專利名稱：抗癌及抗感染性疾病組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及非致病性病毒作為有效抗癌 藥物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
縮寫單詞表
A549_人肺上皮腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)cNPV-苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒腦C-骨髓衍生的樹(shù)突細(xì)胞BV422-表達(dá)CCL21的重組桿狀病毒BV762-表達(dá)Raf的重組桿狀病毒CCL21-C-C基序配體21趨化因子；次級(jí)淋巴組織趨化因子CD86-樹(shù)突細(xì)胞成熟的標(biāo)記物CR_完全有效CTL_細(xì)胞毒T細(xì)胞溶解DC_樹(shù)突細(xì)胞FACS-熒光激活細(xì)胞分選GM-CSF_粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞集落剌激因子GV-顆粒體病毒HIV_人免疫缺陷病毒i. t.-腫瘤內(nèi)mCCL21-鼠CCL21MHC-主要組織相容性復(fù)合物MHC II-MHC II類分子MLA-DR-MHC I類分子抗原MOI-感染復(fù)數(shù)NPV-核型多角體病毒PBMC-外周血單核細(xì)胞PFU-噬斑形成單位qd-每天每天(每日給藥)rhCCL21-重組人CCL21s. c._皮下注射
Sf (Sf 9) _草地夜蛾
Tn(Tn5) _粉紋夜蛾
UV -紫外線 VLP _病毒樣顆粒 調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療策略。目前在設(shè)計(jì)腫瘤疫苗及免疫 治療措施時(shí)注意力主要集中在鑒定腫瘤細(xì)胞特異性的抗原上。利用腫瘤特異性抗原或表 達(dá)腫瘤特異性抗原的基因所具有的獨(dú)特的腫瘤免疫原性可以通過(guò)疫苗免疫來(lái)誘導(dǎo)出腫瘤 特異性的免疫應(yīng)答。疫苗接種方法也包括適應(yīng)性細(xì)胞免疫治療方法，其中抗原提呈細(xì)胞經(jīng) 改造后可提呈腫瘤相關(guān)抗原。其他的腫瘤免疫治療措施包括給予細(xì)胞因子和趨化因子，這 些因子在抗腫瘤治療中可作為佐劑或藥物產(chǎn)生療效，因?yàn)樗鼈兙哂袛U(kuò)增和補(bǔ)充免疫效應(yīng)細(xì) 胞的能力。見(jiàn)Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2 :175-84 ;Parmiani等，(2002) J Natl Cancer Inst 94 :805-18 ;Bronte (2001) Curr Gene Therl :53-100 ;以及Fehniger等， (2002)Cytokine Growth Factor Rev 13:169-83。 免疫治療措施雖然具有上述優(yōu)點(diǎn)，但是要想取得成功還受到下列因素的限制(1) 腫瘤特異性的抗原性，因此這種治療方法還只限于某些類型的腫瘤；(2)腫瘤細(xì)胞提呈抗 原的能力弱；以及(3)腫瘤細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫抑制因子來(lái)逃避免疫監(jiān)視。因此，在本領(lǐng)域中 一直需要找到一種有效而廣譜的腫瘤治療措施。為了滿足這一需求，本發(fā)明提供了新型的 免疫剌激方法以治療和預(yù)防腫瘤。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給予動(dòng)物一定量的組合
物，該組合物包含能有效誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的滅活的非致病性病毒。 本發(fā)明還提供了導(dǎo)致細(xì)胞死亡的方法，該方法包括將含有一定量的非致病性病毒
的組合物給予細(xì)胞以導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。 另外，本發(fā)明還提供了在動(dòng)物體內(nèi)剌激CTL反應(yīng)的方法，該方法包括將含有一定 量的非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以剌激動(dòng)物體內(nèi)的CTL反應(yīng)，其中非致病性的病毒是 昆蟲特異性病毒。 本發(fā)明提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的方法，該方法包括將一定量的含有昆蟲特
異性的非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。 本發(fā)明還提供了影響動(dòng)物體內(nèi)腫瘤緩解的方法，該方法包括將一定量的含有非致
病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地影響腫瘤的緩解。 本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括將一定量的含有非致 病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地抑制腫瘤在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。 本發(fā)明提供了使動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤耐受的方法，該方法包括將含有非致病性 病毒的組合物給予動(dòng)物。 另外，本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)的非腫瘤性增生性疾病的方法，該方法包括 將含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物。 本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)的異常增生或化生的方法，該方法包括將一定量的 含有非致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地抑制動(dòng)物體內(nèi)的異常增生。
本發(fā)明還提供了抑制患病個(gè)體的一種或多種腫瘤癥狀的方法，該方法包括將一定 量的含有非致病性病毒的組合物給予患病個(gè)體以有效地抑制其體內(nèi)的一種或多種腫瘤癥 狀。 另外，本發(fā)明還提供了保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病感染的方法，該方法包括將一定 量的含有非致病性滅活病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病的感染。
本發(fā)明還提供了抑制動(dòng)物體內(nèi)感染性疾病的方法，該方法包括將一定量的含有非 致病性病毒的組合物給予動(dòng)物以有效地防止動(dòng)物發(fā)生感染性疾病。 本發(fā)明提供了導(dǎo)致一群細(xì)胞發(fā)生死亡的方法，該方法包括使細(xì)胞群中的部分細(xì)胞
與含有一定量的非致病性病毒的組合物接觸以有效地導(dǎo)致該細(xì)胞群發(fā)生細(xì)胞死亡。 本發(fā)明提供了治療疾病患者疾病的方法，該方法包括滅活非致病性病毒，其中非
致病性病毒通過(guò)加入濃度約為5-10ii g/ml的三甲基補(bǔ)骨脂素(trioxalen)并在約365nm
和6W的紫外線下照射15分鐘加以滅活，將滅活的非致病性病毒制備成藥物組合物；以及將
藥物組合物給予患者。 本發(fā)明還提供了預(yù)測(cè)一種化合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性的方法，該方法包括使化合 物與腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞接觸；以及測(cè)定腫瘤細(xì)胞的死亡率。能引起被接觸腫瘤細(xì) 胞死亡的化合物被認(rèn)為是具有體內(nèi)活性的化合物。 另外，本發(fā)明提供了阻止個(gè)體產(chǎn)生腫瘤的方法，該方法包括將一定量的含有非致 病性病毒的組合物給予個(gè)體以有效地防止個(gè)體發(fā)生腫瘤。 另外，本發(fā)明提供了包含非致病性病毒和外周血單核細(xì)胞(PBMC)的組合物。
本發(fā)明還提供了包含非致病性病毒的組合物，其中的非致病性病毒至少通過(guò)兩種 不同的方法滅活。 本發(fā)明還提供了包含非致病性病毒和至少一種PBMC的組合物，其中的非致病性 病毒用選自如下一組的兩種或兩種以上的方法滅活基因滅活、化學(xué)滅活、光化學(xué)滅活、紫 外線滅活、熱滅活或放射線滅活。 本發(fā)明提供了制備包含非致病性病毒的抗腫瘤或抗感染性疾病組合物的過(guò)程。該 過(guò)程包括將病毒暴露于第一滅活劑以有效地滅活活性病毒，將病毒暴露于第二滅活劑以有 效地滅活活性病毒，將病毒與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合，以及用體外 試驗(yàn)證明病毒是無(wú)活性的。 本發(fā)明還提供了包含一種非致病性的滅活病毒和至少一種抗原以及至少一種佐 劑的藥物組合物，其中的抗原與非致病性的滅活病毒明顯不同。 另外，本發(fā)明還提供了包含佐劑組合物的免疫剌激組合物。佐劑組合物含有非致 病性的滅活病毒和至少一種抗原。該抗原與佐劑組合物不同，另外，免疫剌激組合物還能夠 提高機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。 本文所描述的方法涉及人體的治療，但是這些方法也可用于治療需要治療的任何 哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，可用本發(fā)明的方法治療或預(yù)防的腫瘤和非腫瘤性疾病包括 而不限于肺、乳腺和皮膚的腫瘤和非腫瘤性疾病。在某些實(shí)施方式中，感染性疾病也可被治 療或預(yù)防，其中包括病毒感染。 本發(fā)明還提供了可用于本文所描述的抗癌方法中的非致病性病毒，這些非致病性 病毒包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、病毒樣顆粒、病毒包含體或病毒成分。在某些實(shí)施方式中，病毒成分包括肽、蛋白、核酸、脂質(zhì)、糖及其混合物。在某些實(shí)施方式中，病毒 成分是gpl6。 在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是昆蟲特異性病毒。在某些實(shí)施方式中，昆蟲特 異性病毒是桿狀病毒科的病毒。例如，本發(fā)明的非致病性病毒包括核型多角體病毒或顆粒 體病毒。在某些實(shí)施方式中，非致病性的病毒是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒。
在某些實(shí)施方式中，為了治療腫瘤將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐 劑通過(guò)瘤內(nèi)注射和/或瘤旁注射給予哺乳動(dòng)物受試者。在某些實(shí)施方式中，為了治療非腫 瘤性增生性疾病將非致病性病毒以及選擇添加的抗原和/或佐劑通過(guò)病變部位內(nèi)注射和/ 或病變部位旁注射給予哺乳動(dòng)物受試者。治療方案可以是多次注射非致病性病毒，還可以 選擇添加其他抗癌治療措施。


