專利名稱：以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤dna疫苗及病毒載體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA 載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗 和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
背景技術(shù)：
生存素(Survivin)是抑制凋亡蛋白(IAP)家族成員，具有抗凋亡和調(diào)控細(xì)胞分裂 的雙重功能，廣泛表達(dá)于各種胚胎組織和癌細(xì)胞中，但在正常終末分化細(xì)胞中不表達(dá)。這些 特點使生存素成為腫瘤發(fā)生，發(fā)展和治療等領(lǐng)域中的一個新靶點。目前的研究表明生存素在腫瘤基因治療中具有潛在價值它的腫瘤特異性表達(dá)， 及其與預(yù)后不良、藥物抗性和病人生存期縮短等呈正相關(guān)。針對生存素及其突變體等進行 的腫瘤免疫治療已成為人們關(guān)注的熱點。目前國內(nèi)外策略有(參見Li，F(xiàn). et al. ,2006 ； Li，F(xiàn).，2003 ；Altieri, D. C.，2008) (1)利用生存素啟動子的腫瘤特異性表達(dá)進行的腫瘤 靶向基因治療；(2)針對生存素本身的治療策略a)生存素的反義或全長的cDNA或反義核 苷酸表達(dá)載體策略，比較適合生存素的功能研究和前臨床研究，但用全長的生存素可能有 潛在的危險；b)生存素功能陰性突變體(dominant negative mutant, DNM)策略，主要是 SurvT34A和SurvC84A，但此方案可能不適用于直接的癌癥治療；c)生存素核酶方案，即用 生存素mRNA特異性核酶剪切生存素mRNA以降低生存素的表達(dá)，此方案也是一種有效的研 究工具，但不適用于癌癥臨床治療；d)生存素RNAi技術(shù)，目前的研究表明RNAi能有效的 使哺乳動物基因表達(dá)沉默，可用于基因功能研究，但昂貴的費用限制其臨床應(yīng)用；e)用小 分子有機物或小肽抑制生存素的表達(dá)或干擾其功能；f)用生存素特異性表位的免疫治療， 這是一個很吸引人的領(lǐng)域，但只用生存素的小肽，免疫原性可能不高。因為生存素具有抗凋亡的功能，如果用其全長來設(shè)計疫苗可能存在安全隱患，根 據(jù)國內(nèi)外策略的優(yōu)點和弊端擬采用生存素抗凋亡功能缺失剪切體來設(shè)計疫苗，在保證其抗 凋亡功能缺失的情況下盡量保存長度以提高免疫原性。因此本發(fā)明采用生存素的抗凋亡功 能缺失剪切體來設(shè)計疫苗。生存素在體內(nèi)是以二聚體形式起作用的，它N-端第6、第7和第 10位的三個氨基酸是形成二聚體的關(guān)鍵氨基酸(參見》 ，Y. et al. ,2000)；生存素的第5 位至第14位氨基酸是HLA-A2的特異性抗原表位(參見Andersen, Μ. H. et al.，2001)，基 于這兩點本發(fā)明首次設(shè)計了剪切體S8(即切去生存素N-端7個氨基酸)，希望可以破環(huán)它 的二聚體結(jié)構(gòu)，從而使其缺失抗凋亡的功能。因此以S8為靶點來設(shè)計疫苗可能會提高疫苗 的安全性。粘蛋白I(MUCl)是粘蛋白家族成員，是跨膜糖蛋白，存在于正常腺管上皮細(xì)胞及 其來源的腫瘤細(xì)胞表面，由多肽核心和側(cè)枝糖鏈構(gòu)成。其核心肽胞外段含有數(shù)目不等的串 聯(lián)重復(fù)區(qū)(VNTR)。正常組織中MUCl分布于腺管上皮細(xì)胞分泌極，與免疫細(xì)胞相對隔離，糖 基化豐富；而在腫瘤組織，其廣泛分布并異常豐富地表達(dá)于細(xì)胞表面，糖基化不完全，因此暴露出正常情況下隱蔽的表位，成為免疫細(xì)胞攻擊的靶點，并且表達(dá)增強，可達(dá)正常細(xì)胞的 100倍以上，因此MUCl是較理想的抗腫瘤靶分子。MUC1VNTR中的PDTRP序列是B細(xì)胞及T細(xì)胞共同識別的表位，可與MUCl特異性抗 體及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)相結(jié)合，故稱這個最具免疫原性的部位為免疫顯性結(jié)構(gòu)域， 因此，目前大部分利用MUCl研究免疫治療的都是集中在VNTR區(qū)域(參見Singh，R. etal.， 2007 ；Persson, J. et al. , 2006 ；Xing, P. X. et al.，1992 ；Tang, C. K. etal.，2008 ；Tang, C. K. et al.，2008)。