用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、dna和肽聚糖的吸附劑和制備方法及用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑，該吸附劑由苦柯胺B連接在具有良好血液相容性的載體的表面。該吸附劑可有效的從人體血液中吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖，從而達(dá)到清除誘發(fā)膿毒癥的病原體相關(guān)分子的目的，發(fā)揮治療膿毒癥的作用，具有重要的臨床價(jià)值。
【專利說明】用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑和制備方法及用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑和制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002]膿毒癥是感染引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征。膿毒癥的發(fā)生是由于病原體侵入人體后，病原體含有的病原體相關(guān)分子被機(jī)體天然免疫系統(tǒng)中的模式識(shí)別受體識(shí)別，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)細(xì)胞活化，釋放大量炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，造成組織器官損傷甚至死亡。導(dǎo)致膿毒癥的病原體90%以上為細(xì)菌，而細(xì)菌所含的病原體相關(guān)分子主要包括細(xì)菌內(nèi)毒素(脂多糖)、DNA和肽聚糖等。因此，若能夠拮抗這些致病因子就能對(duì)膿毒癥取得良好的治療效果。多年來，人們針對(duì)上述病原體相關(guān)分子開發(fā)了許多拮抗劑，如多粘菌素B、類脂A單克隆抗體、殺菌/通透性增加蛋白等，但是均未取得成功或仍處于研究階段。
[0003]近年來,血液凈化治療被認(rèn)為有望成為膿毒癥新的治療手段。該療法的原理是利用特定的吸附劑對(duì)患者血液進(jìn)行灌流，以吸附和除去患者血中的病原體相關(guān)分子，發(fā)揮治療作用。目前，最常見的吸附劑是將可吸附細(xì)菌內(nèi)毒素的藥物多粘菌素B連接在一定的載體上而制成。比如，日本研究者將多粘菌素B通過共價(jià)結(jié)合連接在纖維素載體上制成細(xì)菌內(nèi)毒素吸附劑(商品名Toraymyxin)，已在日本(1994年)和歐洲(2002年)上市，并正在美國開展III期臨床試驗(yàn)。臨床研究結(jié)果顯示，在常規(guī)治療基礎(chǔ)上使用Toraymyxin能夠一定程度改善腹腔內(nèi)革蘭氏陰性菌感染所致的重癥膿毒癥或膿毒性休克患者的血流動(dòng)力學(xué)和器官功能障礙，并降低 28 天死亡率(Cruz DN, Antonelli M, Fumagalli R, et al.Early useof polymyxin B hemoperfusion in abdominal septic shock:the EUPHAS randomizedcontrolled trial.JAMA.2009; 301 (23): 2445-2452.)。此外，中國發(fā)明專利 ZL03144383.4公布了一種以天然或合成高分子材料為載體，二甲基胺為配體制成的細(xì)菌內(nèi)毒素吸附劑。中國發(fā)明專利ZL 200710012501.1公布了一種以瓊脂糖凝膠為載體，偶聯(lián)季銨鹽陽離子和疏水分子的細(xì)菌內(nèi)毒素吸附劑。中國發(fā)明專利201110113987.4公布了一種以分子簇為功能基的細(xì)菌內(nèi)毒素吸附劑。
[0004]但是，上述吸附劑僅能吸附細(xì)菌內(nèi)毒素，不能同時(shí)有效吸附細(xì)菌DNA和肽聚糖。而在由細(xì)菌感染引發(fā)的膿毒癥中，細(xì)菌DNA和肽聚糖同內(nèi)毒素一樣也是分布廣、毒力強(qiáng)的病原體相關(guān)分子，上述吸附劑只清除細(xì)菌內(nèi)毒素，細(xì)菌DNA和肽聚糖仍殘留血中，不足以完全解決膿毒癥的根源問題，這是目前有報(bào)道(王亮，馬曉春.固定多粘菌素B纖維灌流器吸附內(nèi)毒素的研究進(jìn)展.中國血液凈化，2010，9:451-453.)稱其臨床療效仍然有限的重要原因。
[0005]中國發(fā)明專利201010156503.X公布了苦柯胺B用于制備預(yù)防和治療膿毒癥及自身免疫性疾病藥物的用途。已有的研究結(jié)果(Liu X, Zheng X，Wang N, et al.KukoamineB，a novel dual inhibitor of LPS and CpG DNAj is a potential candidate for sepsistreatment.Br J Pharmacol.2011; 162 (6):1274-1290.)顯示，苦柯胺 B 在膿毒癥模型動(dòng)物體內(nèi)對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素和DNA均具有良好的中和作用，能夠顯著改善各項(xiàng)病理生理指標(biāo)，降低死亡率。盡管苦柯胺B通過體內(nèi)靜脈給藥的方式進(jìn)行治療可取得較好效果，但仍然不能制備成可同時(shí)有效吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑并用于膿毒癥血液凈化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有吸附劑只能吸附細(xì)菌內(nèi)毒素的問題，提供一種用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑，該吸附劑可同時(shí)吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖。采用動(dòng)物血液進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明該吸附劑可有效的從血中吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖，從而達(dá)到清除誘發(fā)膿毒癥的病原體相關(guān)分子的目的，發(fā)揮治療膿毒癥的作用，具有重要的臨床價(jià)值。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0008]用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑，將苦柯胺B通過共價(jià)結(jié)合連接在具有良好血液相容性的載體的表面。