圖1是一個(gè)線形圖，描述的是表達(dá)CCL21的桿狀病毒可在3LL肺癌鼠模型內(nèi)抑制 腫瘤的生長(zhǎng)以及誘導(dǎo)腫瘤的完全緩解。如實(shí)施例2所描述，CCL21給藥方案包括以所示的 濃度在瘤內(nèi)注射6次。隨著注射劑量的增加腫瘤被抑制的程度及完全有效發(fā)生的幾率也增 加。24天時(shí)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子變異數(shù)分析(One way ANOVAanalysis)。白蛋白組與治療 組相比P < 0. 001 ;25 ii g mCCL21組與6 ii g/Alb mCCL21組相比P < 0. 01 ;25 ii g mCCL21 組與25iig rhCCL21組相比P > 0. 05。 mCCL21，鼠CCL21 ;rhCCL21，重組人CCL21 ;B Gold， 桿狀病毒表達(dá)的重組鼠CCL21，作為參考點(diǎn)("GoldStandard") ;Alb，白蛋白；qd，每天(每 日給藥)；CR，完全有效。 圖2是一個(gè)線形圖，描述的是注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒后4T1乳腺癌鼠模型中 腫瘤生長(zhǎng)的抑制，如實(shí)施例3所描述。rhCCL21，重組人CCL21 ;qd，每天(每日給藥)。
圖3是一個(gè)柱形圖，描述的是注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒后自發(fā)性4T1肺癌轉(zhuǎn)移 的抑制，如實(shí)施例6所描述。實(shí)心柱，未進(jìn)行腫瘤手術(shù)切除的動(dòng)物；陰影線柱，最末一次注射 CCL21后1天進(jìn)行腫瘤手術(shù)切除的動(dòng)物。 圖4是一個(gè)線形圖，描述的是給予表達(dá)CCL21的桿狀病毒可以使動(dòng)物對(duì)再次接種 的腫瘤耐受，如實(shí)施例5所描述。簡(jiǎn)言之，在Balb/c小鼠體內(nèi)建立4T1腫瘤，其中一部分小 鼠通過(guò)在瘤內(nèi)注射表達(dá)CCL21的桿狀病毒進(jìn)行治療。最后一次注射CCL21后1天，通過(guò)手 術(shù)切除腫瘤。切除腫瘤后1天，在原腫瘤部位的對(duì)側(cè)皮下注射4T1細(xì)胞給小鼠再次接種腫 瘤?？瞻资笫侵肝催M(jìn)行腫瘤接種也未進(jìn)行CCL21處理的小鼠；Alb+Surg+Re-chlg，先接種 T41腫瘤再進(jìn)行白蛋白處理的小鼠；hCCL21+Surg+Re-chlg，先接種T41腫瘤再進(jìn)行CCL21 處理的小鼠。在Alb+Surg+Re-chlg組中，10只小鼠中有1只對(duì)腫瘤具有完全的抵抗力。在 hCCL21+Surg+Re-chlg組，10只小鼠中有6只對(duì)腫瘤具有完全的抵抗力。
圖5A-5B說(shuō)明了桿狀病毒誘導(dǎo)的對(duì)再接種腫瘤的抵抗力。在3LL腫瘤模型中，用 表達(dá)CCL21的桿狀病毒成功處理的動(dòng)物對(duì)同種腫瘤的再次接種具有抵抗力，生存期延長(zhǎng)。 圖5A總結(jié)了一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中，用表達(dá)鼠重組CCL21的桿狀病毒處理后動(dòng)物體 內(nèi)的腫瘤完全緩解(見(jiàn)圖1)，在最后一次給予表達(dá)CCL21的桿狀病毒后60、70和80天在原 腫瘤位置的對(duì)側(cè)給小鼠再次接種同種腫瘤。在至少70天內(nèi)動(dòng)物對(duì)再次接種的腫瘤具有抵 抗力。圖5B總結(jié)了另一個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，在該試驗(yàn)中，用表達(dá)CCL21的桿狀病毒處理誘導(dǎo)腫瘤完全緩解(〃 腫瘤加強(qiáng)〃 )后30天給動(dòng)物接種腫瘤，然后在最后一次給予表達(dá)CCL21的 桿狀病毒后80、120、160和200天在原腫瘤位置的對(duì)側(cè)給小鼠再次接種同種腫瘤。這些結(jié) 果表明利用腫瘤加強(qiáng)可使動(dòng)物在至少200天內(nèi)對(duì)再次接種的腫瘤具有抵抗力。
圖6是一個(gè)線形圖，描述的是酵母或大腸桿菌產(chǎn)生的CCL21在3LL肺癌模型中不 能誘導(dǎo)腫瘤緩解。hCCL21-B(HBPGl)，桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21， lot甜B(yǎng)PGl ;hCCL21-B 1/2 (HBPG1)，桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21， lot甜B(yǎng)PGl，稀釋到hCCL21 (HBPG1)濃度的一 半；hCCL21-B conc. (HBPG1)，來(lái)源于濃縮溶液(10mg/ml)的桿狀病毒表達(dá)的重組人CCL21， lot甜B(yǎng)PGl ;hCCL21-Y(HYPG4)，酵母表達(dá)的重組人CCL21， 1ot甜YPG4 ;hCCL21-E (HEDS4)，大 腸桿菌表達(dá)的重組人CCL21， 1ot甜EDS4;qd，每天(每日給藥)。用白蛋白處理的小鼠與 用hCCL21-B或hCCL21-B new處理的小鼠相比，其腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，P < 0. 01 ;與用 hCCL21-B conc或hCCL21_Bl/2處理的小鼠相比，其腫瘤的生長(zhǎng)也受到抑制，P < 0. 05。
圖7是一個(gè)線形圖，描述的是在體內(nèi)無(wú)活性的桿狀病毒表達(dá)的CCL21制劑在體外 的趨化活性。趨化活性的分析基本按照PCT國(guó)際專利文獻(xiàn)WO 00/38706描述的方法進(jìn)行。 體內(nèi)活性的評(píng)價(jià)描述于實(shí)施例2-6。 HBDS2.p，桿狀病毒來(lái)源的重組人CCL21， 1ot甜B(yǎng)DS2. p ;MBDS2. c，桿狀病毒來(lái)源的重組鼠CCL21 ， lot#MBDS2. c ;HBPG1 ，桿狀病毒來(lái)源的重組 人CCL21， lot甜B(yǎng)PGl ;HBPG1+HBDS2. vp，用乙烯妣啶處理的等比例的HBPG1和HBDS2混合 物；HYPG4，酵母來(lái)源的重組人CCL21， 1ot甜YPG4 ;HEDS4，大腸桿菌來(lái)源的重組人CCL21， 1ot甜EDS4。 圖8描述的是一個(gè)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)結(jié)果，其中所示的樣品與抗gp64抗體雜交。條 帶l，純化的桿狀病毒；條帶2，未感染的Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶3，感染野生 型桿狀病毒的Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶4，感染表達(dá)重組人CCL21的BV422的 Tn5細(xì)胞培養(yǎng)物的條件培養(yǎng)基；條帶5，未感染的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶6，感染野生型桿狀病毒 的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶7，感染BV422的Tn5細(xì)胞團(tuán)；條帶8，桿狀病毒來(lái)源的人重組CCL2， lot甜B(yǎng)PGl過(guò)濾液，去掉> 50kDa(5iig蛋白質(zhì))的雜蛋白；條帶9，含有> 50kDa(5yg蛋 白質(zhì))雜蛋白的條帶8的樣品過(guò)濾液殘留物；條帶IO，含有雜蛋白(10i!g蛋白質(zhì))的條帶 8的樣品過(guò)濾液殘留物；條帶11，5ii g未過(guò)濾的桿狀病毒來(lái)源的重組人CCL21， lot甜B(yǎng)PGl ; 條帶12，5ii g未過(guò)濾的桿狀病毒來(lái)源的重組人CCL21， 1ot甜B(yǎng)DS4 ;條帶13，5yg未過(guò)濾的 桿狀病毒來(lái)源的重組人CCL21， lot甜B(yǎng)MCl ;條帶14，5iig未過(guò)濾的桿狀病毒來(lái)源的重組人 CCL21， lot鵬DSl。 圖9是一個(gè)線形圖，描述的是經(jīng)過(guò)過(guò)濾去掉高分子雜蛋白后的桿狀病毒表達(dá)的 CLL21的抗腫瘤活性。純化的桿狀病毒是CCL21制備物的污染物(圖8)，與桿狀病毒表達(dá) 的CCL21制備物具有一樣的腫瘤抑制活性。 圖10A是一個(gè)線形圖，描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的組合物接觸后PBMC介 導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，如實(shí)施例8所描述。細(xì)胞團(tuán)所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)比細(xì)胞上清液所 誘導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)要高很多。感染表達(dá)CCL21的桿狀病毒或?qū)φ諚U狀病毒BV762的細(xì)胞都 表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒活性。GAM，未用細(xì)胞培養(yǎng)物調(diào)整的生長(zhǎng)分析培養(yǎng)基(對(duì)照)；BV422， 表達(dá)CCL21的桿狀病毒；V762，表達(dá)Raf的桿狀病毒。 圖IOB是一個(gè)線形圖，描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的經(jīng)O. 2ym濾膜過(guò)濾的 組合物接觸后PBMC介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性，如實(shí)施例8所描述。通過(guò)過(guò)濾去掉高分子物
8質(zhì)可使細(xì)胞毒活性顯著下降。細(xì)胞團(tuán)樣品顯示出殘留的低度到中度的細(xì)胞毒活性。
圖11A是一個(gè)柱形圖，描述的是樹(shù)突細(xì)胞經(jīng)所示的剌激后CD86和MHC II表達(dá)的 變化。實(shí)施例9描述了鼠骨髓衍生的樹(shù)突細(xì)胞的制備方法和分析方法。表達(dá)HIV gag蛋白 (VLP)的痘苗病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。與VLP—樣，活的桿狀病毒可誘導(dǎo)CD86和MHC II的表 達(dá)，這兩個(gè)分子是DC成熟的標(biāo)志。黑色柱，CD86的表達(dá)；灰色柱，MHC II的表達(dá)。
圖11B是一個(gè)柱形圖，描述的是樹(shù)突細(xì)胞經(jīng)所示的剌激后CD86和MHC II表達(dá)的 變化。實(shí)施例9描述了人單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突細(xì)胞的制備方法和分析方法。表達(dá)HIV gag 蛋白(p55VLP)的痘苗病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。與p55VLP—樣，活的桿狀病毒可誘導(dǎo)DC的成熟。 黑色柱，CD86的表達(dá)；灰色柱，HLA-DR的表達(dá)。 圖12描述的是鉻釋放試驗(yàn)的結(jié)果，試驗(yàn)方法見(jiàn)實(shí)施例10的描述。表達(dá)HIV gag 蛋白(VLP)的痘苗病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。與VLP—樣，活的桿狀病毒可作為一種高效的佐劑 誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞的殺傷活性。 圖13描述的是當(dāng)腫瘤細(xì)胞在體外與所示的組合物接觸后PBMC介導(dǎo)的對(duì)腫瘤細(xì)胞 的毒性，如實(shí)施例8所描述。 圖14描述的是PBMC細(xì)胞毒活性與體內(nèi)抗腫瘤活性的關(guān)系。 圖15描述的是用抗gp64單克隆抗體阻斷桿狀病毒的腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)。見(jiàn)實(shí)施 例13。 圖16描述的是滅活桿狀病毒在體外誘導(dǎo)的PBMC介 導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用。見(jiàn)實(shí) 施例14。 圖17表明腫瘤細(xì)胞是桿狀病毒的主要靶位。見(jiàn)實(shí)施例15。 圖18描述的是桿狀病毒在肺癌動(dòng)物模型中的腫瘤生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。見(jiàn)實(shí)施例16。