從發(fā)現(xiàn)MUCl到現(xiàn)在已用其進行了很多的疫苗研究工作，并有一些疫苗 已經(jīng)進入人類臨床研究階段，但大多數(shù)都是傳統(tǒng)的多肽類、蛋白類或樹突狀細(xì)胞(DC)類疫 苗，這些疫苗大多都存在免疫原性差或制備困難等問題；進入臨床的基因疫苗主要是重組 痘病毒疫苗，雖然沒有檢測到毒性，但直接用重組痘病毒疫苗初免-加強還是存在較大的 安全隱患，而且產(chǎn)生的臨床效果也不是很理想；DNA載體疫苗由于免疫原性較弱目前還基 本處于臨床前研究階段。本發(fā)明發(fā)明人的前期研究表明增VNTR的數(shù)目可在一定程度上增強MUCl的免疫效 果(參見^iang S et al.，2008)，如33個拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng)答 明顯強于2個拷貝的MUCl VNTR串聯(lián)重復(fù)序列引起的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明選用含有33個 的串聯(lián)重復(fù)序列MUCl VNTR作為抗原來設(shè)計疫苗，并將其與S8融合表達(dá)來構(gòu)建融合表達(dá)疫 苗以增強疫苗免疫的廣譜性和有效性，目前將生存素和MUCl VNTR聯(lián)合應(yīng)用進行腫瘤治療 還未見報導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種DNA片段S8，所述S8片段的序列為SEQ IDNO :8。本發(fā)明提供了一種重組質(zhì)粒VR-S8，其中所述重組質(zhì)粒的骨架載體為如圖IA的 VR1012，在所述VR1012的多克隆位點中所述的S8片段。優(yōu)選地，所插入的S8片段位于 VR1012的多克隆位點SalI和BamHI之間。本發(fā)明提供了一種SEQ ID NO :9所示的DNA片段MS，所述序列MS包含一個含有 33個拷貝的MUCl VNTR的DNA片段33M和所述的S8片段。本發(fā)明提供了 一種重組質(zhì)粒VR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為 VR1012，在所述VR1012的多克隆位點中插入了所述的MS片段。優(yōu)選地，所插入的MS片段 位于VR1012的多克隆位點SalI和BamHI之間。本發(fā)明提供了一種重組腺病毒Ad_S8，其特征在于在腺病毒中插入了所述的S8片 段。優(yōu)選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGl0XAEl，3Cre，所插入的S8片段位于所述 重組腺病毒的多克隆位點EcoRI和BglII之間本發(fā)明提供了一種重組腺病毒Ad-MS，其特征在于在腺病毒中插入了所述的MS片 段。優(yōu)選地，所述重組腺病毒的骨架載體為pBHGl0XAEl，3Cre，所插入的MS片段位于所述 重組腺病毒的多克隆位點BglII處。本發(fā)明提供了一種重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特征在于在所述重組改良 安卡拉痘苗病毒中插入了所述的MS片段。優(yōu)選地，所插入的MS片段位于所述重組改良安 卡拉痘苗病毒的多克隆位點Mil和KpnI之間。本發(fā)明提供了所述的S8片段或所述的MS片段在制備用于進行抗腫瘤免疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗中的用途。在一個優(yōu)選的實施方中，上述疫苗中包含免疫佐劑和/或化療藥物，其中所述免 疫佐劑選自細(xì)胞因子白介素2(IL-2)、細(xì)胞因子粒-巨細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和非甲 基化的CpG基序免疫刺激DNA序列，其中所述化療藥物選自卡鉬、順鉬、奧沙利波和紫杉醇。本發(fā)明首先以S8為靶點進行腫瘤基因疫苗的研究，分別構(gòu)建DNA載體疫苗 (VR-S8)和腺病毒載體疫苗(Ad-S8)，采用DNA初免-重組腺病毒加強免疫(DNA prime-rAd boost)免疫策略，同時采用表達(dá)白細(xì)胞介素的質(zhì)粒(VR-IU)作為免疫佐劑，通過免 疫小鼠檢測S8基因疫苗的免疫原性及抗腫瘤活性，結(jié)果表明小鼠可產(chǎn)生針對S8的特異性 抗體(見圖4)和CTL(見圖幻；該疫苗具有一定的抗腫瘤活性，在預(yù)防性實驗中，與PBS組 比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模型小鼠腫瘤生長抑制率為68. M%，生存期延長 了 35. 6% (見圖6)。在治療性實驗中，與PBS組比較，VR-S8/VR-IL2/Ad-S8疫苗免疫組模 型中小鼠腫瘤生長受到了明顯的抑制(抑制率為23. 42%)，但并沒有明顯延長模型小鼠的 生存期(見圖7)。