[0009]所述載體為瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素、聚苯乙烯中的任意一種。
[0010]吸附劑中苦柯胺B與載體的質(zhì)量比為1:0.001?0.01。
[0011]上述吸附劑的制備方法，有以下步驟:
[0012]I)有機(jī)溶劑中活化載體，洗滌、抽濾至干；
[0013]2)取苦柯胺B溶于50ml 0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)步驟I)活化的載體混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)，用超純水洗滌，抽濾至干，得到用于清除膿毒癥致病因子的吸附劑。
[0014]當(dāng)載體為聚苯乙烯時(shí)，苦柯胺B與活化的載體混合振蕩反應(yīng)后，用超純水洗滌，抽濾至干；將硼氫化鈉溶于IOml 0.1M的磷酸緩沖液(pH=7.4)，加入抽干的固體物中，25°C振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用超純水洗滌，抽濾至干，得到用于清除膿毒癥致病因子的吸附劑。
[0015]步驟I)所述的有機(jī)溶劑為環(huán)氧氯丙烷或戊二醛。
[0016]瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素載體的活化方法是:取載體，洗滌，抽濾至干，加入0.5M NaOH溶液10ml、環(huán)氧氯丙烷10ml，40°C振蕩反應(yīng)5小時(shí)。
[0017]聚苯乙烯載體活化的方法是:取氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40°C反應(yīng)2小時(shí)。
[0018]本發(fā)明所述吸附劑在用于制備血液凈化治療的吸附劑中的用途。
[0019]當(dāng)苦柯胺B連接瓊脂糖凝膠時(shí)，得到瓊脂糖凝膠一苦柯胺B吸附劑，其中每克載體連接有3.00?5.0Omg苦柯胺B。
[0020]當(dāng)苦柯胺B連接聚乙烯醇時(shí)，得到聚乙烯醇一苦柯胺B吸附劑，其中每克載體連接有3.00?5.0Omg苦柯胺B。
[0021]當(dāng)苦柯胺B連接纖維素時(shí)，得到纖維素一苦柯胺B吸附劑，其中每克載體連接有
5.00 ?10.0Omg 苦柯胺 B。
[0022]當(dāng)苦柯胺B連接聚苯乙烯時(shí)，得到聚苯乙烯一苦柯胺B吸附劑，其中每克載體連接有3.00?5.0Omg苦柯胺B。
[0023]所述吸附劑的使用方法:將含有細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的血液與吸附劑相接觸進(jìn)行灌流，從而吸附其中的細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖。[0024]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
[0025](I)苦柯胺B可與瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素或聚苯乙烯載體連接制成吸附劑；
[0026](2)制備的吸附劑能夠分別或者同時(shí)有效地吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖。
[0027]細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖是導(dǎo)致膿毒癥最主要的病原體相關(guān)分子，從患者體內(nèi)吸附這些分子從而達(dá)到清除致病因子的目的對(duì)膿毒癥的治療十分重要。本發(fā)明所述吸附劑不同于以往研制的僅能吸附細(xì)菌內(nèi)毒素一種病原體相關(guān)分子的吸附劑，它能夠同時(shí)吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖，且吸附效果良好。因此，本發(fā)明所述吸附劑能夠?qū)⒄T發(fā)膿毒癥最主要的病原體相關(guān)分子一細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖均有效的從血液中除去，克服了現(xiàn)有吸附劑僅有單一清除作用的缺點(diǎn)，從根源上解決了膿毒癥的發(fā)病問題，為膿毒癥血液凈化治療提供了一種更好的吸附劑。