圖19描述的是桿狀病毒在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)的對(duì)致病性病毒感染的保護(hù)作用。細(xì) 胞在體外和體內(nèi)用水泡性口炎病毒(VSV)感染。見(jiàn)實(shí)施例17。 圖20描述的是旁觀者效應(yīng)。當(dāng)腫瘤細(xì)胞群中20%的細(xì)胞與桿狀病毒接觸后就可 以達(dá)到最大殺傷效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
Al.非致病性病毒的抗腫瘤活性 治療腫瘤的免疫學(xué)方法包括以趨化因子作為治療性藥物。趨化因子是一族同源 性蛋白質(zhì)，其功能包括(a)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的遷移和活化；(2)調(diào)節(jié)血管生成；(C)以及維
持免疫平衡和次級(jí)淋巴器官的結(jié)構(gòu)。見(jiàn)Baggiolini等，(1997)An皿Rev Immunol 15: 675-705 ;J皿g&Littman (1999) Curr 0pin Immunol 11 :319-25 ;以及Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2 :175-84。 如實(shí)施例1-6所描述，在研究利用次級(jí)淋巴組織趨化因子(本文稱為"CCL21";本 領(lǐng)域中也被稱為SLC、 Exodus-2和6C-kine)進(jìn)行腫瘤的免疫治療的過(guò)程中，本發(fā)明的發(fā)明 者驚奇地發(fā)現(xiàn)非致病性的病毒是具有高活性的抗腫瘤因子。見(jiàn)實(shí)施例7。
因此，本發(fā)明提供了方法以治療需進(jìn)行抗癌治療的患者，其中包括通過(guò)給予患者 非致病性的病毒以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移以及誘導(dǎo)對(duì)腫瘤抵抗力。值得注意的 是，本文所描述的腫瘤治療方案不需要鑒別出腫瘤特異性的抗原。因此，非致病性病毒的應(yīng)用范圍很寬，對(duì)多種類型的腫瘤都有療效。見(jiàn)實(shí)施例2-6。 雖然發(fā)明者不希望固定于特定的操作模式，但是發(fā)明者認(rèn)為非致病性病毒的抗癌 活性應(yīng)該歸功于，至少部分歸功于其免疫剌激活性。例如，桿狀病毒在體外和體內(nèi)都可誘 導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞的成熟和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。見(jiàn)實(shí)施例9-10。另外參見(jiàn)Gronowski等， (1999)J Virol. 73 :9944-51。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"病毒"用于描述一種有效的抗腫瘤組合物，包括活病毒、滅活病 毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。 病毒體和病毒樣顆粒(VLPs)通常包含非致病性病毒的一種或多種蛋白質(zhì)，還 可以選擇添加磷脂。在某些實(shí)施方式中，病毒體和VLPs是非復(fù)制型的，不含有任何的天 然病毒基因組。病毒蛋白可以是通過(guò)重組方法制備的，也可以是從完整病毒中分離的。 VLPs在下面的文獻(xiàn)中還有進(jìn)一步描述WO 03/024480， WO 03/024481， Niikura等，(嵌 合重組戊型肝炎病毒樣顆粒作為提呈外源表位的口服疫苗載體"ChimericRecombinant Hepatitis E Virus—Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle PresentingForeign Epitopes", Virology (2002) 293 :273-280) ;Lenz等，(乳頭狀瘤病毒樣顆粒誘導(dǎo)樹(shù) 突細(xì)胞的急性活化"Papilloma rivurs_Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells，，， Journal of Immunology (2001) 5246-5355) ;Pinto等，(人乳 頭狀瘤病毒(HPV)-16 LI誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，用重組HPV-16L1病毒樣顆粒免疫 健康志愿者"Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus(HPV)-16L1 HealthyVolunteers Immunized with Recombinant HPV-16L1 Virus-Like Particles，，， Journal oflnfectious Diseases (2003) 188 :327-338);以及Gerber等，(人乳頭狀瘤病毒 樣顆粒與大腸桿菌熱穩(wěn)定性的外毒素突變體R192G或CpG聯(lián)合使用時(shí)是一種有效的口服免 疫原"Human Papillomavirus Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens whenCoadministered with Escherichia coli Heat—Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG"， Journal of Virology (2001) 75 (10) :4752-4760)。病毒體在下面的文獻(xiàn)中有 進(jìn)一步的描述Gluck等，(未來(lái)開(kāi)發(fā)疫苗的新技術(shù)平臺(tái)"New Technology Platforms in theDevelopment of Vaccines for the Future", Vaccine(2002) 20 :B10_B16)。
術(shù)語(yǔ)"活病毒"是指感染性與天然病毒相似或一樣的病毒?；畈《居绕淇梢愿腥?其天然的宿主細(xì)胞。 術(shù)語(yǔ)"滅活病毒"是指在天然宿主細(xì)胞內(nèi)無(wú)法復(fù)制的病毒，下文有進(jìn)一步的描述。 例如，非致病性的病毒在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)不能復(fù)制，同樣被滅活后在其天然宿主細(xì)胞 內(nèi)也無(wú)法復(fù)制。使用滅活病毒可降低人們對(duì)使用活病毒安全性的擔(dān)心。"滅活劑"是指用于 滅活病毒的試劑。 術(shù)語(yǔ)"病毒顆粒"是指天然形式經(jīng)改造或修飾后的病毒，因而在天然宿主細(xì)胞內(nèi) 無(wú)復(fù)制能力。制備病毒顆粒的方法是本領(lǐng)域所熟知的?？赏ㄟ^(guò)電鏡、免疫原性分析和標(biāo)準(zhǔn) 噬菌斑形成試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)病毒樣顆粒的結(jié)構(gòu)完整性和功能完整性。例如，Hamakubo等，W0 02/06305描述了去核桿狀病毒樣顆粒的制備方法。 美國(guó)專利No. 5， 750， 383描述了利用標(biāo)記獲救系統(tǒng)制備桿狀病毒顆粒的方法。該 方法利用了遺傳修飾的桿狀病毒，這種病毒缺乏病毒復(fù)制所必需的基因(如gP64)，只能在 能彌補(bǔ)其遺傳缺陷的細(xì)胞內(nèi)繁殖。
術(shù)語(yǔ)'病毒包含體"是指包含多個(gè)包被在病毒編碼蛋白晶體內(nèi)的病毒顆粒的結(jié)構(gòu)。 蛋白晶體一旦裂解，多個(gè)病毒顆粒就會(huì)釋放出來(lái)，每個(gè)病毒顆粒隨后都可以感染宿主細(xì)胞。
病毒，特別是桿狀病毒可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備。在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)克隆細(xì) 胞系，接種病毒后在適于病毒復(fù)制的條件下孵育足夠的時(shí)間。培養(yǎng)條件如細(xì)胞密度、感染復(fù) 數(shù)、時(shí)間、溫度、培養(yǎng)基等都不是關(guān)鍵的因素，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地確定選用何 種條件。 制備桿狀病毒的典型方法見(jiàn)實(shí)施例1的描述，該方法利用了草地夜蛾(Sf)細(xì)胞。 其他有代表性的宿主細(xì)胞及擴(kuò)增方法見(jiàn)美國(guó)專利Nos. 5， 405， 770 (Heliothis subf lexa細(xì) 胞系)和6，379，958(草地夜蛾細(xì)胞系，該細(xì)胞系可提高桿狀病毒的產(chǎn)量)的描述。
經(jīng)過(guò)孵育以后，產(chǎn)生出的病毒用本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)回收，其中包括聚乙二醇(PEG) 沉淀、超速離心以及色譜純化，例如利用離子交換樹(shù)脂、排阻層析、親和層析或結(jié)合使用。見(jiàn) 美國(guó)專利申請(qǐng)No. 2002/0015945 (色譜純化);美國(guó)專利No. 6， 194， 192(病毒吸附到含硫酸 巖藻糖的多糖上)。 術(shù)語(yǔ)"病毒成分"用于本文中是指非致病性病毒來(lái)源的保留了其親本活病毒的抗 腫瘤和/或抗感染性疾病活性的分子。在某些實(shí)施方式中，病毒成分抗腫瘤活性的大小及 特異性與其親本活病毒一樣。術(shù)語(yǔ)"病毒成分"包括病毒的任何成分，如蛋白、肽、核酸、脂 質(zhì)、糖及其他生物活性分子及其混合物。在某些實(shí)施方式中，病毒成分是gp64。
例如，病毒成分可以是病毒外殼蛋白或病毒核蛋白核心的DNA相關(guān)蛋白。典 型的桿狀病毒外殼蛋白見(jiàn)如下文獻(xiàn)的描述Pearson等，(1988)Virology 167:407-13; Summers&Smith(1978)Virology 84 :390-402 ;Thiem&Miller(1989)J Virol 63:2008-18 以及Vialard&Richardson(1993) J Virol 67:5859-66。典型的桿狀病毒DNA相關(guān)蛋白 見(jiàn)Tweeten等(1980)J Virol 33 :866-876 ;Wilson等(1987)J Virol 61 :661-6以及 Rohrmann(1992) J Gen Virol73(Pt 4) :749-61的描述。 病毒成分還可以是存在于病毒包含體內(nèi)的蛋白和多糖，其中包括成熟包含體的包 含體基質(zhì)以及花萼外層。典型的桿狀病毒包含體蛋白包括多角體和花萼。
本文說(shuō)明非致病性病毒具有很高的抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性，本領(lǐng)域 的技術(shù)人員在閱讀本說(shuō)明書后可以很容易地鑒定、純化或者制備和使用具有親本活病毒抗 腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性的病毒成分。例如，美國(guó)專利No. 6， 001， 806描述了一種 生物化學(xué)方法，該方法首先裂解桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞并分離其中的不同組分，然后利 用其中的洗脫組分鑒定可被親本活病毒識(shí)別的具有抗病毒活性的糖蛋白。
