專利名稱：肽的綴合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肽的翻譯后綴合的新方法。所述的綴合的肽具有改變的特征，因而可以用于治療用途，或者它們可以簡化所述肽的分析或分離和純化。
背景技術：
眾所周知，通過將能適當?shù)馗淖冸牡男再|的基團綴合到肽上，可以改變肽的性質和特征。這樣的綴合一般需要肽中的一些官能團與綴合基團中的另一種官能團反應。典型地，已經(jīng)將氨基(例如賴氨酸中的N-末端氨基或ε-氨基)與合適的酰化劑組合使用。經(jīng)常需要或要求能控制綴合反應，即控制綴合化合物的綴合位置和控制綴合多少綴合基團。這經(jīng)常稱作特異性。
本發(fā)明的一個目的是，提供可以以高度的特異性綴合肽的方法。概括地，該方法采用能將包含合適的官能團的化合物整合進肽的C-末端的酶，其中所述的官能團隨后用作綴合位點。
以前已經(jīng)描述了羧肽酶修飾肽的C-末端的應用。WO 92/05271公開了羧肽酶和親核化合物酰胺化C-末端羧基的應用，WO 98/38285公開了特別適用于該目的的羧肽酶Y的變體。
在文獻中，已經(jīng)充分地描述了PEG或基于PEG的鏈的接枝。作為實例，US 5,739,208公開了具有可以與存在于肽中的硫羥基反應的砜基的PEG的應用。
EP 605 963公開了可以與蛋白上的醛基形成肟連接的水性聚合物的接枝。天然的氨基酸都不包含醛，因而羥基必需被氧化，作為綴合過程的第一步。
EP 243 929公開了羧肽酶將多肽、報告基團或細胞毒性試劑整合進蛋白或多肽的C-末端的應用。
發(fā)明簡述本發(fā)明人已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，酶(例如羧肽酶)可以用于在肽的C-末端中整合進包含一個或多個在肽中不可接近的官能團的第一種化合物，形成轉?；幕衔?，且該轉?；幕衔镫S后可以與包含一個或多個能與第一種化合物的官能團反應、但是不能與肽中可接近的其它官能團反應的官能團的另一種化合物反應。這樣的方法能提供高度的特異性，因為選擇的該酶僅僅催化在C-末端的整合，且選擇的2種官能團僅僅彼此反應，而不與肽中可接近的其它官能團反應。這樣，綴合基團僅僅綴合在一個位置，且通過選擇官能團，可以控制綴合的基團的數(shù)量。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供了綴合肽的方法，所述的方法包含下述步驟i)在一個或多個步驟中，使肽與攜帶一個或多個在任何構成所述肽的氨基酸中不可接近的官能團的第一種化合物反應，該反應在有能催化將所述的第一種化合物整合進所述肽的C-末端、形成轉?；碾牡拿复嬖诘那闆r下進行，和ii)在一個或多個步驟中，使所述的轉?；碾呐c包含一個或多個官能團的第二種化合物反應，其中所述的官能團不能與在構成所述肽的氨基酸殘基中的可接近的官能團反應，且其中所述的第二種化合物中的所述官能團能與所述的第一種化合物中的所述官能團反應，從而形成所述的轉酰化的肽和所述的第二種化合物之間的共價鍵。
本發(fā)明的另一個目的是，提供通過本發(fā)明的方法綴合的肽。
本發(fā)明的另一個目的是，提供以使它們更好地適用于本發(fā)明的方法的方式修飾的肽。
本發(fā)明的另一個目的是，提供適用于本發(fā)明的方法中的試劑和酶。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過本發(fā)明的方法綴合的肽在治療中的用途。
本發(fā)明的另一個目的是，提供包含通過本發(fā)明的方法綴合的肽的組合物，例如藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是，提供治療疾病的治療方法，包含施用根據(jù)本發(fā)明的方法制備的綴合的肽。
本發(fā)明的另一個目的是，提供根據(jù)本發(fā)明的方法制備的綴合的肽在生產藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個目的是，提供通過根據(jù)本發(fā)明的方法綴合肽，而改善所述肽的性質的方法。
定義在本文中，術語“轉?；币庠诒硎具@樣的反應，其中離去基團被交換為親核體，其中親核體應當理解為多電子的試劑，其傾向于攻擊碳的核。轉肽作用是轉?；囊粋€實例。
在本文中，術語“不可接近的”意在表示某物不存在或事實上不存在，含義是不能達到它。當聲稱官能團在要綴合的肽中不可接近時，意在表示所述的官能團在該肽中不存在，或者如果存在，其被以某些方式阻止參與反應。作為實例，所述的官能團可以深埋在肽的結構中，從而它被屏蔽而不能參與反應。已經(jīng)認可，官能團是否可接近，取決于反應條件?？梢灶A見，在有變性劑存在的情況下或在升高的溫度下，肽會解折疊，從而暴露出否則會不可接近的官能團。應當理解，“不可接近的”是指“在為特定的目標反應選擇的反應條件下不可接近的”。
在本文中，術語“肟鍵”意在表示式-C＝N-O-的部分。
在本文中，術語“腙鍵”意在表示式-C＝N-N-的部分。
在本文中，術語“苯腙鍵”意在表示下式的部分 在本文中，術語“縮氨基脲鍵”意在表示式-C＝N-N-C(O)-N-的部分。
術語“烷烴”意在表示飽和的、線性的、分支的和/或環(huán)狀的烴。除非用其它的碳原子數(shù)目說明，該術語意在表示具有1-30個(包含兩個端點)碳原子的烴，例如1-20(包含兩個端點)，例如1-10(包含兩個端點)，例如1-5(包含兩個端點)。術語烷基和亞烷基分別指對應的基團和雙基。
術語“烯烴”意在表示線性的、分支的和/或環(huán)狀的包含至少一個碳-碳雙鍵的烴。除非用其它的碳原子數(shù)目說明，該術語意在表示具有2-30個(包含兩個端點)碳原子的烴，例如2-20(包含兩個端點)，例如2-10(包含兩個端點)，例如2-5(包含兩個端點)。術語烯基和亞烯基分別指對應的基團和雙基。
術語“炔烴”意在表示線性的、分支的和/或環(huán)狀的包含至少一個碳-碳三鍵的烴，且其可以任選地包含一個或多個碳-碳雙鍵。除非用其它的碳原子數(shù)目說明，該術語意在表示具有2-30個(包含兩個端點)碳原子的烴，例如2-20(包含兩個端點)，例如2-10(包含兩個端點)，例如2-5(包含兩個端點)。術語炔基和亞炔基分別指對應的基團和雙基。
術語“同素環(huán)芳族化合物”意在表示芳香烴，例如苯和萘。
術語“雜環(huán)化合物”意在表示包含5，6或7個環(huán)原子的環(huán)狀化合物，其中的1，2，3或4個環(huán)原子是選自N，O和/或S的雜原子。實例包括雜環(huán)芳族化合物，例如噻吩，呋喃，吡喃，吡咯，咪唑，吡唑，異噻唑，異唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，噠嗪，以及它們的部分或完全氫化的等同物，例如哌啶，吡唑烷(pirazolidine)，吡咯烷，吡咯啉(pyroline)，咪唑烷，咪唑啉，哌嗪和嗎啉。
術語“雜烷烴”、“雜烯烴”和“雜炔烴”意在表示如上定義的烷烴、烯烴和炔烴，其中所述部分的結構中已經(jīng)插入了一個或多個雜原子或基團。雜基團和原子的實例包括-O-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-C(O)-，-C(S)-和-N(R*)-，其中R*代表著氫或C1-C6-烷基。雜烷烴的實例包括