本發(fā)明采用生存素和MUCl為靶點設(shè)計融合表達(dá)基因疫苗。由于MUCl基因的多態(tài) 性決定了不同個體間VNTR數(shù)目的不同，最常見的為含有30-90個連續(xù)重復(fù)序列，根據(jù)自行 構(gòu)建MUCl VNTR基因的特點選擇以33個重復(fù)區(qū)序列(簡稱為33M，該序列含有33個VNTR 的串聯(lián)重復(fù)序列，每個重復(fù)序列之間有6個由于構(gòu)建引入的酶切位點的堿基序列，)來構(gòu)建 MUCl DNA載體疫苗(VR-33M)，同時構(gòu)建33M與S8融合表達(dá)的DNA載體疫苗(VR-MS)。通過 免疫模型小鼠檢測融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果和抗腫瘤活性與二者單獨表達(dá)的疫苗相 比是否有明顯的提高，結(jié)果表明生存素和MUCl融合表達(dá)基因疫苗的免疫效果明顯強于二 者單獨表達(dá)的疫苗的免疫效果，例如在對腫瘤的預(yù)防性研究中，融合表達(dá)疫苗免疫組與生 存素疫苗單獨免疫組相比抑瘤率提高了 134%，生存期延長了 166%;與MUCl單獨免疫組比 較，抑瘤率提高了 25%，生存期延長了 73% (見圖12)。為了進一步加強MS疫苗的免疫效 果又構(gòu)建了其病毒載體疫苗(Ad-MS和MVA-MQ，采用DNA初免-重組腺病毒加強免疫的免 疫策略，同時采用表達(dá)IL2的質(zhì)粒作為免疫佐劑，通過免疫模型小鼠檢測融合表達(dá)基因疫 苗的免疫效果和抗腫瘤活性，結(jié)果表明DNA初免-重組腺病毒加強的免疫策略能明顯抑制 模型小鼠腫瘤的生長，并有效延長小鼠的生存期；IL2也顯示出了明顯的佐劑增強作用(見 圖⑶。


圖1.DNA載體及重組DNA載體疫苗圖譜。A為VR1012載體圖譜；B為重組質(zhì)粒 VR-S8圖譜；C為重組質(zhì)粒VR-33M圖譜；D為重組質(zhì)粒VR-MS圖譜。圖2.重組腺病毒載體圖譜及制備流程。A為AdMax 腺病毒載體及重組病毒制 備流程；B為穿梭載體PDC316圖譜；C為重組穿梭載體PDC316-S8圖譜；D為重組穿梭載體 PDC316-MS 圖譜。圖3. MVA重組原理及相關(guān)載體圖譜。A為MVA重組示意圖；B為穿梭載體pSCll圖 譜；C為重組穿梭載體pSCll-MS圖譜，MS結(jié)構(gòu)基因表達(dá)框架重組到MVA的TK基因中，基因 表達(dá)的啟動子采用P7.5。圖4.小鼠免疫血清抗S8抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS⑵、VR-IL2 (3)、VR-S8 (4)，VR-S8/VR-IL2 (5)，VR-S8/VR-IL2/Ad_S8 (6)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以 表達(dá)S8的C0S-7細(xì)胞裂解上清作為檢測小鼠血清的抗原，以S8單克隆抗體作為陽性對照 (1)，進行蛋白質(zhì)印跡(Western-blot)檢測的結(jié)果。圖5.以不同形式S8基因疫苗免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性檢 測。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用特異性抗原肽(H-2d限制性) 標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞株B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖6.不同形式S8基因疫苗對MSf+B16(購自ATCC)腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫預(yù)防 作用。C57BL/6 小鼠經(jīng) PBS 對照組、VR-IL2、VR-S8、VR-S8/VR-IL2 以及 VR-S8/VR-IL2/Ad_S8 在經(jīng)隔周免疫四次后一周，接種MS/B16腫瘤細(xì)胞，測量腫瘤大?、熘辽蛱欤媲闆r觀 察至腫瘤接種后50天(B)。圖7.不同形式S8基因疫苗對MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫治療作用。在 給C57BL/6小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對照組、卡鉬(Carboplatin)、 VR-S8/VR-IL2/Ad-S8和VR-S8/VR-IL2/Ad_S8/卡鉬疫苗，測量腫瘤大小(A)至27天，生存 情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖8.