另外，利用本領(lǐng)域熟知的重組方法可以很容易地制備病毒蛋白和核酸，并且同樣 可以檢測(cè)其抗腫瘤活性和/或抗感染性疾病活性。例如，病毒核酸可被克隆、合成、改變、 突變等。用于分離核酸的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)在下列參考書中有描述Sambrook 等(編)(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning :A LaboratoryMa皿al) ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ;Silhavy等，(1984) 基因瞎蟲合試驗(yàn)技術(shù)(Experiments with Gene Fusions), Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ;Glover&Hames (1995)DNA克隆t喿作方f去(DNA Cloning :A Practical Approach)，第二片反，IRL Press at Oxford UniversityPress， Oxford/New York ;以及Ausubel (編)(1995)分子生物學(xué)簡(jiǎn)明手冊(cè)(ShortProtocols inMolecular Biology)，第三版，Wiley， New York。重組制備的多肽也可以用本領(lǐng)域技術(shù) 人員所熟知的多種標(biāo)準(zhǔn)方法純化和鑒定，見(jiàn)Schr6der&LUbke(1965)肽(The P印tides)， Academic Press, New York :Schneider&Eberle (1993)肽1992 :第22界歐洲多肽論壇論文 皇(P印tides， 1992-Proceedings of the Twenty-SecondEuropean Prptide Symposium), 9月13-19日，1992， Interlaken， Switzerland. Escom， Leiden ;Bodanszky (1993)肽合成原 i(Principles of Peptide Synthesis)，第二片反，Springer-Verlag，Berlin,New York;以 及Ausubel(編)(1995)分子牛物學(xué)簡(jiǎn)明手冊(cè)(Short Protocois in Molecular Biology), 第三片反，Wiley， New York。 特別是AcNPV完整序列已經(jīng)清楚(Kool和Vlak， 1993)，因此利用已知的方法可以
很容易地系統(tǒng)分析所有的AcNPV蛋白，包括重組表達(dá)和抗腫瘤活性的檢測(cè)。 為了更容易地鑒定具有活性的病毒成分，本發(fā)明還提供了一種體外分析方法用于
篩選候選病毒成分。見(jiàn)實(shí)施例8。該分析方法包括用外周血單核細(xì)胞(PBMC)誘導(dǎo)細(xì)胞毒活
性。如本文所描述，非致病性病毒可誘導(dǎo)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，這種活性與其在
體內(nèi)所觀察到的抗腫瘤活性是相關(guān)的。候選病毒成分包括非致病性病毒的生化組分、純化
的或重組的病毒蛋白、純化的或合成的核酸、病毒體、病毒樣顆粒等。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"非致病性的"用于描述病毒，是指該病毒不能感染其哺乳動(dòng)物宿
主，在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒不能感染任何哺乳動(dòng)物宿主。在某些實(shí)施方式中，非
致病性病毒對(duì)人沒(méi)有感染性。為了便于描述，除非特別說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"非致病性的"病毒包括
滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒體、病毒樣顆粒、病毒成分及其混合物。 術(shù)語(yǔ)"感染性"通常是指對(duì)宿主細(xì)胞或生物體有害的特性，例如通過(guò)基因的表達(dá)和
/或通過(guò)在宿主內(nèi)的復(fù)制對(duì)宿主細(xì)胞或生物體造成損傷。與此定義相一致的是，非致病性并
不排除可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，但是進(jìn)入以后對(duì)宿主細(xì)胞或生物體的健康沒(méi)有影響。然而
在某些實(shí)施方式中，非感染性的病毒不能進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。 非致病性病毒如桿狀病毒在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)是轉(zhuǎn)錄靜止的。因此，在某些實(shí) 施方式中，非致病性病毒是一類被目前的基因治療方法排除在外的病毒，因?yàn)槠鋽y帶的外 源基因也不表達(dá)。 非致病性病毒的例子包括而不限于昆蟲特異性病毒、兩棲動(dòng)物特異性病毒以 及植物特異性病毒?？捎糜诒疚乃枋龅姆椒ㄖ械牡湫筒《景U狀病毒家族的病 毒(例如核型多角體病毒(NPV)，其中包括苜蓿銀紋夜蛾NPV，以及顆粒體病毒(GV)，其 中包括草地夜蛾顆粒體病毒)，多分DNA病毒科的病毒(如姬蜂病毒(ichnoviruses)， 其中包括Campoletis sonorensis virus,以及繭蜂病毒(bracoviruses)，其中包括 CotesiaMelanoscela virus)，囊泡病毒，四病毒科和羅達(dá)病毒科(如野田村病毒，其中包括 日本庫(kù)蚊病毒和禽獸棚病毒(Flock House Virus))?？捎糜诒景l(fā)明的許多非致病性病毒 在昆蟲中都可以找到。見(jiàn)Fields等編，(1996)， Virology, Lippincott-Rave Publishers, Philadelphia, Pe皿sylvMiia。 術(shù)語(yǔ)"感染性疾病"是指對(duì)其宿主有害的因子(如病毒、真菌或細(xì)菌)。在某些實(shí) 施方式中是指對(duì)人有害的因子。"抗感染性疾病"的措施是指可預(yù)防、改善或根除感染性疾 病和/或其致病因子的治療措施。 感染性疾病的例子包括而不限于HIV、西尼羅河病毒、甲型、乙型、丙型肝炎、天花、
12結(jié)核、水泡性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞體病毒(RSV)、人乳頭狀瘤病毒(HPV)、 SARS、流 感、埃博拉病毒、病毒性腦膜炎、皰疹、炭疽、萊姆病以及大腸桿菌等。 在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是桿狀病毒。如下面實(shí)施例所描述的，本發(fā)明證 明桿狀病毒是一種高活性的腫瘤生長(zhǎng)抑制因子，可促進(jìn)腫瘤的完全緩解。本發(fā)明還證明桿 狀病毒可用于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，提高動(dòng)物對(duì)再次接種腫瘤的抵抗力，如實(shí)施例5-6的描述。
如本文所述，術(shù)語(yǔ)"腫瘤再次接種"是指癌或腫瘤已被治療或切除的動(dòng)物再次接種 新的腫瘤。與本文上面所提供的定義相一致的是，術(shù)語(yǔ)"桿狀病毒"包括桿狀病毒顆粒和桿 狀病毒成分。 桿狀病毒的宿主特異性已得到徹底研究。雖然已知桿狀病毒可感染30多種鱗翅 類昆蟲，但是它不能感染已經(jīng)研究過(guò)的其他昆蟲細(xì)胞和超過(guò)35種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。見(jiàn)Tjia 等，(1983)Virology 125 :107-17 ;Volkman&Goldsmith(1983)Appl EnvironMicrobiol 45:1085-1093;以及Mdntosh&Shamy (1980) Intervirology 13:331-41。 但是，桿狀 病毒確實(shí)可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，在宿主細(xì)胞核內(nèi)也可以檢測(cè)到病毒DNA。見(jiàn)Groner 等，(1984) Intervirology 21 :203-9 ;Tjia等，(1983) Virology 125:107-17; 以及 Volkman&GoldsmithQ983)Appl Environ Microbiol 45:1085-93。 術(shù)語(yǔ)"非致病性的"病毒還可以指天然形式是具有致病性的但是經(jīng)修飾后是非致 病性的病毒。這種修飾包括基因修飾(如打斷病毒復(fù)制所必需的基因，如本文所描述的桿 狀病毒基因gp64 ;和/或打斷病毒啟動(dòng)子使其在宿主內(nèi)無(wú)轉(zhuǎn)錄活性)。例如，桿狀病毒物 種特異性的致病性部分是由于桿狀病毒啟動(dòng)子在鱗翅類昆蟲以外的物種內(nèi)保持靜默。當(dāng) 異源啟動(dòng)子插入到桿狀病毒基因組時(shí)，被修飾的病毒就可以在非鱗翅類昆蟲細(xì)胞系內(nèi)啟動(dòng) 基因的表達(dá)，其中包括各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。見(jiàn)Boyce&Bucher(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93 :2348-52 ;Carbonell等，(1985)J Virol 56 :153-60 ;Carbonell&Miller(1987) Appl Environ Microbiol 53 :1412-7 ;以及Hofma皿等，Q995)Proc Natl Acad Sci USA 92 :10099-103。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)原本有活性的病毒啟動(dòng)子同樣也可以被修飾成無(wú)活性的 啟動(dòng)子，這樣病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)就是非致病性的。制備堿基對(duì)改變、缺失或小片段插入 的位點(diǎn)特異性突變方法也是本領(lǐng)域所熟知的，例如本文上面所提到的參考文獻(xiàn)所描述的方 法。 確定經(jīng)修飾的病毒和未經(jīng)修飾的病毒是否是非致病性的可以通過(guò)本領(lǐng)域所熟知
的確定病毒感染性和復(fù)制能力的方法很容易地加以分析。典型的方法見(jiàn)Tjia等，(1983)
Virology 125 :107-17 ;Volkman&Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 45:1085-93;
Mdntosh&Shamy (1980) Intervirology 13 :331-41 ;以及美國(guó)專利No. 6， 248， 514等的描述。 本發(fā)明還提供了具有抗癌活性和/或抗感染性疾病活性和/或佐劑活性的非致病
性病毒，其中包括活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒體、VLPs、病毒包含體以及病毒成分。本
發(fā)明還提供了篩選可用于本文所描述的治療方法中的非致病性病毒的方法。 為了篩選具有抗癌活性的非致病性病毒，候選非致病性病毒用實(shí)施例8所描述的
