專利名稱：一種完整肽聚糖及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物制劑技術領域，尤其涉及一種應用化學方法提取來自保加利亞乳
桿菌的完整肽聚糖及其方法。
背景技術：
癌癥是威脅人類生命的重要疾病之一。世界衛(wèi)生組織和各國政府的衛(wèi)生部門都把
攻克癌癥作為一項重要的工作。研究開發(fā)新型、高效的抗腫瘤新藥不僅具有良好的經(jīng)濟效
益，更會帶來巨大的社會效益。 一般情況下，抗腫瘤藥物因原料稀少或科技含量較高價格都
很昂貴，因此研究生產(chǎn)出一種療效顯著、價格低廉的抗癌藥物是社會所需。 國內(nèi)外學者經(jīng)過研究明確闡明保加利亞乳桿菌是生理性有益菌，它對維持人體健
康起重要的作用，包括生物學屏蔽、合成多種維生素、控制內(nèi)毒素血癥、抑制腐敗細菌、致
病菌在腸道中生長繁殖，提供營養(yǎng)，提高機體免疫力、預防和治療與抗生素有關的腹瀉、便
秘、抗腫瘤、預防癌變、抗感染等。在以小鼠為模型的研究中表明保加利亞乳桿菌對肝癌、結(jié)
腸癌、乳腺癌及艾氏腹水瘤等腫瘤具有一定的抑制作用。研究證明保加利亞乳桿菌的抑制
腫瘤活性與其細胞壁中的完整肽聚糖密切相關，同時作為提取自保加利亞乳桿菌細胞壁的
天然產(chǎn)物，其不會有任何毒副作用 目前國內(nèi)外相關文獻中缺乏關于保加利亞乳桿菌提取完整肽聚糖的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空間結(jié)構(gòu)完整，與不完整肽聚糖相比，更能有效抑制腫瘤生長，可廣泛應用于抗腫瘤藥物。 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種從保加利亞乳桿菌中提取完整肽聚糖的方法，利用本發(fā)明能提取高純度及完整的肽聚糖。 本發(fā)明的第一個目的由如下技術方案實施通過三氯乙酸抽提磷壁酸使細胞膜通
透性增加，有利于外界物質(zhì)更好的作用于細胞和細胞內(nèi)容物排出，然后脫脂去除胞膜上的
脂肪類物質(zhì)，用酶解液去除細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即
獲得的完整肽聚糖，通過透射電鏡觀察可見其細胞壁骨架結(jié)構(gòu)完整。 本發(fā)明的另一個目的由如下技術方案實施 —種完整肽聚糖的制備方法，包括以下步驟 (1)菌體的清洗與收集步驟 取保加利亞乳桿菌濕菌體100重量份，按1克重量份比10毫升體積份的比例加入1000體積份生理鹽水，通過離心分離，800克力離心10分鐘，棄去沉淀；將獲得的上清液4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌體；
(2)磷壁酸的去除步驟 取收集到的所述濕菌體，按1克重量份所述濕菌體比10毫升體積份的8%三氯乙酸溶液比例均勻混合后，于5(TC水浴加熱3小時，通過400Q克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物； (3)脫脂步驟 a、將所述沉淀物，按1克重量份所述沉淀物比2毫升體積份甲醇的比例，加入
100%濃度甲醇中，搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到一次沉淀物； b、將所述一次沉淀物，按1克重量份所述一次沉淀物比2毫升體積份丙酮的比例，
加入100%濃度丙酮中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到二次沉淀物； c、將所述二次沉淀物，按1克重量份所述二次沉淀物比2毫升體積份無菌水的比
例，加入無菌水中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到脫脂沉淀物； (4)酶解步驟 a、按克重量份比毫升體積份，取3重量份胃蛋白酶和4重量份胰蛋白酶比4000體積份pH7. 2Tris-鹽酸緩沖液的比例混合均勻，配制成酶解液； b、取所述脫脂沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比15毫升體積份所述酶解液的比例，加入所述酶解液中搖勻，在37t:水浴加熱8小時后，再8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到一次酶解沉淀物； c、所述一次酶解沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比15毫升體積份無菌水的比例，加入無菌水中搖勻，8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到二次酶解沉淀物；
(5)凍干保存步驟 a、所述二次酶解沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比5毫升體積份無菌水的比例，加入無菌水中混合均勻，進行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即為保加利亞乳桿菌完整肽聚糖成品。 本發(fā)明的優(yōu)點在于由于制備方法條件溫和、且整個純化過程中不使用任何物理與化學方法破壞細胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，因此分離得到了細胞骨架完整的肽聚糖。因能提取完整肽聚糖，其細胞壁結(jié)構(gòu)完整，具有良好的抗腫瘤作用。本發(fā)明的制備方法實用性強、操作簡單、周期短、步驟簡便合理，具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點。