術語“基團”或“雙基”意在表示這樣的化合物，其中已經(jīng)分別去除了1個或2個氫原子。當特別說明時，基團也可以表示通過從化合物中形式上去除更大的原子基團(例如羥基)而形成的部分。
術語“鹵素”意在表示元素周期表的第7主族中的成員，即F，Cl，Br和I。
術語“PEG”意在表示分子量為500至150,000Da的聚乙二醇，包括其類似物，其中例如末端OH-基團已經(jīng)被替換為甲氧基(稱作mPEG)。
在本文中，詞“肽”和“蛋白”可互換地使用，意在表示相同的內容。術語“肽”意在表示具有2個或更多個通過肽鍵連接的氨基酸殘基的化合物。氨基酸可以是天然的或非天然的。該術語也意在包括被其它的肽、糖類、脂類或其它有機化合物取代的所述化合物，以及其中已經(jīng)化學地修飾了一個或多個氨基酸殘基的化合物和包含輔基的肽。
在本文中，術語“芳基”意在表示碳環(huán)的芳香環(huán)基團或稠合的芳香環(huán)系統(tǒng)基團，其中至少一個環(huán)是芳族的。典型的芳基包括苯基，聯(lián)苯基，萘基，等。
如本文使用的，單獨地或組合地使用，術語“雜芳基”指具有例如5-7個主原子的芳香環(huán)基團，或具有例如7-18個主原子的稠合的芳香環(huán)系統(tǒng)基團，其中至少一個環(huán)是芳族的，其含有一個或多個選自氮、氧或硫雜原子的雜原子作為環(huán)原子，其中N-氧化物和一氧化硫和二氧化硫是允許的雜芳族取代。實例包括呋喃基，噻吩基，苯硫基(thiophenyl)，吡咯基，咪唑基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，唑基，異唑基，二唑基，噻二唑基，異噻唑基，吡啶基，噠嗪基，吡嗪基，嘧啶基，喹啉基，異喹啉基，苯并呋喃基，苯并苯硫基(benzothiophenyl)，吲哚基，和吲唑基，等。
術語“綴合物”意在表示修飾的肽，即具有結合于其上以用于修飾所述肽的性質的部分的肽。術語“綴合”意在表示將部分結合到肽上以修飾所述肽的性質的過程。
如本文使用的，術語“前藥”表示可生物水解的酰胺和可生物水解的酯，也包括a)化合物，其中將這樣的前藥中的可生物水解的官能度包含在根據(jù)本發(fā)明的化合物中，和b)化合物，其可以在給定的官能團處被生物地氧化或還原，生成根據(jù)本發(fā)明的藥物。這些官能團的實例包括1，4-二氫吡啶，N-烷基羰基-1，4-二氫吡啶，1，4-環(huán)己二烯，叔丁基，等。
如本文使用的，術語“可生物水解的酯”是藥物(in casu，根據(jù)本發(fā)明的化合物)的酯，其a)不會妨礙親本物質的生物學活性，但是能賦予該物質有利的體內性質，例如作用的持續(xù)時間，作用的開始等，或b)是生物學上無活性的，但是能被受試者在體內容易地轉化成生物學上有活性的要素。優(yōu)點是，例如提高的溶解度，或者可以從腸經(jīng)口地吸收可生物水解的酯，并在血漿中轉化成根據(jù)本發(fā)明的化合物。許多這樣的實例是本領域已知的，包括作為實例的低級烷基酯(例如，C1-C4)，低級酰氧基烷基酯，低級烷氧基酰氧基烷基酯，烷氧基酰氧基酯，烷基酰氨基烷基酯，和膽堿酯。
如本文使用的，術語“可生物水解的酰胺”是藥物(in casu，根據(jù)本發(fā)明的化合物)的酰胺，其a)不會妨礙親本物質的生物學活性，但是能賦予該物質有利的體內性質，例如作用的持續(xù)時間，作用的開始等，或b)是生物學上無活性的，但是能被受試者在體內容易地轉化成生物學上有活性的要素。優(yōu)點是，例如提高的溶解度，或者可以從腸經(jīng)口地吸收可生物水解的酰胺，并在血漿中轉化成根據(jù)本發(fā)明的化合物。許多這樣的實例是本領域已知的，包括作為實例的低級烷基酰胺，α-氨基酸酰胺，烷氧基?；０罚屯榛被榛驶０?。
在本文中，術語“藥學上可接受的鹽”意在表示對患者無害的鹽。這樣的鹽包括藥學上可接受的酸加成鹽，藥學上可接受的金屬鹽，銨鹽和烷基化的銨鹽。酸加成鹽包括無機酸和有機酸的鹽。合適的無機酸的代表性的實例包括鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，磷酸，硫酸，硝酸等。合適的有機酸的代表性的實例包括甲酸，醋酸，三氯乙酸，三氟乙酸，丙酸，安息香酸，肉桂酸，檸檬酸，富馬酸，乙醇酸，乳酸，馬來酸，蘋果酸，丙二酸，扁桃酸，草酸，苦味酸，丙酮酸，水楊酸，琥珀酸，甲磺酸，乙磺酸，酒石酸，抗壞血酸，pamoic acid，二亞甲基水楊酸，乙二磺酸，葡糖酸，檸康酸，天冬氨酸，硬脂酸，棕櫚酸，EDTA，乙醇酸，對氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，對甲苯磺酸等。藥學上可接受的無機或有機酸加成鹽的其它實例包括J.Pharm.Sci.1977，66，2中列出的藥學上可接受的鹽，該文獻在這里引作參考。金屬鹽的實例包括鋰、鈉、鉀、鎂鹽等。銨鹽和烷基化的銨鹽的實例包括銨，甲基銨，二甲基銨，三甲基銨，乙基銨，羥乙基銨，二乙基銨，丁基銨，四甲基銨鹽等。
如本文所使用的，化合物的″治療有效量″是指足以治愈、減輕或部分地阻止指定疾病及其并發(fā)癥的臨床表現(xiàn)的量。將足以實現(xiàn)該目的的量定義為″治療有效量″。對于每個目的的有效量，取決于疾病或損傷的嚴重性以及受試者的重量和一般狀況。應當理解，使用常規(guī)實驗，通過構建數(shù)值的矩陣和測試矩陣中的不同點，可以確定適當?shù)膭┝?，這都在受過訓練的醫(yī)生或獸醫(yī)的普通技能范圍內。
如本文所使用的，術語“治療”是指為了抵抗狀況(例如疾病或障礙)而處理和護理患者。該術語意在包括患者患有的指定狀況的全部治療，例如施用有活性的化合物來減輕癥狀或并發(fā)癥，延遲疾病、障礙或狀況的進展，減輕或緩解癥狀和并發(fā)癥，和/或治愈或消除疾病、障礙或狀況以及預防狀況，其中預防應當理解成，為了抵抗疾病、狀況或障礙而處理和護理患者，且包括施用有活性的化合物，以預防癥狀或并發(fā)癥的發(fā)作。待治療的患者優(yōu)選地是哺乳動物，尤其是人類，但是它也可以包括動物，例如狗、貓、奶牛、綿羊和豬。
發(fā)明詳述原則上，能催化化合物向肽中的整合的任何酶都可以用于本發(fā)明的方法中。作為實例，有用的酶包括羧肽酶，其構成一組屬于分類組E.C.3.4.16，3.4.17和3.4.18的肽水解酶。由所述的酶催化的體內反應是C-末端氨基酸殘基的水解。已知了各種不同的羧肽酶，它們在能剪切的末端氨基酸殘基方面有所不同。在催化周期的過程中，會形成酶-底物復合物，其在正常的體內條件下，會受到水分子的親核攻擊，這最終導致肽鍵的水解。但是，在本發(fā)明的方法中，加入了親核試劑，其可以與作為親核體的水競爭。而且，通過在溶劑或水性溶劑中進行反應，可以減少水活度。在本發(fā)明的方法中，所述的親核體能攻擊酶-底物復合物，最終形成轉?；幕衔?。除了是親核體以外，所述的試劑還必須包含一個或多個在要綴合的肽中不可接近的官能團。
可以應用在本發(fā)明的方法中的其它酶包括胰蛋白酶。
肽和親核體的反應，能提供轉酰化的肽，其中C-末端氨基酸殘基已經(jīng)與親核化合物互換，后者包含一個或多個在要綴合的肽中不可接近的官能團。該反應(或這系列反應)的總結果是，一個或多個官能團向肽中的整合，其僅僅存在于肽中的一個位置。該轉酰化的肽與包含要綴合到肽上的部分和一個或多個官能團(其僅僅與在轉?；磻刑砑拥诫纳系墓倌軋F反應)的化合物的隨后的反應(或系列反應)，能實現(xiàn)要綴合的肽的選擇性綴合。