[0028]本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解，除本發(fā)明優(yōu)選的四種載體外，還有更多載體可與苦柯胺B連接。本領(lǐng)域的技術(shù)人員亦可理解，本發(fā)明所述的吸附劑除可用于人的血液凈化治療外，也可以極其相似的方式用于從其他含有細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的生物流體，如蛋白質(zhì)溶液、動(dòng)物血液、生物試劑中除去這些有害分子。應(yīng)當(dāng)說明，如果不脫離本發(fā)明的精神和范圍一在載體上連接苦柯胺B用于吸附細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖一對(duì)本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換的，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍當(dāng)中。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說明，特別優(yōu)選瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素和聚苯乙烯四種不同類型的載體進(jìn)行說明。應(yīng)當(dāng)理解，以下所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，其不以任何形式限制本發(fā)明。
[0030]細(xì)菌內(nèi)毒素是指Escherichia coli 0111:B4來源的內(nèi)毒素，購于Sigma-Aldrich ；
[0031]細(xì)菌DNA (CpG ODN 1826)，購于生工生物；
[0032]細(xì)菌肽聚糖(胞壁酰二肽)，購于InvivoGen。
[0033]實(shí)施例1:瓊脂糖凝膠一苦柯胺B吸附劑的制備
[0034]1.1實(shí)驗(yàn)方法:瓊脂糖凝膠選用Sepharose CL-4B,購自GE Healthcare。取Sepharose CL-4B瓊脂糖凝膠20ml,用超純水洗漆,抽濾至干。取抽干后的凝膠4g,加入
0.5M NaOH溶液10ml、環(huán)氧氯丙烷10ml，40°C振蕩反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干。取IOOmg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖凝膠混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干(濾液全部收集)，得瓊脂糖凝膠一苦柯胺B吸附劑。對(duì)收集的濾液，采用高效液相色譜法(色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相:0.1%三氟乙酸/乙腈=20/80 ;檢測(cè)波長:280nm)測(cè)定濾液中苦柯胺B的量。同時(shí)，取IOOmg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO3溶液中，與未經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的瓊脂糖凝膠混合，作為對(duì)照組，同法進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)完畢后采用高效液相色譜法(色譜條件同前)測(cè)定濾液中苦柯胺B的量。
[0035]1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:對(duì)照組中，苦柯胺B反應(yīng)前后的量基本一致，說明本反應(yīng)不影響苦柯胺B的穩(wěn)定性，且未活化的瓊脂糖凝膠對(duì)苦柯胺B幾乎沒有結(jié)合作用。因此，將反應(yīng)前投入苦柯胺B的量與最終濾液中苦柯胺B的量相減即可準(zhǔn)確反映載體上連接的苦柯胺B的量，計(jì)算公式如下:
[0036]苦柯胺B固載量=(反應(yīng)前投入苦柯胺B質(zhì)量一濾液中苦柯胺B含量X濾液體積)+載體質(zhì)量
[0037]經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，苦柯胺B 固載量=(IOOmg — 0.68mg/ml X 122ml)/4g=4.26mg/g,即每克載體連接有4.26mg苦柯胺B。
[0038]實(shí)施例2:聚乙烯醇一苦柯胺B吸附劑的制備
[0039]2.1實(shí)驗(yàn)方法:聚乙烯醇一苦柯胺B吸附劑的制備原理與瓊脂糖凝膠一苦柯胺B吸附劑相似。聚乙烯醇購自Sigma-Aldrich。將5g聚乙烯醇溶于超純水中，配制成濃度為10%的水溶液，置90°C恒溫水浴中攪拌至完全溶解，然后于-20°C冷凍24小時(shí)，取出后于室溫下解凍4小時(shí)，如此反復(fù)冷凍、融化3次，得到聚乙烯醇水凝膠。將凝膠抽濾至干，取其中4g凝膠，加入0.5M NaOH溶液10ml、環(huán)氧氯丙烷10ml，50°C振蕩反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干。取IOOmg苦柯胺B，溶于50ml0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的聚乙烯醇水凝膠混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干，得聚乙烯醇一苦柯胺B吸附劑?？嗫掳稡固載量的計(jì)算方法同實(shí)施例1。
[0040]2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，苦柯胺B固載量為3.6mg/g。
[0041]實(shí)施例3:纖維素一苦柯胺B吸附劑的制備
[0042]3.1實(shí)驗(yàn)方法:纖維素一苦柯胺B吸附劑的制備原理與瓊脂糖凝膠一苦柯胺B吸附劑相似。纖維素購自Sigma-Aldrich。取纖維素5g,加入0.5M NaOH溶液10ml、環(huán)氧氯丙烷10ml，40°C振蕩反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌、抽濾至干。取200mg苦柯胺B，溶于IOOml 0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)環(huán)氧氯丙烷活化的纖維素混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌、抽濾至干，得纖維素一苦柯胺B吸附劑?？嗫掳稡固載量的計(jì)算方法同實(shí)施例1。