圖1為實施例2原菌體和完整肽聚糖的電鏡透視檢測對比圖。
其中1為原菌體，2為完整肽聚糖。
具體實施例方式
以下通過實施例進一步闡述本發(fā)明藥物，這些實施例僅用于舉例說明的目的，并
沒有限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 : 通過三氯乙酸抽提保加利亞乳桿菌的磷壁酸使細胞膜通透性增加，有利于外界物質(zhì)更好的作用于細胞和細胞內(nèi)容物排出，然后脫脂去除胞膜上的脂肪類物質(zhì)，用酶解液去除細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即獲得的完整肽聚糖，通過透射電鏡觀察可見其細胞壁骨架結(jié)構(gòu)完整。保加利亞乳桿菌可從內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司公開銷售中獲得。 該完整肽聚糖的制備方法包括以下步驟
(1)菌體的清洗與收集步驟 取保加利亞乳桿菌濕菌體100克，加入1000毫升生理鹽水，通過離心分離，800克力離心10分鐘，棄去沉淀；將獲得的上清液4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌體； (2)磷壁酸的去除步驟 取收集到的所述濕菌體，按1克所述濕菌體比10毫升的8%三氯乙酸溶液比例均勻混合后，于5(TC水浴加熱3小時，通過4000克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物；
(3)脫脂步驟 a、將所述沉淀物，按1克所述沉淀物比2毫升甲醇的比例，加入100 %濃度甲醇中，搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到一次沉淀物； b、將所述一次沉淀物，按1克所述一次沉淀物比2毫升丙酮的比例，加入100%濃
度丙酮中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到二次沉淀物； c、將所述二次沉淀物，按l克所述二次沉淀物比2毫升無菌水的比例，加入無菌水
中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到脫脂沉淀物； (4)酶解步驟 a、取3克胃蛋白酶和4克胰蛋白酶比4000毫升pH7. 2Tris-鹽酸緩沖液混合均勻，配制成酶解液； b、取所述脫脂沉淀物，按1克所述脫脂沉淀物比15毫升所述酶解液的比例，加入所述酶解液中搖勻，在37t:水浴加熱8小時后，再8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到一次酶解沉淀物； c、所述一次酶解沉淀物，按1克所述脫脂沉淀物比15毫升無菌水的比例，加入無菌水中搖勻，8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到二次酶解沉淀物；
(5)凍干保存步驟 a、所述二次酶解沉淀物，按l克所述脫脂沉淀物比5毫升無菌水的比例，加入無菌水中混合均勻，進行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即為保加利亞乳桿菌完整肽聚糖成品。
實施例2 :本發(fā)明公開的一種保加利亞乳桿菌的完整肽聚糖的結(jié)構(gòu)完整性檢測
將本發(fā)明實施例1中的原菌體及所制得的完整肽聚糖通過電鏡透視檢測，見圖1所示。結(jié)果可見，完整肽聚糖仍保留原菌體的完整外部結(jié)構(gòu)。 實施例3 :本發(fā)明公開的一種保加利亞乳桿菌的完整肽聚糖的抑制腫瘤效果試驗
無菌操作下抽取腹腔積液H22肝癌昆明鼠的腹腔積液，臺盼藍染色檢查癌細胞成活率，成活率大于95%的腹腔積液瘤細胞用無血清培養(yǎng)基調(diào)至1X107個/mL。取正常昆明鼠40只，雌雄各半，適應性喂養(yǎng)3d常規(guī)消毒后在每只鼠右腋部皮下接種注射2 X 106個癌細胞(0.2mL)。 l周后，小鼠肝癌模型建立成功，于接種處長出直徑約lcm的癌腫。造模后小鼠隨機分為4組，每組10只，即對照組(滅菌PBSlmL/d)、保加利亞乳桿菌完整肽聚糖低劑量組(0. lmL/d)、中劑量組(0. 5mL/d)、高劑量組(lmL/d) 3個劑量給藥組。于造模24hrs皮下注射，連續(xù)給藥12d。在停藥次日，將對照組、實驗組稱重并處死小鼠，解剖剝離瘤塊，稱瘤重，按平均瘤重計算抑瘤率，具體見下表 保加利亞乳桿菌WPG對荷瘤小鼠的抑瘤效果(S±s, n = 10)
5組別 劑量 體重(g) 瘤重(g) 抑瘤 平均存 生命延