與利用已經(jīng)存在于肽中的官能團(例如賴氨酸的N-末端氨基或ε-氨基)的其它綴合方法相比，本發(fā)明的方法能提供提高的選擇性的優(yōu)點。一個或多個在肽中不可接近的官能團的整合，能確保綴合僅僅發(fā)生在特定的位置。
如以前提到的，在本發(fā)明的方法中可以使用能催化化合物向肽中的整合的任何酶，尤其羧肽酶是有用的。特別有用的羧肽酶的實例是絲氨酸-類型羧肽酶，例如溶酶體的Pro-X羧肽酶(也稱作脯氨酸羧肽酶，血管緊張素酶C，溶酶體的羧肽酶C和脯氨?；入拿?，絲氨酸-類型D-Ala-D-Ala羧肽酶(也稱作D-丙氨?；?D-丙氨酸羧肽酶，DD-肽酶和DD-轉肽酶)，羧肽酶C(也稱作絲氨酸-類型羧肽酶I，組織蛋白酶A，羧肽酶Y和溶酶體的保護蛋白)和羧肽酶D(也稱作羧肽酶KEX1和羧肽酶S1)；金屬羧肽酶，例如羧肽酶A，羧肽酶B(也稱作魚精蛋白酶)，賴氨酸(精氨酸)羧肽酶(也稱作羧肽酶N)，和Gly-X羧肽酶(也稱作羧肽酶S)；和半胱氨酸-類型羧肽酶(也稱作溶酶體的羧肽酶B，組織蛋白酶B2，組織蛋白酶Iv和酸羧肽酶)。還眾所周知，可以在羧肽酶的序列中改變、添加或刪除氨基酸殘基，以修飾酶的催化性質。這樣的修飾的羧肽酶記載在，例如WO 98/38285中，其在這里引作參考。特別提及的是作為有用的酶的羧肽酶Y。
已知許多親核化合物，其可以根據(jù)本發(fā)明的方法整合進肽中，α-氨基酸是一類這樣的親核化合物。但是，為了本發(fā)明的目的，優(yōu)選地選擇親核化合物，以使形成的轉?；幕衔镒陨聿皇撬鶓玫拿傅牡孜铩Q句話說，優(yōu)選地應用能有效地阻止該酶的任何進一步反應的親核化合物。這樣的化合物的一個實例是α-氨基酸的酰胺，因為羧基酰胺化的肽不是羧肽酶的底物。
已經(jīng)認可，化合物是否是給定的酶的底物原則上取決于進行反應的條件，例如時間范圍。給定足夠的時間，許多化合物實際上是酶的底物，盡管它們在正常的條件下不是視作這樣。當在上面聲稱轉酰化的化合物自身不應當是酶的底物時，意在表示轉酰化的化合物自身不是酶的底物，達到不會干擾本發(fā)明的方法中的后繼反應的程度。如果轉?；幕衔飳嶋H上是酶的底物，可以在轉?；磻髮⒚溉コ蛲ㄟ^例如酶抑制劑失活。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及綴合肽的方法，其中在一個或多個步驟中，在有羧肽酶存在的情況下，使肽P與第一種化合物反應，后者是由下式代表的α-氨基酸酰胺 形成下式的轉?；碾?br> 在一個或多個步驟中，使所述的轉?；碾倪M一步與下式的第二種化合物反應Y-E-Z形成下式的綴合的肽 其中R代表著連接物或鍵；其中P’代表著當從肽P去除C-末端氨基酸時得到的肽；X代表著包含在構成肽P’的氨基酸殘基中不可接近的官能團的基團；Y代表著包含一個或多個官能團的基團，該官能團能與存在于X中的官能團反應，且該官能團不與在肽P’中可接近的官能團反應；E代表著連接物或鍵；A代表著由包含在X和Y中的官能團之間的反應形成的部分；且Z是要綴合到肽上的部分，其中所述的部分能減少式[a]化合物的清除，與P的清除相比。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的綴合肽的方法，其還包含將得到的綴合的肽配制到藥物組合物中的步驟。
綴合后，通過本領域眾所周知的技術，可以分離和純化綴合的肽。如果有關，也可以將綴合的肽轉化成藥學上可接受的鹽或前藥。
在X和Y的官能團之間的反應中形成的部分A，原則上可以是任意的類型，這取決于需要最終的綴合的肽的哪種性質。在一些情況下，可以希望它具有不穩(wěn)定的鍵，后者可以在某一后期階段中剪切掉，例如通過一些酶促反應或通過光解。在其它的情況下，可以希望它具有穩(wěn)定的鍵，以便得到穩(wěn)定的綴合的肽。特別提及的是，由胺衍生物和羰基之間的反應形成的部分的類型，例如肟，腙，苯腙和縮氨基脲部分。
在一個實施方案中，X和Y的官能團選自羰基，例如酮基和醛基，和氨基衍生物，例如肼衍生物 -NH-NH2，肼羧酸酯衍生物 -O-C(O)-NH-NH2，氨基脲衍生物 -NH-C(O)-NH-NH2，氨基硫脲衍生物 -NH-C(S)-NH-NH2，碳酸二酰肼衍生物 -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，卡巴肼衍生物 -NH-NH-C(O)-NH-NH2，硫代卡巴肼衍生物 -NH-NH-C(S)-NH-NH2，芳基肼衍生物 -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，和酰肼衍生物 -C(O)-NH-NH2；oxylamine衍生物，例如-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2和-NH-C(S)-O-NH2。
應當理解，如果包含在X中的官能團是羰基，則包含在Y中的官能團是胺衍生物，反之亦然。由于-NH2基團存在于大多數(shù)的肽中，因而認為如果X具有酮-或醛-官能度，則可以得到更好的選擇性。
合適的X和Y對的另一個實例是疊氮化物衍生物(-N3)和炔烴，其能反應形成三唑部分。
合適的X和Y對的另一個實例是炔烴和腈-氧化物，其能反應形成異唑烷部分。
具體地，要轉酰化的基團 可以選自2-氨基-3-氧代-丁酰胺，2-氨基-6-(4-氧代-戊?；被?-己酸酰胺，2-氨基-3-(2-氧代-2-苯基-乙基硫烷基)-丙酰胺，2-氨基-5-氧代-己酸酰胺，2-氨基-3-氧代-丙酰胺，2-氨基-6-(4-乙酰基苯甲?；被?己酸酰胺，2-氨基-3-氧代丙酸酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸酰胺，4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁?；被?己酸酰胺，3-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，2-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺，(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺和S-苯基?；腚装彼狨０贰?br> 要轉?；幕衔锖鸵c轉酰化的肽反應的化合物分別包含連接物R和E。這些連接物彼此獨立，可以不存在，或選自烷烴、烯烴或炔烴雙基和雜烷烴、雜烯烴和雜炔烴雙基，其中一個或多個任選地取代的芳族同素環(huán)雙基或雜環(huán)化合物的雙基(例如亞苯基或哌啶雙基)可以插入前述的雙基中。應當理解，所述的連接物也可以包含選自下述基團的取代羥基，鹵素，硝基，氰基，羧基，芳基，烷基和雜芳基。
E和R都代表著鍵或連接物，且在本文中，術語“連接物”意在表示分別起著將Y與Z分開和將X與NH2-C(O)-C(NH2)-分開的手段的作用的部分。連接物E和R的一個功能是，在肽和綴合的部分Z之間的連接處提供適當?shù)娜犴g性。E和R的典型實例包括直鏈的、分支的和/或環(huán)狀的C1-10烷烴、C2-10烯烴、C2-10炔烴、C1-10雜烷烴、C2-10雜烯烴、C2-10雜炔烴的雙基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基。E和R的具體實例包括

