魚早期發(fā)育時期中，GnRH-Ⅲ的缺乏能夠?qū)е履X和心臟發(fā)育缺陷。
現(xiàn)有技術(shù)公告號CN1285607C 中華硬蜱神經(jīng)肽及其制備方法和應(yīng)用 中國發(fā)明授權(quán)文獻(xiàn) 本該發(fā)明涉及一種中華硬蜱神經(jīng)肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。中華硬蜱神經(jīng)肽是從中國節(jié)肢類動物中華硬蜱神經(jīng)節(jié)中分離得到的一種單鏈小肽，分子量1005.22道爾頓，等電點8.59，小肽全序列一級結(jié)構(gòu)為：NH2-LVVYPWTK-COOH。其制備方法是把中華硬蜱粘于表面皿的底部并置于冰上20min，接著沿背側(cè)緣切開硬蜱取出神經(jīng)節(jié)，將取出的神經(jīng)節(jié)勻漿、離心去除沉淀、過濾膜過濾，經(jīng)兩次反相高效液相色譜法(RP-HPLC)分離純化得到。中華硬蜱神經(jīng)肽具有很強(qiáng)鎮(zhèn)痛活性，可作為制備鎮(zhèn)痛藥物的應(yīng)用。該發(fā)明具有序列簡單、鎮(zhèn)痛活性強(qiáng)等優(yōu)點，但是前期組織保存方面有待改進(jìn)，提取工藝還具有提升空間。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對上述技術(shù)問題提供一種可冷凍保存組織且效果優(yōu)異，神經(jīng)肽提取率較高，制備的控制劑無需長時間持續(xù)或重復(fù)的注射，制備工藝簡單的虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑。
本發(fā)明針對上述技術(shù)問題所采取的方案為：虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑，制備步驟如下：
1）預(yù)處理：取活體虎斑烏賊解剖取腦組織于保存液，超低溫保存；
2）取上清液：取腦組織加入等體積生理鹽水，勻漿，離心，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱層析：將上清液C經(jīng)柱層析，層析，顯色，收集組分，制得神經(jīng)肽；
4）催化：將神經(jīng)肽在硝酸銨和金屬鎘的催化下與GnRH衍生物發(fā)生取代反應(yīng)，生成虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑。
步驟1中超低溫保存溫度為-70~-90℃，防止烏賊腦部組織降解影響提取效果，且保存效果優(yōu)異。
步驟2中勻漿5~10min，離心轉(zhuǎn)速為2500~4000r/min，離心15~25min，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心轉(zhuǎn)速為2800~4500r/min,離心18~30min ,取上清液B，將雜質(zhì)去除，為后續(xù)的柱層析作工藝準(zhǔn)備。
步驟3中將上清液C經(jīng)直徑為10~20cm，高度為40~60cm，的Sephadex G50柱層析，對層析液進(jìn)行硅膠薄層層析和茚三酮顯色，收集Rf值為0.45~0.55的組分，達(dá)到分離物質(zhì)獲得Rf值在0.45~0.55的組分。
步驟4中GnRH衍生物為GnRH-a，GnRH-a對垂體具有雙作用。
步驟1中的保存液由以下成分及重量份組成：枸櫞酸鉀1~10份、枸櫞酸鈉10~50份、硫酸鎂1~15份、腺嘌呤核苷1~10份、磷酸腺嘌呤1~15份、氫氧化鈉10~60份、磷酸二氫鈉10~60份、硫胺素0.001~0.006、海藻糖25~250份、葡萄糖酸內(nèi)酯5~150份、 二十碳五烯酸0.003~0.009、聚乙二醇0.01~0.15份、左旋精氨酸1~10份、色氨酸1~10份、鹽酸川芎嗪0.005~0.075份、還原型谷胱甘肽1~10份、共軛亞油酸0.008~0.012份、雙蒸水700~860份。保存效果好，可實現(xiàn)組織在常溫或超低溫下貯存。
步驟2中的生理鹽水由以下成分及重量份組成：氯化鈉0.7~1份、硫代甜菜堿0.001~0.003、薁0.002~0.003份、蒸餾水100份。防治組織失水損失活性。
有益效果：本發(fā)明可冷凍保存組織且效果優(yōu)異，可有效防止烏賊腦部組織降解，可隨時使用冷凍保存的組織做實驗，效果和新鮮獲得的組織相同，神經(jīng)肽提取率較高，使用的生理鹽水可很好的防止組織失水損失活性，制備的控制劑無需長時間持續(xù)或重復(fù)的注射，在預(yù)防或治療激素依賴疾病藥物中的應(yīng)用。
具體實施例
以下結(jié)合實施例作進(jìn)一步詳細(xì)描述：
實施例1：
虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑，制備步驟如下：
1）預(yù)處理：取活體虎斑烏賊解剖取腦組織于保存液，超低溫保存；
2）取上清液：取腦組織加入等體積生理鹽水，勻漿，離心，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱層析：將上清液C經(jīng)柱層析，層析，顯色，收集組分，得神經(jīng)肽；