小鼠免疫血清抗S8、33M及MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS(I)、VR_S8(2)、 VR-33M(3) ,VR-MS (4)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為 抗原，進行蛋白質(zhì)印跡檢測的結(jié)果。圖9. MS疫苗與單獨表達(dá)生存素和MUCl的疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性CTL殺傷活性 的比較。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B) 特異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋 放法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖10.小鼠免疫血清抗MS抗體的檢測。C57/BL小鼠經(jīng)PBS (1)、VR-IL2 (2)、 VR-MS (3)、VR-MS/VR-IL2 (4)、VR-MS/VR-IL2/Ad_MS (5)免疫后，以小鼠的血清作為一抗，以 表達(dá)MS的C0S-7細(xì)胞裂解物作為抗原，進行蛋白質(zhì)印跡檢測的結(jié)果。圖11.基于MS基因疫苗不同形式免疫后，小鼠脾淋巴細(xì)胞的特異性CTL殺傷活性 檢測。從被免疫小鼠脾細(xì)胞中分離的淋巴細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，并用生存素(A)和MUCl (B)特 異性抗原肽(H-2d限制性)標(biāo)記的小鼠肺癌細(xì)胞B16作為靶細(xì)胞，采用非放射性LDH釋放 法檢測免疫鼠的CTL應(yīng)答。圖12. MS疫苗與單獨表達(dá)生存素和MUCl的疫苗對模型小鼠免疫預(yù)防效果比較。 C57BL/6小鼠經(jīng)PBS對照組、VR-S8、VR-33M以及VR-MS在經(jīng)隔周免疫三次后一周，接種 MS/B16腫瘤細(xì)胞，測量腫瘤大小(A)至沈天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。圖13.不同形式MS基因疫苗對MS/B16腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長的免疫治療作用。在 給C57BL/6小鼠皮下接種MS/B16腫瘤細(xì)胞后，分別給予PBS對照組、卡鉬、VR-MS/VR-IL2/ Ad-MS, VR-MS/VR-IL2/MVA-MS 以及 VR-MS/VR-IL2/Ad_MS/ 卡鉬組，測量腫瘤大小(A)至 27 天，生存情況觀察至腫瘤接種后50天(B)。
具體實施例方式一 .上述片段33M和S8的制備方法和條件1. 33M 的制備
MUCl VNTR為一個含有60個堿基的重復(fù)片段，GenBank號為NM_002456 (SEQ ID NO :1)。根據(jù)一個VNTR的堿基序列設(shè)計了兩對引物，采用重疊延伸PCR技術(shù)(SOE PCR)合 成1個VNTR(Im)重復(fù)區(qū)片段，然后利用限制性內(nèi)切酶MlI和SioI酶切產(chǎn)生相同粘性末端 的特性，依次進行連接，構(gòu)建33M基因片段。具體方法如下1)重疊延伸PCR技術(shù)PCR 反應(yīng)條件為:95°C 20s、55°C 20s、72°C 30s，進行 30 個循環(huán)，利用引物 Pl (SEQ ID NO :2)禾口P2(SEQ ID NO :3)擴增出無ATG 的 1 拷貝MUCl VNTR(簡寫為m)，以P2和P3 (SEQ ID NO 4)為引物擴增出含ATG的1拷貝MUCl VNTR(簡寫為Am)片段。2)pGEM-T-33M的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將上述PCR產(chǎn)物m和Am分別和pGEM-T-easy (Promega公司)載體進行連接，分 別獲得含有所述m和Am片段的pGEM-T-m和pGEM-T_Am兩個質(zhì)粒，然后利用限制性內(nèi)切 酶Mil和BioI酶切產(chǎn)生相同粘性末端的特性，依次進行連接獲得含有所述33M片段的 PGEM-T-33M質(zhì)粒，經(jīng)MlI和B10I酶切鑒定后進行序列分析，測序結(jié)果正確。具體過程即先 將pGEM-T-m用MlI和XhoI雙酶切得目的片斷m，然后再將其插入pGEM-T-m的XhoI位點， 即得到pGEM-T-2m。然后再將pGEM-T-^ii用Mil和BioI雙酶切得目的片斷2m，然后再將其 插入pGEM-T-2m的XhoI位點，即得到pGEM-T_4m，同理得pGEM-T_32m，然后再將pGEM-T-Am 用Mil和BioI雙酶切得目的片斷Am，然后再將其插入pGEM-T_3aii的MlI位點，即得到了 質(zhì)粒 pGEM-T-3;3m。