對修飾肽的需要可以源自許多原因，這也反映在可以根據(jù)本發(fā)明的方法綴合到肽上的化合物的種類中?？梢韵ＭY合肽，以改變該肽的物理-化學性質，例如提高(或降低)溶解度，以改變治療性肽的生物利用度。在另一個實施方案中，可以希望改變在體內的清除速率，例如通過將化合物綴合到肽上，所述的肽能綴合血漿蛋白例如白蛋白，或能增加肽的大小，以阻止或延遲從腎臟中排泄。在另一個實施方案中，可以希望綴合標記物，以促進肽的分析。這樣的標記物的實例包括放射性同位素，熒光標記和酶底物。在另一個實施方案中，將化合物綴合到肽上，以促進肽的分離。例如，可以將對特定的柱材料具有特異的親合力的化合物綴合到肽上。還可以希望改變肽的免疫原性，例如通過綴合肽，從而隱藏、遮蔽或掩蔽肽上的1個或多個免疫原性的表位。
具體地，本發(fā)明的方法可以用于降低清除，以便與對應的未修飾的肽相比，增加修飾的肽的血漿半衰期。術語“血漿半衰期”以它的普通含義使用，即在清除之前在血漿中存在肽的50％生物學活性的時間。替代性的術語包括血清半衰期，循環(huán)半衰期，循環(huán)的半衰期，血清清除率，血漿清除率，和清除半衰期。
與血漿半衰期一起使用的術語“增加”用于表示，與對應的未修飾的肽的半衰期相比，綴合的肽的半衰期顯著增加。例如，半衰期可以增加了至少25％，至少50％，至少100％，至少150％，至少200％或甚至至少500％。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及如上所述的綴合肽的方法，其還包含測量是否已經(jīng)實現(xiàn)了血漿半衰期的增加的步驟。
與P的清除相比，能導致式[a]化合物的清除降低的Z的具體實例包括有機部分，例如PEG或mPEG基團和其氨基衍生物；直鏈的、分支的和/或環(huán)狀的C1-22烷基，C2-22烯基，C2-22炔基，C1-22雜烷基，C2-22雜烯基，C2-22雜炔基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基，且其中所述的C1-C22或C2-C22基團可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代羥基，鹵素，羧基，雜芳基和芳基，其中所述的芳基或雜芳基可以任選地被一個或多個選自下述的取代基進一步取代羥基，鹵素，和羧基；甾族化合物基團；脂類基團；多糖基團，例如葡聚糖；聚酰胺基團例如聚氨基酸基團；PVP基團；PVA基團；聚(1-3-dioxalane)；聚(1，3，6-三烷)；乙烯/馬來酸酐聚合物；汽巴克隆染料，例如汽巴克隆藍3GA，和特定長度的聚酰胺鏈，如WO 00/12587所述，其在這里引作參考。
特別提及的是，C10-20烷基，例如C15和C17，和下式的二苯甲酮衍生物 綴合到根據(jù)本發(fā)明的肽上的PEG可以具有任意的分子量。具體地，分子量可以是500至100,000Da，例如500至60,000Da，例如1000至40,000Da，例如5000至40,000Da。具體地，在本發(fā)明中可以使用分子量為10000Da，20000Da，30000Da或40000Da的PEG。
在一個實施方案中，Z包含一個或多個已知能結合血漿蛋白(例如白蛋白)的部分。如在這里引作參考的J.Med.Chem，43，2000，1986-1992所述，可以確定化合物的結合白蛋白的能力。在本文中，如果Ru/Da大于0.05，例如大于0.10，例如大于0.12或甚至大于0.15，則將化合物定義為能結合白蛋白。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，結合白蛋白的部分是肽，例如包含小于40個氨基酸殘基的肽。在這里引作參考的J.Biol Chem.277，38(2002)35035-35043中，公開了許多作為結合白蛋白的部分的小肽。
Z可以是分支的，以便Z包含超過一個上述的標記物或基團。
式Y-E-Z的化合物的具體實例包括
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，
其中mPEG具有10kDa的分子量， 其中mPEG具有10kDa的分子量，



其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量，
其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量，
其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量， 其中mPEG具有30kDa的分子量，
其中mPEG具有20kDa的分子量， 其中mPEG具有20kDa的分子量，和 其中mPEG具有20kDa的分子量。
如上所述，羧肽酶的催化作用能造成C-末端氨基酸殘基與例如下式的化合物互換 如果需要維持要綴合的肽的完整序列，因而必需用一個氨基酸殘基來延長肽序列。這樣做的手段是本領域的技術人員眾所周知的，例如通過重組技術或通過蛋白合成方法。希望延長肽序列的另一個原因是，使肽成為現(xiàn)有的特定羧肽酶的底物。如前所述，羧肽酶之間的差異主要在于它們能剪切的氨基酸殘基的種類。因而，可能必需添加一個或多個氨基酸殘基，以使給定的肽成為給定的羧肽酶的底物。添加的氨基酸殘基可以是天然的或非天然的。
已經(jīng)認可，一些肽，例如胰島素和因子VII，包含超過一個鏈，這又意味著它們具有超過一個C-末端。在一些情況下，通過合適地選擇使用的羧肽酶，可能可以區(qū)分C-末端。在其它情況下，可能必需導入C-末端之間的差異，例如通過從一個C-末端添加或刪除一個或多個氨基酸殘基，以實現(xiàn)在存在的僅僅有限數(shù)量的C-末端處的綴合。在其它情況下，在所有的C-末端綴合肽可能是有用的。
通過本發(fā)明的方法可以綴合任意的肽，例如酶，肽激素，生長因子，抗體，細胞因子，受體，淋巴因子和疫苗抗原，特別提及的是治療性肽，例如胰島素，胰高血糖素樣-肽1(GLP-1)，胰高血糖素樣-肽2(GLP-2)，生長激素，細胞因子，三葉因子肽(trefoil factorpeptide)(TFF)，肽黑皮質素受體修飾劑和因子VII化合物。
特別適用的胰島素是人胰島素。在本文中，術語“人胰島素”指天然產生的胰島素或重組產生的胰島素。在任何合適的宿主細胞中，可以生產重組的人胰島素，例如宿主細胞可以是細菌、真菌(包括酵母)、昆蟲、動物或植物細胞。文獻中已經(jīng)公開了許多胰島素化合物，它們也特別可用于本發(fā)明的方法中?！耙葝u素化合物”(和有關的表述)是指其中已經(jīng)刪除了和/或用其它的氨基酸(包括非可編碼的氨基酸)替換了一個或多個氨基酸的人胰島素，和/或包含額外的氨基酸(即超過51個氨基酸)的人胰島素，和/或其中至少一個有機取代基結合到一個或多個氨基酸上的人胰島素。
提及了下面的專利文件，作為特別適用于本發(fā)明提供的方法的胰島素化合物的公開內容。
