一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用，特點是包括以下步驟：將嗜酸乳桿菌保藏號為CGMCCNo.8920按體積百分比2.0-4.0%接種在MRS培養(yǎng)基上，于37℃下厭氧培養(yǎng)18-24h后，于4000-8000g離心15-20min除去發(fā)酵液，再將沉淀菌體中加入4wt%的SDS溶液，100℃下高溫裂解30min除去蛋白成分，在沉淀物中加入10wt%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物于4℃過夜透析脫鹽后，將沉淀物于-80℃預凍6h后，迅速放入真空冷凍干燥設備中于80-120Pa干燥處理24h，得到的粉末即為產(chǎn)品，優(yōu)點是對LPS引起的炎癥反應具有較好的抑炎調(diào)節(jié)功能。
【專利說明】一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及肽聚糖的制備方法，尤其是涉及一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用。
【背景技術】
[0002]乳酸菌作為一類重要的定植型腸道益生菌，被廣泛的應用于發(fā)酵食品加工中，尤其是酸乳，干酪，泡菜等。腸內(nèi)乳酸菌與宿主健康的密切關系，越來越多的被國內(nèi)外微生物學家闡述，尤其在誘導有關免疫調(diào)控因子的釋放來刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮其抗感染、抗腫瘤等生物效應方面。在乳酸菌對宿主的免疫調(diào)節(jié)活性方面，最近研究發(fā)現(xiàn)某些活菌和死菌間并沒有顯著差異，推測發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用的原因之一可能是其細胞壁中的肽聚糖(PGN)、磷壁酸(LTA)及表層蛋白等物質(zhì)。益生菌肽聚糖，由于其在免疫調(diào)節(jié)中所發(fā)揮作用的探究相對缺乏，正潛移默化的被越來越多的研究者們所關注。
[0003]嗜酸乳桿菌acidophilus')作為一種重要的腸道益生菌,其細胞壁肽聚糖作為一種免疫增強劑，通過調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)，可增強機體非特異性免疫功能，對機體健康具有重要作用。然而，嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及抗炎活性研究未見相關報道，市場上也為出現(xiàn)以嗜酸乳 桿菌肽聚糖相關的功能食品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種對LPS引起的炎癥反應具有較好的抑炎調(diào)節(jié)功能的功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用。
[0005]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，具體包括以下步驟:將海洋源的嗜酸乳桿菌iLactobaciIIus acidophiIus、傾氣號為CGMCC N0.8920，按體積百分比2.0-4.0%的接種量，接種在MRS培養(yǎng)基上，于37°C下，厭氧培養(yǎng)18_24h后，于4000-8000g離心15_20min，除去菌體發(fā)酵液，然后將沉淀菌體中加入質(zhì)量分數(shù)為4%的SDS溶液，100°C下高溫裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，將沉淀物于4°C過夜透析脫鹽后，將沉淀物于-80°C預凍6h后，迅速放入真空冷凍干燥設備中于80-120Pa干燥處理24h，得到的粉末即為嗜酸乳桿菌肽聚糖。
[0006]所述的沉淀菌體與所述的SDS溶液的比例為Ig:100ml,所述的沉淀菌體與所述的三氯乙酸溶液的比例為Ig:100ml。
[0007]上述功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的抗炎活性應用，該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖對大腸桿菌脂多糖(LPS)引起的炎癥反應具有較好的抑炎調(diào)節(jié)功能，即嗜酸乳桿菌肽聚糖對iNOS及C0X-2蛋白表達具有抑制作用，在Raw264.7巨噬細胞模型上有效抑炎濃度為100_200M"g/mL。
[0008]該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖經(jīng)免疫切片發(fā)現(xiàn)，該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖有效的降低了 iNOS在小腸腸壁細胞的表達量，在小鼠模型上的有效抑炎劑量為100mg/kg/d。
[0009]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于:
本發(fā)明一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法及其抗炎活性應用，首次證明該嗜酸乳桿菌肽聚糖存在著降低大腸桿菌脂多糖引起的炎癥反應，為乳酸菌調(diào)節(jié)腸道免疫活性，調(diào)控相關免疫因子的釋放來刺激免疫系統(tǒng)發(fā)揮其抗感染，開發(fā)乳酸菌新型保健因子、功能性食品或藥品提供理論依據(jù)。
[0010]嗜酸乳桿菌{Lactobacillusacidophilus')，菌株為 WZ-D1,保藏號為 CGMCCN0.8920，于2014年03月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為實施例1中嗜酸乳桿菌菌體掃描電鏡圖；