4）催化：將神經(jīng)肽在硝酸銨和金屬鎘的催化下與GnRH衍生物發(fā)生取代反應(yīng)，生成虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑。
步驟1中超低溫保存溫度為-70~-90℃，防止烏賊腦部組織降解影響提取效果，且保存效果優(yōu)異。
步驟2中勻漿5~10min，離心轉(zhuǎn)速為2500~4000r/min，離心15~25min，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心轉(zhuǎn)速為2800~4500r/min,離心18~30min ,取上清液B，將雜質(zhì)去除，為后續(xù)的柱層析作工藝準(zhǔn)備。
步驟3中將上清液C經(jīng)直徑為10~20cm，高度為40~60cm，的Sephadex G50柱層析，對層析液進(jìn)行硅膠薄層層析和茚三酮顯色，收集Rf值為0.45~0.55的組分，達(dá)到分離物質(zhì)獲得Rf值在0.45~0.55的組分。
步驟4中GnRH衍生物為GnRH-a，GnRH-a對垂體具有雙作用。
步驟1中的保存液由以下成分及重量份組成：枸櫞酸鉀1~10份、枸櫞酸鈉10~50份、硫酸鎂1~15份、腺嘌呤核苷1~10份、磷酸腺嘌呤1~15份、氫氧化鈉10~60份、磷酸二氫鈉10~60份、硫胺素0.001~0.006、海藻糖25~250份、葡萄糖酸內(nèi)酯5~150份、 二十碳五烯酸0.003~0.009、聚乙二醇0.01~0.15份、左旋精氨酸1~10份、色氨酸1~10份、鹽酸川芎嗪0.005~0.075份、還原型谷胱甘肽1~10份、共軛亞油酸0.008~0.012份、雙蒸水700~860份。保存效果好，可在常溫或超低溫下貯存。
步驟2中的生理鹽水由以下成分及重量份組成：氯化鈉0.7~1份、硫代甜菜堿0.001~0.003、薁0.002~0.003份、蒸餾水100份。防治物質(zhì)失水損失活性。
實施例2：
虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑，制備步驟如下：
1）預(yù)處理：取活體虎斑烏賊解剖取腦組織于保存液，超低溫保存；
2）取上清液：取腦組織加入等體積生理鹽水，勻漿，離心，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心，取上清液B，合并上清液A、B得上清液C；
3）柱層析：將上清液C經(jīng)柱層析，層析，顯色，收集組分，得神經(jīng)肽；
4）催化：將神經(jīng)肽在硝酸銨和金屬鎘的催化下與GnRH衍生物發(fā)生取代反應(yīng)，生成虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑。
步驟1中超低溫保存溫度優(yōu)選為-80℃，防止烏賊腦部組織降解影響提取效果，且保存效果優(yōu)異。
步驟2中勻漿時間優(yōu)選為6min，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為3000r/min，離心時間優(yōu)選為20min，取上清液A，再加入等體積蒸餾水，離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為3000r/min,離心時間優(yōu)選為20min ,取上清液B，將雜質(zhì)去除，為后續(xù)的柱層析作工藝準(zhǔn)備。
步驟3中將上清液C經(jīng)直徑優(yōu)選為10cm，高度優(yōu)選為50cm，的Sephadex G50柱層析，對層析液進(jìn)行硅膠薄層層析和茚三酮顯色，收集Rf值優(yōu)選為0.5的組分，達(dá)到分離物質(zhì)獲得Rf值在0.5的組分。
步驟4中GnRH衍生物為GnRH-a，GnRH-a對垂體具有雙作用。
步驟1中的保存液由以下成分及優(yōu)選的重量份組成：枸櫞酸鉀7份、枸櫞酸鈉30份、硫酸鎂8份、腺嘌呤核苷9份、磷酸腺嘌呤12份、氫氧化鈉30份、磷酸二氫鈉45份、硫胺素0.004份、海藻糖80份、葡萄糖酸內(nèi)酯70份、二十碳五烯酸0.005份、聚乙二醇0.012份、左旋精氨酸7份、色氨酸8份、鹽酸川芎嗪0.006份、還原型谷胱甘肽8份、薁0.0026份、雙蒸水800份。保存效果好，可在常溫或超低溫下貯存。
步驟2中的生理鹽水由以下成分及優(yōu)選的重量份組成：氯化鈉0.9份、硫代甜菜堿0.0015份、共軛亞油酸0.01份、蒸餾水90份。防治組織失水損失活性。
虎斑烏賊神經(jīng)肽GnRH生殖調(diào)控制劑無需長時間持續(xù)或重復(fù)的注射，在預(yù)防或治療激素依賴疾病藥物中的應(yīng)用，激素依賴疾病例如：性激素依賴的癌癥：前列腺癌，宮頸癌，乳腺癌，垂體腺瘤；良性前列腺肥大，子宮肌瘤，子宮內(nèi)膜異位等。
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何限制。凡是根據(jù)發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變化，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍內(nèi)。