WO 97/31022(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的活性特性的胰島素化合物，其中B-鏈的N-末端氨基酸的氨基和/或 LysB29的ε-氨基具有包含親脂取代基的羧酸。特別提及的是，NεB29-(CO-(CH2)14-COOH)人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)18-COOH)人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)；NεB29-(CO-(CH2)22-COOH)人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)14-COOH)AspB28-人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)AspB28-人胰島素；N-εB29-(CO-(CH2)18-COOH)AspB28-人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)AspB28-人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)22-COOH)AspB28-人胰島素；NεB30-(CO-(CH2)14-COOH)ThrB29LysB30-人胰島素；NεB30-(CO-(CH2)16-COOH)ThrB29LysB30-人胰島素；NεB30-(CO-(CH2)18-COOH)ThrB29LysB30-人胰島素；NεB30-(CO-(CH2)20-COOH)ThrB29LysB30-人胰島素；NεB30-(CO-(CH2)22-COOH)ThrB29LysB30-人胰島素；NεB28-(CO-(CH2)14-COOH)LysB28ProB29-人胰島素；NεB28-(CO-(CH2)16-COOH)LysB28ProB29-人胰島素；NεB28-(CO-(CH2)18-COOH)LysB28ProB29-人胰島素；NεB28-(CO-(CH2)20-COOH)LysB28ProB29-人胰島素；NεB28-(CO-(CH2)22-COOH)LysB28ProB29-人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)14-COOH)desB30人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)16-COOH)desB30人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)18-COOH)desB30人胰島素；NεB29-(CO-(CH2)20-COOH)desB30人胰島素；和NεB29-(CO-(CH2)22-COOH)desB30人胰島素。
WO 96/29344(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的活性特性的胰島素化合物，其中B-鏈的N-末端氨基酸的氨基具有附著的包含12-40個碳原子的親脂取代基，或其中B-鏈的C-末端氨基酸的羧酸基團具有附著的包含12-40個碳原子的親脂取代基。
WO 95/07931(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的活性特性的胰島素化合物，其中LysB29的ε-氨基具有親脂取代基。特別提及的是，NεB29-十三烷?；鵧es(B30)人胰島素，NεB29-十四烷酰基des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵧es(B30)人胰島素，NεB29-十二烷酰基des(B30)人胰島素，NεB29-十三烷酰基GlyA21des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷酰基GlyA21des(B30)人胰島素，NεB29-癸酰基GlyA21des(B30)人胰島素，NεB29-十二烷酰基GlyA21des(B 30)人胰島素，NεB29-十三烷?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lyA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三烷?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵄laA21des(B30)人胰島素，NεB29-十二烷酰基AlaA21des(B30)人胰島素，NεB29-十三烷酰基AlaA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷酰基AlaA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二烷?；鵄laA21GlnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三烷?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-癸?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lnB3des(B30)人胰島素，NεB29-十三烷?；鵊lyA21人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lyA21人胰島素，NεB29-癸酰基GlyA21人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lyA21人胰島素，NεB29-十三烷?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lyA21GlnB3人胰島素，NεB29-十三烷?；鵄laA21人胰島素，NεB29-十四烷?；鵄laA21人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21人胰島素，NεB29-十二烷?；鵄laA21人胰島素，NεB29-十三烷?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-十四烷?；鵄laA21GlnB3人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21GlnB3人胰島素，NεB29-十二烷?；鵄laA21 GlnB3人胰島素，NεB29-十三烷酰基GlnB3人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-癸?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lnB3人胰島素，NεB29-十三烷?；鵊luB30人胰島素，NεB29-十四烷酰基GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊luB30人胰島素，NεB29-十二烷酰基GluB30人胰島素，NεB29-十三烷酰基GlyA21GluB30人胰島素，NεB29-十四烷酰基GlyA21GluB30人胰島素，NεB29-癸酰基GlyA21GluB30人胰島素，NεB29-十二烷酰基GlyA21GluB30人胰島素，NεB29-十三烷酰基GlyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-癸?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十二烷?；鵊lyA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十三烷?；鵄laA21GluB30人胰島素，NεB29-十四烷?；鵄laA21GluB30人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21GluB30人胰島素，NεB29-十二烷?；鵄laA21GluB30人胰島素，NεB29-十三烷?；鵄laA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四烷酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-癸酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十二烷酰基AlaA21GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十三烷酰基GlnB3GluB30人胰島素，NεB29-十四烷?；鵊lnB3GluB30人胰島素，NεB29癸?；鵊lnB3GluB30人胰島素和NεB29-十二烷?；鵊lnB3GluB30人胰島素。