2. S8 的制備生存素，GenBank號為NM_001168，根據(jù)生存素的序列設(shè)計了兩對引物，采用 RT-PCR技術(shù)從293細(xì)胞的總RNA中擴增出了 S8的基因片段，序列為SEQ NO 8所示的堿基 序列。具體方法如下1)RT-PCR 技術(shù)采用TRIzol RNA提取試劑盒(Gibco公司)提取四3細(xì)胞的總RNA，采用 Super-Script反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Gibco公司)從中獲得293細(xì)胞的cDNA，然后以其為模板， 以 P4(SEQ ID NO 5)和 P5 (SEQ IDNO :6)為引物進行PCR(反應(yīng)條件為:95°C 30s、55°C 30s、 72°C lmin，進行30個循環(huán))擴增生存素cDNA。2)pGEM-T-S8的構(gòu)建、酶切鑒定及序列分析將生存素cDNA的PCR產(chǎn)物與pGEM-T-easy載體進行連接得到含有生存素cDNA的 pGEM-T-Surv質(zhì)粒。經(jīng)序列分析證實正確后，以pGEM-T_Surv為模板，以P6 (SEQ ID NO 7) 和P5為引物通過PCR擴增S8片段(SEQ ID NO :8)，正向引物P6引入EcoRI、XbaI和SalI 的酶切位點，反向引物P5引入了 BamHI的酶切位點。將S8PCR產(chǎn)物連入pGEM-T-easy載體 獲得含有所述S8片段的pGEM-T-S8質(zhì)粒，經(jīng)MlI和BamHI酶切鑒定后進行序列分析，測序 結(jié)果正確。二.重組疫苗的獲得方法及相應(yīng)的條件1.DNA載體疫苗1)VR-33M 的構(gòu)建VR1012載體(VR1012是Vical公司開發(fā)的經(jīng)美國FDA正式批準(zhǔn)的可以用于人體基 因疫苗臨床試驗的載體，已經(jīng)完成的臨床試驗表明其在人體的應(yīng)用是安全的，該載體的構(gòu)建過程參見文獻(xiàn)(Human GeneTherapy 1996,7 :1205-1217))含有CMV啟動子，卡那霉素抗 性基因，內(nèi)含子A和BGH PolyA翻譯終止信號等常規(guī)部件組成，共4913bp，圖譜見圖1A。將上述制得的pGEM-T-33M質(zhì)粒經(jīng)SallAhoI雙酶切后用膠回收試劑盒(北京天 根生化科技有限公司)回收33M基因片段，將真核表達(dá)載體VR1012載體經(jīng)MlI單酶切后用 膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收載體片段，利用經(jīng)MlI和HioI酶切后具 有相同粘性末端這一性質(zhì)將所回收的目的基因片段和載體片段，以T4DNA連接酶，在16°C 下連接池。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplOGnvitrogen公司)，涂布卡那霉素 抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h， l，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用 Sall/BamHI進行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜見圖1C。2)VR_S8 的構(gòu)建將pGEM-T-S8和真核表達(dá)載體VR1012載體分別經(jīng)MlI/BamHI雙酶切，用膠回收 試劑盒(北京天根生化科技有限公司)回收目的基因片段S8和VR1012載體片段，用T4DNA 連接酶，16°C連接池。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌ToplOGnvitrogen公司)，涂 布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下 培養(yǎng)16h，1，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提 取質(zhì)粒，用MlI/BamHI進行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-33M，圖譜 見圖IB03) VR-MS 的構(gòu)建將pGEM-T-33M經(jīng)Sall/Xhol雙酶切后回收目的基因片段33M，將VR-S8載體經(jīng) SalI單酶切后回收載體片段，利用經(jīng)MlI和BioI酶切后具有相同粘性末端這一性質(zhì)將回 收目的基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接池。