率(％)活期(d) 長率(《 由上表可知，保加利亞乳桿菌WPG對H22荷瘤小鼠腫瘤生長有抑制作用，低、中、高三個劑量組的抑瘤率分別是16. 92% 、37. 46% 、40. 78% ;生命延長率為16. 76% 、62. 59%、65. 89%。各劑量組與對照組小鼠體重均正常增加，試驗動物最終體重無明顯差異。
滅活保加利亞乳桿菌
保加利亞乳桿菌完整肽聚糖
試驗前 試驗后
20. 03±32.03 ±3. 31±
0. 870,.870. 41
20. 42 ±32.21±3. 07±
0. 351,.150. 26
20. 27±32.63±2. 61±
0. 510,.880. 32
20. 00±32.97±2. 55±
0.290,.460. 44
20. 16±32.78 ±2. 75±
0. 710,.730. 62
20. 19±33.51±2. 07±
0. 490.,190. 39
20. 33±33.64 ±1. 96±
0. 230,.340, 28
7. 25
21. 15
22. 9616. 92
37. 46
a
40. 78
a10.32 ±
2,.5711.89±
3,.2112.27±2..1615.00±
4,.6712.05±3..3316.78 ±5..6717.12±
6,.33
15. 2118. 89
45. 35
16. 76
62. 59b
65. 89b
照 劑組劑組劑組劑組劑組劑組
對 低量中量高量低量中量高量
權利要求
一種完整肽聚糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)菌體的清洗與收集步驟取保加利亞乳桿菌濕菌體100重量份，按1克重量份比10毫升體積份的比例加入1000體積份生理鹽水，通過離心分離，800克力離心10分鐘，棄去沉淀；將獲得的上清液4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到濕菌體；(2)磷壁酸的去除步驟取收集到的所述濕菌體，按1克重量份所述濕菌體比10毫升體積份的8％三氯乙酸溶液比例均勻混合后，于50℃水浴加熱3小時，通過4000克力離心30分鐘，棄去上清液，取得沉淀物；(3)脫脂步驟a、將所述沉淀物，按1克重量份所述沉淀物比2毫升體積份甲醇的比例，加入100％濃度甲醇中，搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到一次沉淀物；b、將所述一次沉淀物，按1克重量份所述一次沉淀物比2毫升體積份丙酮的比例，加入100％濃度丙酮中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到二次沉淀物；c、將所述二次沉淀物，按1克重量份所述二次沉淀物比2毫升體積份無菌水的比例，加入無菌水中搖勻，4000克力離心30分鐘，棄去上清液，得到脫脂沉淀物；(4)酶解步驟a、按克重量份比毫升體積份的比例，取3重量份胃蛋白酶和4重量份胰蛋白酶比4000體積份pH7.2Tris-鹽酸緩沖液的比例混合均勻，配制成酶解液；b、取所述脫脂沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比15毫升體積份所述酶解液的比例，加入所述酶解液中搖勻，在37℃水浴加熱8小時后，再8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到一次酶解沉淀物；c、所述一次酶解沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比15毫升體積份無菌水的比例，加入無菌水中搖勻，8000克力離心15分鐘，棄去上清液，得到二次酶解沉淀物；(5)凍干保存步驟a、所述二次酶解沉淀物，按1克重量份所述脫脂沉淀物比5毫升體積份無菌水的比例，加入無菌水中混合均勻，進行真空冷凍干燥至白色絮狀粉末，即為保加利亞乳桿菌完整肽聚糖成品。
2. 根據(jù)權利要求1所述一種完整肽聚糖的制備方法制備的完整肽聚糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種完整肽聚糖，因所提取肽聚糖空間結(jié)構(gòu)完整，能有效抑制腫瘤生長，可廣泛應用于抗腫瘤藥物。本發(fā)明還公開了一種提取完整肽聚糖的方法，通過抽提磷壁酸使細胞膜通透性增加，脫脂去除胞膜上的脂肪類物質(zhì)，用酶解液去除細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，最后通過離心清洗去除雜質(zhì)后凍干即獲得的完整肽聚糖。本發(fā)明的優(yōu)點在于因能提取完整肽聚糖，其細胞壁結(jié)構(gòu)完整，具有良好的抗腫瘤作用。制備方法實用性強、操作簡單、周期短、步驟簡便合理，具有成本低、產(chǎn)率高、適宜規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點。
文檔編號C12P21/06GK101717806SQ20091025387
公開日2010年6月2日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權日2009年12月3日
發(fā)明者付艷茹, 馮謙, 劉彥民, 張麗萍, 程超, 黃少磊, 龔虹 申請人:內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司