WO 97/02043(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了無激素活性的可以用于胰島素預防的胰島素化合物，具體地，這樣的人胰島素類似物選自desA1人胰島素；des(A1-A2)人胰島素；des(A1-A3)人胰島素；desA21人胰島素；des(B1-B5)人胰島素；des(B1-B6)人胰島素；des(B23-B30)人胰島素；des(B24-B30)人胰島素；des(B25-B30)人胰島素；GlyA2人胰島素；AlaA2人胰島素；NleA2人胰島素；ThrA2人胰島素；ProA2人胰島素；D-allo IleA2人胰島素；NvaA3人胰島素；NleA3人胰島素；LeuA3人胰島素；ValA2，IleA3人胰島素；AbuA2，AbuA3人胰島素；GlyA2，GlyA3人胰島素；D-CysA6人胰島素；D-CysA6，D-CysA11人胰島素；SerA6，SerA11，des(A8-A10)人胰島素；D-CysA7人胰島素；D-CysA11人胰島素；LeuA19人胰島素；GlyB6人胰島素；GluB12人胰島素；AsnB12人胰島素；PheB12人胰島素；D-AlaB12人胰島素；和AspB25人胰島素，它們可以用在本發(fā)明的方法中。
WO 92/15611(Novo nordisk)，其在這里引作參考，公開了在胰島素受體結合過程中具有快的締合速率常數(shù)的人胰島素類似物，其特征在于，包含在位置A13處的酪氨酸和/或在位置B17處的苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸。具體地，這樣的類似物選自TyrA13人胰島素，PheB17人胰島素，TrpB17人胰島素，TyrB17人胰島素，TyrA13，PheB17人胰島素，TyrA13，TrpB17人胰島素，TyrA13，TyrB17人胰島素，PheA13，PheB17人胰島素，PheA13，TrpB17人胰島素，PheA13，TyrB17人胰島素，TrpA13，PheB17人胰島素，TrpA13，TrpB17人胰島素和TrpA13，TyrB17人胰島素。
WO 92/00322(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了能靶向特定的組織的人胰島素類似物，其特征在于，在胰島素分子的A13位置和/或B17位置具有不同于亮氨酸的天然產生的氨基酸殘基，和/或在胰島素分子的B18位置具有不同于纈氨酸的天然產生的氨基酸殘基。具體地，這樣的類似物選自A1aB17人胰島素，AlaB18人胰島素，AsnA13人胰島素，AsnA13，AlaB17人胰島素，AsnA13，AspB17人胰島素，AsnA13，GluB17人胰島素，AsnB18人胰島素，AspA13人胰島素，AspA13，AlaB17人胰島素，AspA13，AspB17人胰島素，AspA13，GluB17人胰島素，AspB18人胰島素，GlnA13人胰島素，GlnA13，AlaB17人胰島素，GlnA13，AspB17人胰島素，GlnB18人胰島素，GluA13人胰島素，GluA13，AlaB17人胰島素，GluA13，AspB17人胰島素，GluA13，GluB17人胰島素，GluB18人胰島素，GlyA13人胰島素，GlyA13，AlaB17人胰島素，GlyA13，AsnB17人胰島素，GlyA13，AspB17人胰島素，GlyA13，GluB17人胰島素，GlyB18人胰島素，SerA13人胰島素，SerA13，GlnA17，GluB10，GlnB17-des(ThrB30)人胰島素，SerA13，AlaB17人胰島素，SerA13，AsnB17人胰島素，SerA13，AspB17人胰島素，SerA13，GlnB17人胰島素，SerA13，GluB17人胰島素，SerA13，ThrB17人胰島素，SerB14，AspB17人胰島素，SerB18人胰島素，ThrA13人胰島素或ThrB18人胰島素。
WO 90/01038(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有高生物活性的人胰島素類似物，其特征在于，具有被His或Tyr取代的PheB25，在下述的一個或多個位置具有取代A4，A8，A17，A21，B9，B10，B12，B13，B21，B26，B27，B28和B30，和在任選地缺少的位置B30處具有氨基酸殘基。具體地，這樣的類似物選自TyrB25人胰島素，TyrB25，AspB28人胰島素，HisB25人胰島素，HisB25，AspB28人胰島素，TyrB25人胰島素-B30-酰胺和HisB25人胰島素-B30-酰胺。
WO 86/05496(Nordisk Gentofte)公開了具有延長的作用的人胰島素類似物，其特征在于，具有封閉的B30羧基，和在位置A4，A17，A21，B13和B21處的氨基酸殘基中具有1-4個封閉的羧基。具體地，這樣的類似物選自胰島素-B30-辛基酯，胰島素-B30-十二烷基酰胺，胰島素-B30-十六烷基酰胺，胰島素-(B21，B30)-二甲基酯，胰島素-(B17，B30)-二甲基酯，胰島素-(A4，B30)二酰胺，胰島素-A17酰胺-B30-辛基酯，胰島素-(A4，B13)-二酰胺-B30-己基酰胺，胰島素-(A4，A17，B21，B30)-四酰胺，胰島素-(A17，B30)-二酰胺，A4-Ala-胰島素-B30-酰胺和B30-Leu-胰島素-(A4，B30)-二酰胺。
WO 86/05497(Nordisk Gentofte)，其在這里引作參考，公開了胰島素化合物，其中在位置A4，A17，B13和B21處的4個氨基酸殘基中的一個或多個包含不帶電荷的側鏈。特別提及的是，人胰島素A17-Gln，人胰島素A4-Gln，豬胰島素B21-Gln，人胰島素B13-Gln，人胰島素(A17，B21)-Gln，人胰島素A4-Ala，人胰島素B21-Thr，人胰島素B13-Val，人胰島素-Thr-A17-Gln，人胰島素B21-甲基酯和人胰島素A17-甲基酯。