獲得VR-33M-S8，簡稱VR-MS質(zhì) 粒，用MlI/BamHI進行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到了重組質(zhì)粒VR-MS，圖譜見圖 1D。MS序列為如SEQ ID NO 9所示的堿基序列。2.重組腺病毒疫苗(Ad_S8、Ad-MS)的獲得腺病毒是一種無外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長約361Λ，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié) 構(gòu)，直徑約80-1 lOnm。腺病毒基因組的兩端各有一段IOObp的反向末端重復(fù)序列(ITR)，是 復(fù)制的起始位點。在左端ITR的3'側(cè)有一段長約300bp的包裝信號(Ψ)介導(dǎo)腺病毒基因 組包裝入病毒衣殼。對腺病毒而言，只有包括兩端的ITR和包裝信號(Ψ)的約0.51Λ的序 列是順式作用元件，即必須由腺病毒載體自身攜帶，而其他的30余種蛋白都可以通過輔助 病毒(或細(xì)胞)反式補足。本實驗中采用的腺病毒系統(tǒng)是AdMax Adenovirus載體系統(tǒng)(Microbix公司)， 該系統(tǒng)是位點特異性重組系統(tǒng)，位點特異性重組是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點上的重組， 重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點和位點特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。重 組酶只能催化特異性位點間的重組，不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重 組，因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點特異性重組又稱保守重組，該重組過程 不需RecA酶參與。目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、FLP 和BP均為特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、靶位點及重組機制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點，也有相似的結(jié)構(gòu)。AdMaxTM Adenovirus 載體應(yīng)用的是Cre/loxP系統(tǒng)，Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個氨基酸的單聚體蛋白，分子量為 38kDa，它是位點特異性重組發(fā)生所需的特異性重組酶，其識別位點被稱為loxPdocusof crossing-over PI)，為一段34bp的DNA序列，由兩個13bp的反向重復(fù)序列和一個8bp的不 對稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。 IoxP位點堿基重排后形成十字形的結(jié)構(gòu)，核心序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的 底物，也是DNA識別與重組的位點，對稱的13bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶結(jié)合的序列。AdMaxTM Adenovirus載體系統(tǒng)是由穿梭載體和骨架載體(pBHGlox Δ El，3Cre)構(gòu) 成，各含有一個同向排列的LoxP位點，其中骨架載體還含有由CMV啟動子調(diào)控的Cre基因。 將穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株四3，骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達(dá)，介導(dǎo) 兩個LoxP位點之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因以及Cre基因， 同時完成目的基因的插入。由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少 形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(Ψ)，而穿梭載體則含有Ψ，因此只有在兩 個載體之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒；另 外，骨架載體缺失El基因，因此需要轉(zhuǎn)染組成型表達(dá)El蛋白的293細(xì)胞。