體外或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞溶解試驗(yàn)和/或?qū)嵤├枋龅捏w內(nèi)抗癌活性試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)檢測(cè)。在某
些實(shí)施方式中，先用體外試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，然后在相關(guān)的動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)價(jià)那些具有體外
活性的病毒在體內(nèi)是否也具有抗癌活性。 為了篩選具有佐劑活性的非致病性病毒，需要檢測(cè)候選非致病性病毒增強(qiáng)抗原免疫原性的能力。免疫原性可通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)來(lái)確定。檢測(cè)T細(xì)胞反應(yīng)的經(jīng)典方 法包括體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)或體內(nèi)延遲型超敏試驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，CCL21聯(lián)合非致病 性病毒可在體外誘導(dǎo)PBMC對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，這種活性與其在體內(nèi)的抗腫瘤活性 相關(guān)。另外也可以用其他抗原來(lái)代替CCL21。另外還可以通過(guò)檢測(cè)受試者血清中抗原特異 性的抗體和/或證明抗原特異性的抗血清或免疫細(xì)胞具有保護(hù)作用來(lái)分析免疫原性。在某 些實(shí)施方式中，非致病性病毒可使抗原的免疫原性至少提高約2倍、約5倍、約10倍、約25 倍或約100倍。 在某些實(shí)施方式中，非致病性的病毒是被滅活的，如下文將要進(jìn)一步描述的。具有 抗癌活性的非致病性病毒可用各種滅活方法使其不再具有感染天然宿主細(xì)胞的能力。利用 本文所描述的試驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可選擇能保持病毒抗癌活性的滅活方法。在某些實(shí) 施方式中，滅活方法可以保持病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力但是病毒基因組卻失去了轉(zhuǎn)錄和/或復(fù) 制能力。在某些實(shí)施方式中，對(duì)病毒進(jìn)行基因修飾使其能進(jìn)入細(xì)胞但是不能進(jìn)行正常的轉(zhuǎn) 錄和/或復(fù)制。 A2.非致病性病毒的抗感染性疾病活性 目前所用的治療感染性疾病的方法包括使用一些能引起副作用的藥物。另外，許 多有效的治療措施包括疫苗只對(duì)單一的感染因子或其密切相關(guān)的因子具有特異性。本發(fā)明 的發(fā)明者驚奇地發(fā)現(xiàn)非致病性病毒也具有很高的抗感染性疾病的能力。見(jiàn)實(shí)施例17。
為了篩選具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒，利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知 的體外或體內(nèi)抗感染性疾病檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)候選非致病性病毒。例如，對(duì)于結(jié)核來(lái)說(shuō)， 可用TB模型或體外巨噬細(xì)胞模型來(lái)檢測(cè)病毒的抗感染性疾病活性。Abe等，(Journalof Immunology, 2003， 171 :1133-1139)描述了適于檢測(cè)化合物抗感染性疾病活性的其他方 法。 在某些實(shí)施方式中，先用體外試驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，然后在相關(guān)的動(dòng)物模型內(nèi)評(píng)價(jià) 那些具有體外活性的病毒在體內(nèi)是否也具有抗感染性疾病活性。 因此，本發(fā)明還提供了通過(guò)給予患者非致病性病毒對(duì)需要進(jìn)行抗感染性疾病治療 的患者進(jìn)行治療的方法。值得注意的是，本文所描述的具有抗感染性疾病活性的非致病性 病毒并不依賴于感染因子特異性抗原的鑒定。而且非致病性病毒具有很寬的使用范圍。
雖然發(fā)明者不希望固定于特定的操作模式，但是發(fā)明者認(rèn)為非致病性病毒的抗感 染性疾病活性應(yīng)該歸功于，至少部分歸功于其免疫剌激活性。例如，桿狀病毒在體外和體內(nèi) 都可誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞的成熟和細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTL)反應(yīng)。見(jiàn)實(shí)施例9-10。
B.治療方面的應(yīng)用 本發(fā)明提供了通過(guò)給予受試者非致病性病毒以治療荷瘤哺乳動(dòng)物受試者的方法。 本文所描述的方法可用于抑制癌的生長(zhǎng)，包括癌的完全緩解，抑制癌的轉(zhuǎn)移以及提高受試 者對(duì)癌的抵抗力。 本發(fā)明提供了通過(guò)給予受試者非致病性病毒以治療患有一種或多種感染性疾病
的動(dòng)物的方法。本文所描述的方法可用于抑制病毒的復(fù)制、抑制真菌的生長(zhǎng)。 術(shù)語(yǔ)"癌的生長(zhǎng)"通常是指預(yù)示癌向更高階段發(fā)展的多個(gè)指數(shù)中的任意一個(gè)指數(shù)。
因此，用于評(píng)價(jià)癌生長(zhǎng)抑制效應(yīng)的指數(shù)包括而不限于存活癌細(xì)胞數(shù)量的減少、癌體積的縮
小或形態(tài)的改變(如通過(guò)CT、超聲或其他影像方法確定)、腫瘤生長(zhǎng)的延遲、腫瘤血管的破壞、遲發(fā)型超敏皮膚試驗(yàn)結(jié)果的改善、細(xì)胞毒T細(xì)胞活性的升高以及腫瘤特異性抗原表達(dá)水平的下降。 術(shù)語(yǔ)"腫瘤生長(zhǎng)的延遲"是指腫瘤生長(zhǎng)到特定大小所需要的時(shí)間減少。例如，治療可以延遲腫瘤體積增加到測(cè)量開(kāi)始時(shí)(第0天)體積的3倍所需要的時(shí)間或者腫瘤生長(zhǎng)到lcm3所需要的時(shí)間。 術(shù)語(yǔ)"對(duì)癌的抵抗力"是指受試者對(duì)癌生長(zhǎng)抵抗能力的提高，特別是已有癌的生長(zhǎng)。另外，術(shù)語(yǔ)"對(duì)癌的抵抗力"也指受試者體內(nèi)癌生長(zhǎng)易感性的降低。對(duì)癌的抵抗力與獲得性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)有關(guān)，如下文所描述。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"受試者"包括任何哺乳動(dòng)物種。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法優(yōu)選用于治療哺乳動(dòng)物的癌和/或感染性疾病，如人以及那些瀕臨滅絕的對(duì)人類具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值和/或社會(huì)價(jià)值的哺乳動(dòng)物。 術(shù)語(yǔ)"癌"通常是指腫瘤，包括原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤。在某些實(shí)施方式中，腫瘤是實(shí)體瘤。術(shù)語(yǔ)"腫瘤"包括實(shí)體瘤和任何組織的癌，其中包括而不限于乳腺癌；結(jié)腸癌遣腸癌；肺癌；鼻咽癌；喉癌；食管癌；胃癌；胰腺癌；肝癌；膽囊癌；膽管癌；小腸癌；泌尿道腫瘤包括腎癌、膀胱癌和尿路上皮癌；女性生殖道腫瘤包括宮頸癌、子宮癌、卵巢癌(如絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病)；男性生殖道腫瘤包括前列腺癌、精囊癌、睪丸和生殖細(xì)胞腫瘤；內(nèi)分泌腺腫瘤包括甲狀腺癌、腎上腺癌和腦下垂體癌；皮膚癌(如血管瘤和黑色素瘤)；骨癌或軟組織癌；血管癌(如卡波西肉瘤)；腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤、眼腫瘤和腦脊膜腫瘤(如星形細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、神經(jīng)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和腦膜瘤)。 術(shù)語(yǔ)"腫瘤"還包括造血系統(tǒng)惡性腫瘤來(lái)源的實(shí)體瘤，如白血病，其中包括綠色瘤、漿細(xì)胞瘤、血小板瘤和蕈樣肉芽腫病和皮膚T細(xì)胞淋巴瘤/白血病、多發(fā)性骨髓瘤以及淋巴瘤，其中包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌"還包括非腫瘤性的增生性疾病。因此，本發(fā)明的方法還可用于治療或預(yù)防增生、化生，或者更特殊的發(fā)育異常(對(duì)這些異常增生性疾病的綜述見(jiàn)Robbins&Ange11 (1976)基礎(chǔ)病理學(xué)(Basic Pathology)，第二版，68-79頁(yè)，W. B. SaundersCo. ， Philadelphia, Permsylrania)。 增生是一種受控形式的細(xì)胞增殖，其中包括組織或器官內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的增加，但是其結(jié)構(gòu)或功能沒(méi)有改變。作為一個(gè)非限定性的例子，子宮內(nèi)膜增生通常先發(fā)于子宮內(nèi)膜癌。化生是另一種受控形式的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中一種類型的成年細(xì)胞或完全分化的細(xì)胞被另一種類型的成年細(xì)胞所替代?；l(fā)生于上皮或結(jié)締組織。不典型的化生包含某些無(wú)序的化生上皮。發(fā)育異常通常是癌的前兆，主要見(jiàn)于上皮；它是一種最常見(jiàn)的無(wú)序形式的非腫瘤性細(xì)胞生長(zhǎng)，包括細(xì)胞一致性的喪失以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位的喪失。發(fā)育異常的細(xì)胞通常具有異常巨大而深染的細(xì)胞核，呈現(xiàn)多形性。發(fā)育異常通常見(jiàn)于慢性剌激或慢性炎癥時(shí)，常見(jiàn)于宮頸、呼吸道、口腔和膽囊。雖然癌前病變可以發(fā)展成惡性腫瘤，但是它可以穩(wěn)定相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，甚至在剌激因素消失后或損傷受到宿主免疫系統(tǒng)攻擊后可以復(fù)原。