WO 92/00321(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的活性的胰島素化合物，其中已經(jīng)在B-鏈的N-末端導入了正電荷。特別提及的是，ArgB5，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB5，ProB6，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB5，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB5，ProB6，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，ProB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，ProB3，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，ArgB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB2，ArgB3，SerA21人胰島素，ArgB4，ProB5，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB4，ArgB5，ProB6，GlyA21，ThrB30人胰島素，ArgB3，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB3，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB4，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB4，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素和ArgB1，ProB2，GlyA21，ThrB30-NH2人胰島素。
WO 90/07522(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了能在溶液中表現(xiàn)出低締合能力的胰島素化合物，其中存在帶正電荷的氨基酸殘基，即在位置B28處的Lys或Arg。特別提及的是，des[PheB25]-人胰島素，des[TyrB26]-人胰島素，des[ThrB27]-人胰島素，des[ProB28]-人胰島素，des[PheB25]-豬胰島素，des[ProB28]-豬胰島素，des[ProB28]-兔胰島素，des[PheB25]，des[ThrB30]-人胰島素，des[TyrB26]，des[ThrB30]-人胰島素，[SerA21]-des[ProB28]-人胰島素，[GlyA21]-des[ProB28]-人胰島素，[GlyA21]-des[PheB25]-人胰島素，[AspA21]-des[PheB25]-人胰島素，[HisB25]-des[TyrB26]，de s[ThrB30]-人胰島素，[AsnB25]-des[TyrB26]，des[ThrB30]-人胰島素，[AspA21]-des[PheB25]，des[ThrB30]-人胰島素，[AspB28]-des[PheB25]-人胰島素，[AspB3]-des[PheB25]-人胰島素，[LysB28]-人胰島素，[LysB28，ThrB29]-人胰島素和[ArgB28]-des[LysB29]-人胰島素。
WO 90/11290(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的活性的胰島素化合物。特別提及的是，[ArgA0]-人胰島素-(B30-酰胺)，[ArgA0，GlnB13]-人胰島素-(B30-酰胺)，[ArgA0，GlnA4，AspA21]-人胰島素-(B30-酰胺)，[ArgA0，SerA21]-人胰島素-(B30-酰胺)和[ArgA0，ArgB27]-des[ThrB30]-人胰島素。
WO 90/10645(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了糖基化的胰島素。特別提及的是，Phe(B1)葡萄糖人胰島素，Phe(B1)甘露糖人胰島素，Gly(A1)甘露糖人胰島素，Lys(B29)甘露糖人胰島素，Phe(B1)半乳糖人胰島素，Gly(A1)半乳糖人胰島素，Lys(B29)半乳糖人胰島素，Phe(B1)麥芽糖人胰島素，Phe(B1)乳糖人胰島素，Gly(A1)葡萄糖人胰島素，Gly(A1)麥芽糖人胰島素，Gly(A1)乳糖人胰島素，Lys(B29)葡萄糖人胰島素，Lys(B29)麥芽糖人胰島素，Lys(B29)乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰島素，Phe(B1)異麥芽糖人胰島素，Gly(A1)異麥芽糖人胰島素，Lys(B29)異麥芽糖人胰島素，Phe(B1)麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)麥芽三糖人胰島素，Lys(B29)麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二麥芽糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二乳糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二乳糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二麥芽三糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二麥芽三糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二甘露糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二甘露糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二甘露糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二半乳糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二半乳糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二半乳糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二異麥芽糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二異麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二異麥芽糖人胰島素，Phe(B1)葡萄糖[AspB10]人胰島素和Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖[AspB10]人胰島素。
WO 88/065999(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了穩(wěn)定化的胰島素化合物，其中Ans21A已經(jīng)被其它的氨基酸殘基取代。特別提及的是，GlyA21人胰島素，AlaA21人胰島素，SerA21人胰島素，ThrA21人胰島素和hSerA21人胰島素。