將骨架載體和穿 梭載體(本研究選用的穿梭載體為pDC316，圖譜見圖2Β)共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，利用293細(xì)胞 中的El蛋白，10左右天就可以產(chǎn)生出含有外源基因的重組腺病毒噬斑(見圖2Α)，挑取噬 斑，進行PCR(反應(yīng)條件為95°C 30s,53°C 30s,72°C lmin，進行30個循環(huán))鑒定，選取正確 的克隆進行大量擴增、純化和滴度測定。1)穿梭重組質(zhì)粒pDC316-S8和pDC316_MS的獲得將pGEM-T-S8用EcoRI/BamHI雙酶切后回收得到S8目的片段，將pDC316用EcoRI/ BglII雙酶切后回收作為載體，利用BamHI和BglII具有相同粘性末端的性質(zhì)，將回收目的 基因片段和載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接池。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 ToplO (Invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌 落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，1，2000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京 天根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用EcoRI/Bglll進行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即 得到了重組質(zhì)粒PDC316-S8 (圖譜見圖2C)質(zhì)粒。將VR-MS用BglII單酶切后回收得到MS 目的片段，將PDC316用BglII單酶切后回收作為載體，將回收目的基因片段和載體片段進 行連接，經(jīng)雙酶切和測序鑒定結(jié)果正確，即獲得pDC316-MS(圖譜見圖2D)質(zhì)粒。 2) Ad-S8和Ad-MS重組病毒的獲得將pBHGlox Δ El,3Cre 和 pDC316_S8 或 pDC316_MS 共轉(zhuǎn)染 293 細(xì)胞后，經(jīng)過篩選、 擴增、純化后，獲得分別含有S8和MS片段的重組腺病毒Ad-SS或Ad-MS。3.重組MVA疫苗(MVA-MS)的獲得改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量 大等優(yōu)點使其得以廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療中。MVA含有胸苷激酶基因(TK)(參見圖3A)； pSCll(參見圖3B)是它的穿梭質(zhì)粒，具有多克隆酶切位點可以插入外源基因、具有胸苷激 酶的左臂和右臂(TKL、TKR)可以與MVA進行同源重組，同時含有IacZ基因，可以用于重組 MVA(rMVA)的藍(lán)斑篩選。所述MVA系統(tǒng)(含穿梭質(zhì)粒pSCll)購自ATCC。1)穿梭重組質(zhì)粒pSCll-MS的獲得
9
將VR-MS和pSCl 1經(jīng)SalI/Kpnl雙酶切后回收，將回收目的基因片段MS和 pSCll載體片段用T4DNA連接酶，16°C連接池。用所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 ToplO (invitrogen公司)，涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌 落于5mlLB培養(yǎng)基中37°C下培養(yǎng)16h，12000rpm離心收獲菌體，用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天 根生化科技有限公司)提取質(zhì)粒，用Sall/Kpnl進行雙酶切和測序鑒定，結(jié)果正確，即得到 了重組質(zhì)粒pSCll-MS(見圖3C)。2) MVA-MS重組病毒的獲得首先以滴度0. 05pfu/cell 的 MVA 感染 tk_tsl3 細(xì)胞(購自 ATCC，ATCC 號為CRL-1632 ，是不含有TK基因的BHK-21的突變株)。感染2小時后，利用 Lipofection2000 (INVITROGEN)的方法將 pSCll-MS 轉(zhuǎn)染到感染了 MVA 的 tk_tsl3 細(xì)胞中。 