因此，如本文所述給予受試者非致病性病毒可以激發(fā)固有的抗癌免疫應(yīng)答或癌特異性的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。術(shù)語(yǔ)"免疫系統(tǒng)"包括所有的細(xì)胞、組織、系統(tǒng)、結(jié)構(gòu)和過(guò)程，其中包括非特異性的部分和特異性的部分，可以提供一種防衛(wèi)機(jī)制來(lái)抵抗含抗原性分子的細(xì)胞，抗原性分子包括而不限于腫瘤、致病原以及自身反應(yīng)細(xì)胞。因此免疫應(yīng)答包括固有的免疫應(yīng)答、獲得性免疫應(yīng)答或者二者的結(jié)合。 術(shù)語(yǔ)"固有的免疫系統(tǒng)"包括吞噬細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、組織巨噬細(xì)胞、庫(kù)弗細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。固有的免疫系統(tǒng)可介導(dǎo)非特異性的免疫應(yīng)答。固有的免疫系統(tǒng)在起始和指導(dǎo)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的反應(yīng)中扮演重要角色。見(jiàn)Janeway (1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54 :1-13 ;Romagnani(1992)ImmunolToday 13 :379-381 ;Fea皿&Locksley (1996) Science 272:50-53;以及Fea皿(1997)Nature 388 :323-324。固有的反應(yīng)包括樹(shù)突細(xì)胞的成熟、巨噬細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子或趨化因子的分泌和/或NF k B信號(hào)通路的活化。 術(shù)語(yǔ)"適應(yīng)性免疫系統(tǒng)"是指對(duì)宿主體內(nèi)的特異性免疫具有影響的細(xì)胞和組織。這些細(xì)胞包括自然殺傷細(xì)胞(NK)和淋巴細(xì)胞(如B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)"適應(yīng)性免疫系統(tǒng)"還包括抗體產(chǎn)生細(xì)胞及其產(chǎn)生的抗體。 術(shù)語(yǔ)"適應(yīng)性免疫應(yīng)答"是指對(duì)抗原的特異性反應(yīng)，包括體液免疫應(yīng)答(如抗原特異性抗體的產(chǎn)生)和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答(如淋巴細(xì)胞的增殖)，如下文所定義的。適應(yīng)性免疫應(yīng)答還包括系統(tǒng)免疫和體液免疫。 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞介導(dǎo)的免疫"和"細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答"是指淋巴細(xì)胞提供的免疫防衛(wèi)機(jī)制，如T淋巴細(xì)胞接近其靶細(xì)胞時(shí)所產(chǎn)生的防衛(wèi)反應(yīng)。細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答還包括淋巴細(xì)胞的增殖。測(cè)定"淋巴細(xì)胞的增殖"就是測(cè)定淋巴細(xì)胞接觸特異性抗原后的增殖能力。淋巴細(xì)胞增殖是指B細(xì)胞、T輔助細(xì)胞或CTL的增殖。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"CTL反應(yīng)"是指抗原特異性細(xì)胞溶解和殺傷表達(dá)特異性抗原的細(xì)胞的能力。如本文所描述，本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)CTL分析方法可用于測(cè)定CTL的活性。
術(shù)語(yǔ)"系統(tǒng)免疫應(yīng)答"用于本文中是指淋巴結(jié)、脾或腸道相關(guān)淋巴組織內(nèi)的免疫應(yīng)答，其中免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，如B細(xì)胞被活化。例如，系統(tǒng)免疫應(yīng)答包括血清免疫球蛋白(IgGs)的產(chǎn)生。另外，系統(tǒng)免疫應(yīng)答是指血流中循環(huán)的抗原特異性的抗體以及系統(tǒng)免疫器官如脾和淋巴結(jié)中的抗原特異性的細(xì)胞。 術(shù)語(yǔ)"體液免疫"或"體液免疫應(yīng)答"是指獲得性免疫，其中經(jīng)抗原剌激后可分泌抗體分子。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"癌特異性的"是用于描述適應(yīng)性免疫應(yīng)答，是指受試者內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答，其中發(fā)生的反應(yīng)是受試者內(nèi)已有的癌特異性的。如果固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答所包含的免疫細(xì)胞類型是唯一的，那么就不要期望激發(fā)固有免疫應(yīng)答的方法也能激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。但是在某些實(shí)施方式中，給予非致病性病毒既可以激發(fā)固有免疫應(yīng)答，又可以激發(fā)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。 在某些實(shí)施方式中，本文所描述的利用非致病性病毒進(jìn)行治療的方法可以和其他一種或多種腫瘤治療方法一起使用。例如，在給予非致病性病毒之前或之后可以將腫瘤或異常增生的細(xì)胞手術(shù)切除。同樣，本發(fā)明的非致病性病毒也可以和其他的藥劑一同給藥或制成一種制劑，例如抗血管生成因子、化療藥和/或其他的免疫剌激因子?？膳c非致病性病毒聯(lián)合使用的典型藥劑包括而不限于甲氨蝶呤、他莫昔芬、nelandron、尼魯米特、阿霉素、5氟尿嘧啶(5FU)、細(xì)胞因子如干擾素a (IFN-a)、干擾素Y (IFN-Y )、白細(xì)胞介素2 (IL2)、白細(xì)胞介素4(IL4)、白細(xì)胞介素6(IL6)、以及腫瘤壞死因子(TNF)。感染性疾病還可以通過(guò)
16給予抗病毒藥物、抗生素或抗真菌藥物治療。 本發(fā)明還涉及用于在哺乳動(dòng)物受試者包括人體內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法和組合物。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及利用非致病性病毒誘導(dǎo)細(xì)胞毒T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明提供了制備含有非致病性病毒和抗原的抗原性制劑的方法。術(shù)語(yǔ)"抗原"是指能通過(guò)與T細(xì)胞或B細(xì)胞受試者相互作用而活化淋巴細(xì)胞(正性或負(fù)性)的物質(zhì)。正性活化可導(dǎo)致免疫應(yīng)答，負(fù)性活化導(dǎo)致免疫耐受。抗原可以是蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸或其混合物?？乖梢允钱愒纯乖?如在宿主體內(nèi)一般情況下不存在的抗原)或自身抗原(自體抗原)。 本發(fā)明還提供了使用本文所描述的抗原制劑作為治療性和/或預(yù)防性藥物的方法。例如，這種抗原制劑可給予哺乳動(dòng)物受試者以治療疾病，其中對(duì)于HIV感染或流感來(lái)說(shuō)CTL反應(yīng)是很重要；另外，這種抗原制劑還可用于治療或預(yù)防細(xì)菌感染、寄生蟲感染等。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在需要治療的個(gè)體體內(nèi)抑制腫瘤的一種或多種癥狀的方法。該方法包括給予個(gè)體一定量的包含非致病性病毒的組合物以有效地抑制癌癥的一種或多種癥狀。 癌癥癥狀是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括生理指標(biāo)和物理指標(biāo)。生理指標(biāo)包括
而不限于腫瘤的生長(zhǎng)、異常的細(xì)胞增生、腫瘤的轉(zhuǎn)移、血管生成、細(xì)胞死亡或細(xì)胞浸潤(rùn)。物理
指標(biāo)包括而不限于體重下降、出血、呼吸困難、骨折、免疫力下降或疲乏。 如本文所描述，給予受試者非致病性病毒還可以激發(fā)抗感染性疾病免疫應(yīng)答。如
上所述，所激發(fā)的免疫應(yīng)答包括固有免疫應(yīng)答、適應(yīng)性免疫應(yīng)答或者二者都存在。 本發(fā)明還提供了保護(hù)動(dòng)物不受感染性疾病影響的方法，該方法包括給予動(dòng)物有效
量的包含非致病性病毒的組合物。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是用任何方法或本文
所描述的方法滅活的。根據(jù)下面所描述的實(shí)施例可以看到給予無(wú)活性的非致病性病毒可產(chǎn)
生抗感染性因子(如病毒、真菌或細(xì)菌)的保護(hù)作用。非致病性病毒還可以和其他疫苗、抗
病毒藥物、抗真菌藥物、抗細(xì)菌藥物或其混合物一起使用。 C.治療性組合物和方法 本發(fā)明還提供了藥物組合物及其使用方法。本發(fā)明的非致病性病毒可制備成安全
有效的具有本文所描述的抗腫瘤和/或抗感染性疾病和/或佐劑活性的制劑。 本發(fā)明還提供了用于治療或預(yù)防感染性疾病和/或癌的組合物。在某些實(shí)施方式
中，組合物包含非致病性病毒和外周血單核細(xì)胞(PBMC)。在某些實(shí)施方式中，PBMC是從動(dòng)
物或人體內(nèi)分離出來(lái)的，在體外與非致病性病毒接觸，然后再以混合物或組合物的形式輸
入到動(dòng)物或人體內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，PBMC是從被治療動(dòng)物或人體外的其他動(dòng)物或人體
內(nèi)分離的，或者本發(fā)明的組合物被輸入到被治療動(dòng)物或人體內(nèi)。 在某些實(shí)施方式中，組合物包含非致病性病毒以及至少一種腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞可以是被治療個(gè)體或動(dòng)物自身的，也可以是同種異體的。 在某些實(shí)施方式中，組合物包含非致病性病毒、至少一種腫瘤細(xì)胞以及至少一種PBMC。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是無(wú)活性的病毒。
C. 1.病毒滅活 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法所用的非致病性活病毒可在給予受試者前被滅活。如上面所定義的，非致病性病毒在哺乳動(dòng)物宿主內(nèi)不能復(fù)制。滅活可使病毒在其天然宿主細(xì)胞內(nèi)失去復(fù)制能力，從而增加了其安全性。 病毒滅活可用任何適宜的方法完成，其中包括而不限于破壞病毒包被的脂質(zhì)或蛋白組分、對(duì)病毒進(jìn)行改造以使其無(wú)法識(shí)別靶細(xì)胞、破壞病毒的核酸和/或改造病毒使其失
去復(fù)制能力。典型的病毒滅活方法包括而不限于巴氏消毒法、用去污劑(如Triton-X10(f)處理、用二乙烯亞胺(BEI)進(jìn)行烷基化、光化學(xué)滅活、紫外線滅活、輻射滅活、物理裂解(如超聲、電子束)；基因滅活以及上述方法的聯(lián)合。見(jiàn)Rueda等，(2000)Vaccine 19:726_34和Henzler&Kaiser (1998) Nat Biotechnol 16:1077-9。在某些實(shí)施方式中，滅活并不能顯著降低病毒的抗原性和/或活性。病毒滅活以后可用標(biāo)準(zhǔn)的方法來(lái)確定其感染性。