圖2為實施例1中制備的嗜酸乳桿菌肽聚糖掃描電鏡圖；
圖3為實施例1中嗜酸乳桿菌肽聚糖的HPLC分析圖譜；
圖4為實施例2中嗜酸乳桿菌肽聚糖紅外掃描光譜圖；
圖5為實施例3中嗜酸乳桿菌肽聚糖對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子的抑制作用的試驗對比圖；
圖6為實施例3 ICR小鼠實驗中不同處理組中的腸細胞中iNOS的表達量差異的試驗對比圖；從左到右依次為正常對照組、致病性大腸桿菌感染組、肽聚糖治療組。
【具體實施方式】
[0012]以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0013]具體實施例1
嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備
將海洋源的嗜酸乳桿菌acidophilus、保氣CGMCC N0.8920按體積百分比2.0-4.0%的接種量，接種在MRS培養(yǎng)基上，于37°C下，厭氧培養(yǎng)18_24h后，于4000-8000g離心15-20min，除去菌體發(fā)酵液，然后取沉淀菌體Ig加入質(zhì)量分數(shù)為4%的SDS溶液，100°C下高溫裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，將沉淀物于4°C過夜透析脫鹽后，將沉淀物于_80°C預凍6h后，迅速放入真空冷凍干燥設備中于80-120Pa干燥處理24h，得到的粉末即為嗜酸乳桿菌肽聚糖。樣品貯藏于_40°C冰箱里以備用。其中圖1為嗜酸乳桿菌菌體掃描電鏡圖，圖2為制備的嗜酸乳桿菌肽聚糖掃描電鏡圖。嗜酸乳桿菌肽聚糖相比嗜酸乳桿菌有顯著的不同，橢圓桿狀的形態(tài)被破壞，而圖2為提取的肽聚糖成分。
[0014]肽聚糖的提取率按下列公式計算，本實例所得到的肽聚糖提取率為26.5%。
[0015]提取率(%)=(肽聚糖干重/菌體干重)X 100
肽聚糖的純度通過 HPLC方法驗證,安捷倫Agilent 1200 Inf inity設備,伯樂公司的Aminex HPX-87H糖柱(300 X 7.8 mm)，進樣量20ul，進樣濃度lmg/ml，柱溫37°C，洗脫液為5 mM硫酸溶液,流速0.5 ml/min,時間20min,檢測方法225 nm紫外分光法。結(jié)果如圖3所示，來源于嗜酸乳桿菌細胞壁肽聚糖的HPLC出峰時間為7.618min。本實例所得到的肽聚糖純度為99.9%。
[0016]純度(％)=(肽聚糖的出峰面積/檢測樣品的總出峰面積)X 100
上述嗜酸乳桿菌iLactobaciIlus acidophiIus)，菌株為WZ-DI,保藏號為CGMCCN0.8920，于2014年03月14日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0017]具體實施例2
將上述實施例1制備獲得的嗜酸乳桿菌肽聚糖進行質(zhì)譜(MALD1-TOF/TOF MS)檢測分析；嗜酸乳桿菌肽聚糖粉末進行氨基酸分析及紅外(RI)檢測。
[0018]1、肽聚糖的分子量及亞結(jié)構(gòu)
將I微升濃度為lmg/ml的嗜酸乳桿菌肽聚糖溶液與I微升50 mg/ml的2，5- 二羥基苯甲酸混合，混合均勻后，取I微升混合液上樣，進行質(zhì)譜分析。儀器型號FLEX-PC，類型為ultraflex T0F/T0F。該方案所檢測到的肽聚糖的分子量為875.260 Da，具體分析如下表1所示。
[0019]表1肽聚糖離子片段表
【權利要求】
1.一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟:將海洋源的嗜酸乳桿菌acidophilus')嫁嚴CGMCC N0.8920,按體積百分比2.0-4.0%的接種量，接種在MRS培養(yǎng)基上，于37 °C下，厭氧培養(yǎng)18_24h后，于4000_8000g離心15-20min，除去菌體發(fā)酵液，然后將沉淀菌體中加入質(zhì)量分數(shù)為4%的SDS溶液，100°C下高溫裂解30min，除去蛋白成分；取沉淀物，在沉淀物中加入質(zhì)量分數(shù)為10%的三氯乙酸溶液，除去磷壁酸；取沉淀物，將沉淀物于4°C過夜透析脫鹽后，將沉淀物于-80°C預凍6h后，迅速放入真空冷凍干燥設備中于80-120Pa干燥處理24h，得到的粉末即為嗜酸乳桿菌肽聚糖。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的制備方法，其特征在于:所述的沉淀菌體與所述的SDS溶液的比例為Ig:100ml，所述的沉淀菌體與所述的三氯乙酸溶液的比例為Ig:100ml。
3.一種根據(jù)權利要求1所述的功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的抗炎活性應用，其特征在于:該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖對大腸桿菌脂多糖(LPS)引起的炎癥反應具有較好的抑炎調(diào)節(jié)功能，即嗜酸乳桿菌肽聚糖對iNOS及C0X-2蛋白表達具有抑制作用，在Raw264.7巨噬細胞模型上有效抑炎濃度為100-200mg/mL。
4.一種根據(jù)權利要求1所述的功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖的抗炎活性應用，其特征在于:該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖經(jīng)免疫切片發(fā)現(xiàn)，該功能性嗜酸乳桿菌肽聚糖有效的降低了 iNOS在小腸腸 壁細胞的表達量，在小鼠模型上的有效抑炎劑量為100mg/kg/d。
【文檔編號】C12P19/04GK103981232SQ201410156383
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】潘道東, 吳振, 孫楊贏, 曾小群, 曹錦軒, 李樺 申請人:寧波大學