MVA在tk-tsl3細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的過程中，由于pSClI-MS具有與MVA的TK基因同源的TKL和 TKR,所以有一定比例的MVA病毒與pSCll-MS發(fā)生重組，結(jié)果MS和LacZ閱讀框架被重組到 MVA病毒基因組中。形成如圖3C所示的MVA-MS重組病毒。以上被感染細(xì)胞培養(yǎng)三天后，收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，超聲波處理，2000rpm離心 IOmin除去細(xì)胞殘渣保留上清。取一定量上清，作為種毒，在6孔板中將病毒依次稀釋成 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6，感染tk-tsl3細(xì)胞2h。將等體積的在45°C下預(yù)溫的2%低熔點瓊 脂糖和2 X DMEM-10/BrdU (BrdU, 5-溴脲嘧啶，可被TK磷酸化，磷酸化的BrdU可摻入到野生 型MVA中，產(chǎn)生致死性突變，從而可以使野生型MVA逐漸減少)培養(yǎng)基混勻，每孔加入3ml 培養(yǎng)基，在室溫下凝固，在37°C下于含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。鋪上層選擇性培養(yǎng)基， 成分比下層瓊脂多了 1/120體積的4%X-gal。培養(yǎng)過夜，挑選藍(lán)色單斑，反復(fù)凍融三次裂 解釋放病毒，進行下一輪的篩選，步驟相同，如此進行6輪以上篩選，最后直至得到只含重 組病毒MVA-MS的克隆株。三.疫苗免疫效果1.S8疫苗免疫效果1. 1S8疫苗的免疫原性本部分實驗從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面探討生存素DNA疫苗和重組腺病毒 疫苗，以及其與IL-2質(zhì)粒共免疫誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答。實驗將C57/BL/6小鼠按表1進行分 組，1組在第0、2、4、6周注射PBS ；2-4組在第0、2、4、6周注射VR-S8疫苗及VR-IL2佐劑；5 組在第0、2、4周注射VR-S8DNA疫苗及VR-IL2佐劑，在第6周注射重組腺病毒疫苗。考察 生存素DNA單獨免疫的免疫效果、IL-2質(zhì)粒的佐劑效果，以及重組腺病毒的免疫增強作用。表1 S8疫苗免疫原性
權(quán)利要求
1.一種DNA片段S8，其特征在于所述S8的序列為SEQ ID NO :8。
2.一種重組質(zhì)粒VR-S8，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為如圖IA的VR1012，在 所述VR1012的多克隆位點中插入權(quán)利要求1所述的S8片段。
3.一種SEQ ID NO :9所示的DNA片段MS，所述片段MS包含一個含有33個拷貝的MUCl VNTR的DNA片段33M和一個權(quán)利要求1所述的S8片段。
4.一種重組質(zhì)粒VR-MS，其特征在于所述重組質(zhì)粒的骨架載體為VR1012，在所述 VR1012的多克隆位點中插入一個權(quán)利要求3中所述的MS片段。
5.一種重組腺病毒Ad-S8，其特征在于在腺病毒中插入權(quán)利要求1中所述的S8片段。
6.一種重組腺病毒Ad-MS，其特征在于在腺病毒中插入權(quán)利要求3中所述的MS片段。
7.一種重組改良安卡拉痘苗病毒MVA-MS，其特征在于在所述重組改良安卡拉痘苗病 毒中插入權(quán)利要求3中所述的MS片段。
8.權(quán)利要求1所述的S8片段或權(quán)利要求3中所述的MS片段在制備用于進行抗腫瘤免 疫的蛋白疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗或樹突狀細(xì)胞疫苗中的用途。
9.權(quán)利要求8中所述的用途，其中所述疫苗中還包含免疫佐劑。
10.權(quán)利要求8中所述的用途，其中所述疫苗中還包含化療藥物。
全文摘要
本發(fā)明為以粘蛋白1和生存素為靶點的腫瘤DNA疫苗及病毒載體疫苗。本發(fā)明涉及腫瘤DNA疫苗和病毒載體疫苗領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及重組DNA載體VR-S8和VR-MS、重組腺病毒Ad-S8和Ad-MS及重組痘病毒MVA-MS疫苗，以及DNA疫苗和病毒載體疫苗以及病毒載體疫苗之間免疫方式的優(yōu)化組合在制備抗腫瘤疫苗中的用途。
文檔編號C12N7/01GK102086453SQ20091025242
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月4日
發(fā)明者于永慧, 于湘暉, 孔維, 張海紅 申請人:長春百克生物科技股份公司