"基因滅活"用于本文中是指對(duì)病毒的核酸(如基因)進(jìn)行改造。這種改造包括刪除一個(gè)或多個(gè)基因、突變至少一個(gè)基因；創(chuàng)造溫度敏感突變株、滅活基因等。溫度敏感突變株是指該突變株在某個(gè)溫度下是允許的，而在另一個(gè)溫度下是受限的(如抑制病毒的復(fù)制)。對(duì)于桿狀病毒來(lái)說(shuō)，制備溫度敏感突變株可用于使病毒在室溫(約25°C )下繁殖和制備，而進(jìn)入到具有更高內(nèi)部溫度的動(dòng)物體內(nèi)時(shí)病毒就變成了無(wú)活性的。在某些實(shí)施方式中，溫度敏感突變株在約16-28t:、約20-28t:、約25-28t:或27t:的范圍內(nèi)是允許的，而在約30-45 t:、約32-4(TC、約35-38。C、約37。C溫度下是受限的。在某些實(shí)施方式中，受限溫度是約28。C、約29。C、約30。C、約31。C、約32°C，、約33。C、約34。C、約35。C、約36。C或約37。C以上的任何溫度。在某些實(shí)施方式中，溫度敏感突變株在動(dòng)物或人體內(nèi)是無(wú)活性的。在某些實(shí)施方式中，當(dāng)病毒處于受限溫度時(shí)溫度敏感突變株與野生型病毒相比其活性降低約100%、約90% 、約80% 、約70% 、約60% 、約50% 、約40% 、約30% 、約20%或約10%。
穩(wěn)定敏感突變株可包含任何突變的基因，該基因的突變可使病毒在一種溫度下的活性比另一種溫度下的活性降低?？杀煌蛔兊幕蚧虻鞍装ǘ幌抻邙B苷?；D(zhuǎn)移酶、RNA三磷酸酶、ATP酶、蛋白激酶(如PK-1)等。下面的文獻(xiàn)中描述了一些溫度敏感突變株的例子Jin等，Journal of Virology, (1998)，巻72， pp. 10011-10019和McLachlin等，Virology, (1998)，巻246， pp. 379-391，本文都已納入作為參考。 如果病毒經(jīng)加熱處理后足以被滅活則巴氏消毒法是一種簡(jiǎn)單的滅活方法。在某些實(shí)施方式中，在保證可滅活病毒的情況下加熱的持續(xù)時(shí)間應(yīng)該盡量短以使對(duì)病毒蛋白的損傷降到最低。另外，可通過(guò)使用穩(wěn)定劑和檸檬酸鈉、蔗糖和/或甘氨酸使對(duì)病毒的損傷降到最低。 另外，化學(xué)滅活，如用溫和的胃蛋白酶在低pH條件下處理或者用去污劑處理，可用于破壞脂雙層，因此可用于滅活包膜病毒，其中包括桿狀病毒。見(jiàn)美國(guó)專利Nos. 4， 820， 805和4， 764， 369。氮丙啶二元乙烯亞胺是一種強(qiáng)力烷化劑，可通過(guò)與核酸而不是蛋白上的親核基團(tuán)相互作用而滅活病毒。 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，病毒滅活可通過(guò)光化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行。按照這種方法，將輻射致敏的化合物加到非致病性病毒的脂質(zhì)懸液中，然后將混合物在紫外燈下照射或者用離子化射線(Y射線或X射線)照射。 補(bǔ)骨脂素及其衍生物以及具有與補(bǔ)骨脂素類似的線性三環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物可誘發(fā)光敏作用。補(bǔ)骨脂素是一種雙功能的光反應(yīng)分子，在長(zhǎng)波紫外線的照射下可與核酸形成共價(jià)鍵。補(bǔ)骨脂素可嵌入到DNA雙螺旋內(nèi)，然后通過(guò)光反應(yīng)使DNA分子的兩條鏈發(fā)生交聯(lián)。見(jiàn)Hwang等，(1996)Biochem Biophys Res Commun 219:191-7。交聯(lián)使DNA分子無(wú)法復(fù)制或被轉(zhuǎn)錄。商品化的補(bǔ)骨脂素化合物有S-甲氧補(bǔ)骨脂素(甲氧沙林)和4，5' ，8三甲基補(bǔ)骨脂素(trioxalen)。使用補(bǔ)骨脂素進(jìn)行光化學(xué)滅活最有效的波長(zhǎng)在320nm到380nm之間，最大有效波長(zhǎng)在33nm到360nm之間。見(jiàn)Pathak， M(1974),陽(yáng)光與人類(Sunlight andMan) ， Pathak， M&Fitzpatrick， T編，Universityof Tokyo Press, Tokyo。
其他光致敏試劑包括鹵代補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂內(nèi)脂、呋喃并色酮和香豆素，這些化合物都含有一個(gè)鹵素取代基和一個(gè)水溶性基團(tuán)，如第四氨離子或磷離子。據(jù)信在補(bǔ)骨脂素分子上加入鹵原子取代基，特別是溴原子取代基可以提高致敏劑與DNA的結(jié)合常數(shù)，因?yàn)殇逶涌商峁┦杷匦浴Ｔ谀承?shí)施方式中，可以使用溴化光致敏劑，因?yàn)橹恍枰粋€(gè)光子就可以活化溴化致敏劑，而用非溴化的補(bǔ)骨脂素需要兩個(gè)光子才能使DNA交聯(lián)。見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 418， 130。 光化學(xué)滅活的典型方法見(jiàn)實(shí)施例11的描述，該方法聯(lián)合使用trioxalen和長(zhǎng)波紫外線照射。見(jiàn)Weightman&Banks( 1999) J Virol Methods 81 :179-82和Cotton等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89 :6094-8。 為了保持病毒的抗原性，用補(bǔ)骨脂素滅活活病毒時(shí)應(yīng)在非氧化的環(huán)境下進(jìn)行。通過(guò)去除滅活培養(yǎng)基中的氧和其他氧化物，由于紫外線照射而引起的抗原降解可得到最大限度的避免。見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 106,619。同樣，通過(guò)使用抗氧化劑/淬滅劑可使短波紫外線照射時(shí)產(chǎn)生的自由基和其他活性氧成分降到最少，從而可以使蛋白的損傷大大減少。見(jiàn)Marx等，(1996)Photochem Photobiol 63 :541-6。 在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，病毒滅活可以通過(guò)改造病毒的基因來(lái)完成，從而使病毒受到損傷或無(wú)法復(fù)制。例如，對(duì)病毒進(jìn)行基因改造使病毒的必需基因發(fā)生一個(gè)或多個(gè)溫度敏感型的突變。在允許溫度(如25tO下用Sf9或Tn5細(xì)胞制備和擴(kuò)增病毒。當(dāng)病毒在治療時(shí)被導(dǎo)入到哺乳動(dòng)物受試者內(nèi)時(shí)，溫度不再是允許溫度了，這樣溫度敏感基因就很難表達(dá)，或者表達(dá)的基因產(chǎn)物沒(méi)有功能，因此病毒是殘缺的。 可被制備的典型溫度敏感突變可在病毒感染所必需的基因上進(jìn)行。例如，編碼PKIP的基因發(fā)生溫度敏感型的突變，這個(gè)蛋白可與病毒編碼的蛋白激酶相互作用，調(diào)節(jié)病毒晚期基因的轉(zhuǎn)錄。在非允許溫度下，攜帶這種突變的病毒在感染宿主時(shí)是有缺陷的。見(jiàn)McLachlin等(1998) Virology 246 :379和Partington等，(1990)Virology175 :91。
病毒是否被滅活可通過(guò)證明其在天然宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力是否喪失來(lái)確定?？衫脴?biāo)準(zhǔn)的噬菌斑試驗(yàn)來(lái)證明一個(gè)樣品的感染性。在沒(méi)有合適的方法來(lái)證明某種病毒是否具有感染性時(shí)，就需要通過(guò)滅活一個(gè)具有相似的生物物理特性和結(jié)構(gòu)特性的模型病毒來(lái)證明其是否被滅活。見(jiàn)Henzler&Kaiser (1998)Nat Biotechnol 16:1077-9。為了使病毒完全滅活，本發(fā)明所用的滅活方法可以包括使病毒與滅活剌激物連續(xù)接觸。
C. 2.載體 如本文所描述，非致病性病毒可以是活病毒、滅活病毒、病毒顆粒、病毒包含體、病毒成分或其混合物。為了促進(jìn)非致病性病毒向受試者癌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移，可以給予一種能在受試者體內(nèi)激發(fā)抗癌和/或抗感染性疾病反應(yīng)的組合物，該組合物包含(a)有效量的非致病性病毒；以及(b)藥學(xué)上可接受的載體。在適當(dāng)?shù)臈l件下可同時(shí)使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的載體。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"載體"是指可用于將病毒、病毒樣顆粒、病毒成分、病毒蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞的漿膜或穿過(guò)細(xì)胞的漿膜的化合物或一組化合物。 用于轉(zhuǎn)運(yùn)非致病性病毒或病毒成分的典型載體包括脂質(zhì)體、納米微球(Manome 等，1994 ;Salt薩n和Fung， 1997)、氨基葡糖多聚糖(見(jiàn)美國(guó)專利No. 6， 106， 866)、脂肪酸 (見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 994， 392)、脂肪乳劑(見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 651， 991)、脂質(zhì)和脂質(zhì)衍生物 (見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 786， 387)、膠原(見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 922， 356)、多糖及其衍生(見(jiàn)美國(guó)專 利No. 5， 688， 931)、納米懸液(見(jiàn)美國(guó)專利No. 5， 858， 410)、聚合微膠?；蚓酆衔?見(jiàn)美國(guó) 專利Nos. 4， 551， 482、5， 714， 166、5， 510， 103、5， 490， 840和5， 855， 900)以及多核糖體(見(jiàn) 美國(guó)專利No. 5， 922， 545)。 為了轉(zhuǎn)錄病毒成分，載體還可以用基因治療載體，其中包括病毒載體和質(zhì)粒載體。 適于基因表達(dá)的病毒載體包括腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAVs)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、假型逆轉(zhuǎn)錄病毒、 皰疹病毒、痘苗病毒和Semiliki森林病毒。載體還可以包含病毒樣顆粒、蛋白運(yùn)送載體， 其中包括Pro-Ject (Pierce Biotechnology, INC.)禾口 Profect (TargetingSystems)以及 Chariot (Active Motif)等。 可以選擇載體使非致病性病毒在需要治療部位達(dá)到穩(wěn)定的生物利用度。術(shù)語(yǔ)"穩(wěn) 定的生物利用度"涉及的因素包括而不限于非致病性病毒從載體內(nèi)的延遲釋放、非致病性 病毒的代謝穩(wěn)定性、包含非致病性病毒的組合物的系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)以及非致病性病毒的有效劑 能達(dá)到穩(wěn)定的生物利用度的典型組合物包括而不限于基質(zhì)聚合物，其中包括 膨脹的可生物降解的基質(zhì)聚合物(美國(guó)專利Nos. 6，335，035 ;6， 312， 713 ;6， 296， 842 ; 6， 287， 587 ;6， 267， 981 ;6， 262， 127和6， 221， 958)，聚合物包被的微粒子(美國(guó)專利 Nos. 6， 120， 787和6， 090， 925)，多元醇油懸液(美國(guó)專利No. 6， 245， 740)，多孔顆粒(美 國(guó)專利No. 6， 238， 705)，乳膠/蠟包被顆粒(美國(guó)專利No. 6， 238， 704)，殼聚糖微膠囊，以及 微球乳劑(美國(guó)專利No. 6， 190， 700)。