[0043]3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，苦柯胺B固載量為6.3mg/g。
[0044]實(shí)施例4:聚苯乙烯一苦柯胺B吸附劑的制備
[0045]4.1實(shí)驗(yàn)方法:氨甲基化聚苯乙烯購自Sigma-Aldrich。取5g氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40°C反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干。取200mg苦柯胺B，溶于IOOml 0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)戊二醛活化的氨甲基化聚苯乙烯混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干。然后將0.4g硼氫化鈉溶于IOml
0.1M的磷酸緩沖液(pH=7.4)，加入抽干的固體物中，25°C振蕩反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完畢，用超純水洗滌，抽濾至干，得聚苯乙烯一苦柯胺B吸附劑。苦柯胺B固載量的計(jì)算方法同實(shí)施例1o
[0046]4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:經(jīng)檢測(cè)和計(jì)算，苦柯胺B固載量為4.09mg/g。
[0047]實(shí)施例5:吸附劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附能力測(cè)試
[0048]5.1實(shí)驗(yàn)方法:將一定量的細(xì)菌內(nèi)毒素溶于大鼠血漿中，配制成含細(xì)菌內(nèi)毒素5EU/ml的血漿溶液。取血漿溶液IOml，加入Ig吸附劑，并以空白載體(未連接苦柯胺B)為對(duì)照組，37°C振蕩反應(yīng)60分鐘，離心，檢測(cè)上清中細(xì)菌內(nèi)毒素的量。檢測(cè)方法采用動(dòng)態(tài)濁度法(鱟試驗(yàn))，具體實(shí)驗(yàn)方法參照中國藥典(二部)附錄XI E細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和文獻(xiàn)“衛(wèi)國，鄭江.細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)的影響因素分析及對(duì)策.局解手術(shù)學(xué)雜志，2003,12:215-216.”。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。血漿中細(xì)菌內(nèi)毒素的初始量減去吸附后的剩余量即為被吸附的量，被吸附的量除以吸附劑用量即為吸附量。
[0049]5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果:空白載體對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素沒有吸附作用，連接有苦柯胺B的吸附劑則具有較好的吸附作用，吸附量如表1所示。
[0050]表1四種吸附劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素的吸附效果
[0051]
【權(quán)利要求】
1.一種用于清除細(xì)菌內(nèi)毒素、DNA和肽聚糖的吸附劑，其特征在于:該吸附劑是將苦柯胺B通過共價(jià)結(jié)合連接在具有良好血液相容性的載體的表面。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于:所述載體為瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素、聚苯乙烯中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的吸附劑，其特征在于:吸附劑中苦柯胺B與載體的質(zhì)量比為I:0.0Ol ?0.01。
4.權(quán)利要求1?3任一所述吸附劑的制備方法，其特征在于，有以下步驟: 1)有機(jī)溶劑中活化載體，洗滌、抽濾至干； 2)取苦柯胺B溶于50ml0.1M NaHCO3溶液中，與經(jīng)步驟I)活化的載體混合，25°C振蕩反應(yīng)24小時(shí)，用超純水洗滌，抽濾至干，得到用于清除膿毒癥致病因子的吸附劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:當(dāng)載體為聚苯乙烯時(shí)，苦柯胺B與活化的載體混合振蕩反應(yīng)后，用超純水洗滌，抽濾至干；將硼氫化鈉溶于IOml0.1M pH=7.4的磷酸緩沖液，加入抽干的固體物中，25°C振蕩反應(yīng)2小時(shí)，用超純水洗滌，抽濾至干，得到用于清除膿毒癥致病因子的吸附劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:步驟I)所述的有機(jī)溶劑為環(huán)氧氯丙烷或戊二醛。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，瓊脂糖凝膠、聚乙烯醇、纖維素載體的活化方法是:取載體，洗滌，抽濾至干，加入0.5M NaOH溶液10ml、環(huán)氧氯丙烷10ml，40°C振蕩反應(yīng)5小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，聚苯乙烯載體活化的方法是:取氨甲基化聚苯乙烯，加入25%的戊二醛溶液5ml，40°C反應(yīng)2小時(shí)。
9.權(quán)利要求1?3任意所述吸附劑在用于制備膿毒癥血液凈化治療的吸附劑中的用途。
【文檔編號(hào)】B01J20/30GK103769060SQ201410032526
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】鄭玥 申請(qǐng)人:鄭玥