C. 3.劑型、劑量和給藥途徑 本發(fā)明組合物的適宜給藥劑型包括水性的和非水性的無(wú)菌注射液，其中包含抗氧 化劑、緩沖物質(zhì)、抑菌劑、抗生素和抗真菌藥(如parabens，氯代丁醇，酚，抗壞血酸，硫柳 汞)、將制劑的滲透壓調(diào)整到與受試者體液一致的溶質(zhì)(如糖，鹽和多元醇)，懸浮劑和增厚 劑。制劑可置于單次劑量的包裝內(nèi)，也可置于多次劑量的包裝內(nèi)，如密封的安瓿和小玻璃 瓶，可以儲(chǔ)存在冷凍條件下活凍干條件下，在使用前只需加入無(wú)菌液體載體就可以注射了 。
注射到宿主體內(nèi)的組合物包括無(wú)菌水溶液或分散液以及可制備成無(wú)菌注射液或 分散液的無(wú)菌粉末?？勺⑸涞慕M合物應(yīng)當(dāng)是液體的，其流動(dòng)性應(yīng)當(dāng)達(dá)到可以很容易地用注 射器注射的程度。適宜的溶劑包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及 其混合物。可以使用包被如卵磷脂和/或通過(guò)降低顆粒的直徑來(lái)維持組合物的流動(dòng)性。
本發(fā)明的非致病性病毒可通過(guò)瘤內(nèi)注射、瘤旁注射、系統(tǒng)注射、胃腸外途徑(如靜 脈注射、肌肉注射、動(dòng)脈內(nèi)注射和輸液)、口服、透真皮注射(局部給藥)、鼻內(nèi)途徑(吸入) 以及粘膜內(nèi)注射的方式給藥。選擇何種給藥方式要根據(jù)載體的類型、組合物的療效、需治療 的部位以及患者的狀況而定。 本文所用的術(shù)語(yǔ)"蛋白運(yùn)送載體"是指可促使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜或跨過(guò)細(xì)胞膜 的物質(zhì)。
在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒是被直接注射到腫瘤內(nèi)或腫瘤旁部位。術(shù)語(yǔ)"腫 瘤旁部位"是指離腫瘤外緣約15cm以內(nèi)的部位、約10cm以內(nèi)的部位、約5cm以內(nèi)的部位、約 lcm以內(nèi)的部位或者約0. 1cm以內(nèi)的部位。本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到一個(gè)或多個(gè) 腫瘤或腫瘤旁部位內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到腫瘤和/或 腫瘤周圍的多個(gè)位點(diǎn)內(nèi)。 在某些實(shí)施方式中，如果癌的生長(zhǎng)是非腫瘤性的，那么非致病性病毒可以注射到 病變部位或病變周圍部位。術(shù)語(yǔ)"病變周圍部位"是指非腫瘤性增生外緣約15cm以內(nèi)的部 位、約10cm以內(nèi)的部位、約5cm以內(nèi)的部位、約lcm以內(nèi)的部位或者約0. lcm以內(nèi)的部位。 本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到一個(gè)或多個(gè)病變和/或病變旁部位內(nèi)。在某些實(shí)施方式 中，本發(fā)明的非致病性病毒可以注射到非腫瘤性增生部位和/或非腫瘤性增生部位周圍的 多個(gè)位點(diǎn)內(nèi)。 在組合物是用于治療感染性疾病的實(shí)施方式中，非致病性病毒可通過(guò)系統(tǒng)途徑給 藥。在某些實(shí)施方式中，非致病性病毒被局部注射到損傷部位內(nèi)。 本發(fā)明涉及給予患者有效量的非致病性病毒。術(shù)語(yǔ)"有效量"用于本文中是指足 以激發(fā)出抗癌活性，包括抗腫瘤活性和/或抗非腫瘤性增生活性的非致病性病毒的量。如 本文所描述，典型的抗癌活性包括而不限于癌細(xì)胞的溶解、癌生長(zhǎng)的抑制、癌轉(zhuǎn)移的抑制和 /或?qū)Π┑牡挚沽?。在某些?shí)施方式中，"有效量"是指體外試驗(yàn)中可有效抑制癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn) 移、誘導(dǎo)對(duì)癌的抵抗力、誘導(dǎo)細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡等所需要的一種藥物的量。在某些實(shí)施方 式中，"有效量"的藥物抑制癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)對(duì)癌的抵抗力、誘導(dǎo)細(xì)胞溶解、細(xì)胞死亡至 少提高10%、20%、30%、40%、50%、60%、70、80%、90%、2倍、5倍、10倍或100倍。
本文中的術(shù)語(yǔ)"有效量"是用于描述足以激發(fā)抗感染性疾病活性的非致病性病毒 的量。在某些實(shí)施方式中，與對(duì)照相比，"有效量"的非致病性病毒可以使病毒的復(fù)制至少被 抑制10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、2倍、5倍、10倍或100倍。
本發(fā)明的治療性組合物中實(shí)際包含的活性成分的量可以是不同的，只要該劑量的 組合物在特定的患者體內(nèi)可以達(dá)到預(yù)期的治療效果。為了激發(fā)出預(yù)期的活性，可以選擇不 同的給藥方案。可以進(jìn)行單次注射，也可以進(jìn)行多次注射。劑量和給藥方案的選擇要根據(jù) 不同的因素來(lái)確定，其中包括治療性組合物的活性、劑型、給藥途徑、與其他藥物或治療措 施的聯(lián)合、被治療的疾病類型以及被治療患者的健康狀況及用藥史。確定和調(diào)整有效給藥 劑量以及確定何時(shí)和如何調(diào)整都是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。 可用各種方法來(lái)計(jì)算非致病性病毒的給藥劑量。對(duì)非致病性活病毒來(lái)說(shuō)，可用噬 菌斑形成單位來(lái)計(jì)算劑量。對(duì)于無(wú)活性的非致病性病毒來(lái)說(shuō)，由于不能形成噬菌斑，其劑量 用PFU的等價(jià)量來(lái)表示。本文所用的術(shù)語(yǔ)"PFU等價(jià)量"是指非致病性病毒的量。PFU等價(jià) 量定義為1PFU的病毒被滅活后所得到的病毒的量。 另一種確定病毒給藥量的方法是基于樣品中存在的病毒顆粒數(shù)目?？捎萌魏畏椒?對(duì)顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，如電鏡。也可以通過(guò)體外試驗(yàn)所得到的有效量來(lái)推算出非致病性病毒，包 括滅活病毒的給藥量。體外試驗(yàn)可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的測(cè)定抗癌活性或抗感染性 疾病活性的任何試驗(yàn)，其中包括而不限于測(cè)定細(xì)胞毒性、細(xì)胞死亡、細(xì)胞在軟瓊脂上的生長(zhǎng) 能力等的試驗(yàn)。在某些實(shí)施方式中，劑量是指可使細(xì)胞毒活性或細(xì)胞死亡比對(duì)照組增加至 少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%的量。在某些實(shí)施方式中，劑量是指可使細(xì)胞在軟瓊脂上的生長(zhǎng)能力比對(duì)照組至少降低20 % 、30 % 、40 % 、50 % 、60 % 、70 % 、 80%、90%或99%的量。 其他有關(guān)劑型、劑量和給藥方案的指導(dǎo)原則描述于Berkow等，(1997) Merck醫(yī)學(xué)'瞎牛艮手冊(cè)(The Merck Manual of Medical Information) ， Home編，Merck ResearchLaboratories， Whitehouse Station, New Jersey ;Goodman等，(1996) Goodman&Gilman治療學(xué)的藥王里基石出(Goodman&Gilman， s the Pharmacological Basis of Therapeutics) 第9片反，McGraw-Hill Health Professions Division, New York ; Ebadi(1998)CRC臨床藥理學(xué)手冊(cè)(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology), CRC Press, Boca Raton, Florida :Katzung(2001)某石出禾口臨床藥輝.學(xué)(Basic&Clinical Pharmacology), 第8片反，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Division, New York ;Remington等，(1975)Remington藥 物 學(xué) (Remington' s Pharmaceutical Sciences), 第15片反，Mack Pub. Co. ， Easton， Pennsylvania ;Speight等，(1997)Avery 論^:銻射頃巾論冊(cè)、歸j能,禾口歸髓豐旨，稀(Averv， s Drug Treatment :A Guide to thePropertie， Choice, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs m DiseaseManagement)，第4片反，Adis International,Auckland/Philadelphia, Pe皿sylrania。 在某些實(shí)施方式中，通過(guò)體外或體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)組合物以確定其"有效量"。例
如，在本文所描述的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法中，適用的試驗(yàn)包括而不限于細(xì)胞體外存活能力
分析試驗(yàn)，其中包括TUNEL分析或其他熒光分析方法如Cell-Titer Blue(Promega Corp);
監(jiān)測(cè)DNA片段化的試驗(yàn)；以及細(xì)胞色素C釋放試驗(yàn)、軟瓊脂生長(zhǎng)試驗(yàn)、接觸抑制試驗(yàn)和及
腫瘤在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)試驗(yàn)；給動(dòng)物注射本發(fā)明的組合物后接種腫瘤并監(jiān)測(cè)腫瘤緩解情
況的試驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)，其中轉(zhuǎn)基因小鼠被接種了腫瘤并監(jiān)測(cè)其緩解情況；本文所描
述的體內(nèi)試驗(yàn)；測(cè)定細(xì)胞穿過(guò)屏障的體外試驗(yàn)如Matrigel試驗(yàn)(見(jiàn)Cancer Res. 2003Aug
1 ;63(15) :4632-40 ;Am J Chin Med. 2003 ;31 (2) :235-46) ;Yang等，(Cancer Res. 61，
5284-5288， July 1，2001)所描述的體外侵襲性和體內(nèi)轉(zhuǎn)移性分析試驗(yàn)。 本發(fā)明包含非致病性病毒的組合物還可以包含一種或多種用于增強(qiáng)藥物組合物
療效的佐劑。這些佐劑包括而不限于(l)鋁鹽(明礬)，如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等；
(2) 水包油乳劑(其中含有或不含有其他特異性的免疫剌激因子如胞壁酰肽(見(jiàn)下文)或 細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，如(a)MF59(國(guó)際
發(fā)明者D·L·斯隆, M·L·麥克占, W·M·卡瓦諾 申請(qǐng)人:諾華疫苗和診斷公司