EP 254516(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的作用的胰島素化合物，其中堿性氨基酸殘基已經(jīng)被中性的氨基酸殘基取代。特別提及的是GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，AlaB21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，AspB21，LysB27，ThrB30-NN2人胰島素，GlyA21，ArgB21，ThrB30-NH2人胰島素，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，AlaB21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，AspB21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，GlyA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，SerA21，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，SerA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，ThrA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，AlaA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，HisA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，AspA21，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，GlyA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，SerA21，LysB27，ThrB30-NH2GlnB13，ThrA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，AlaA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，HisA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，AspA21，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，AsnA21，LysB27人胰島素，SerA21，LysB27人胰島素，ThrA21，LysB27人胰島素，AlaA21，LysB27人胰島素，HisA21，LysB27人胰島素，AspA21，LysB27人胰島素，GlyA21，LysB27人胰島素，AsnA21，ArgB27人胰島素，SerA21，ArgB27人胰島素，ThrA21，ArgB27人胰島素，AlaA21，ArgB27人胰島素，HisA21，ArgB27人胰島素，AspA21，ArgB27人胰島素，GlyA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，AsnA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，SerA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，ThrA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，AlaA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，HisA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，AspA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，GlyA21，ArgB27人胰島素，GlnA17，AsnA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，SerA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，ThrA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，AlaA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，HisA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，AspA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，GlyA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，AsnA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，SerA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，ThrA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，AlaA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，HisA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，AspA21，GlnB13人胰島素，ArgA27，GlyA21，GlnB13人胰島素，GlnA17，AsnA21，LysB27人胰島素，GlnA17，SerA21，LysB27人胰島素，GlnA17，ThrA21，LysB27人胰島素，GlnA17，AlaA21，LysB27人胰島素，GlnA17，HisA21，LysB27人胰島素，GlnA17，AspA21，LysB27人胰島素，GlnA17，GlyA21，LysB27人胰島素，GlnB13，AsnA21，LysB27人胰島素，GlnB13，SerA21，LysB27人胰島素，GlnB13，ThrA21，LysB27人胰島素，GlnB13，AlaA21，LysB27人胰島素，GlnB13，HisA21，LysB27人胰島素，GlnB13，AsPA21，LysB27人胰島素，和GlnB13，GlyA21，LysB27人胰島素。
EP 214826(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了迅速開始的胰島素化合物。
EP 194864(Novo Nordisk)，其在這里引作參考，公開了具有延長的作用的胰島素化合物，其中堿性氨基酸殘基已經(jīng)被中性氨基酸殘基取代。特別提及的是，GlnA17，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnA17，GlnB13，ThrB30-NH2人胰島素，GlnA17，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnA17，LysB27-NH2人胰島素，GlnA17，GlnA17，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，GlnB13，LysB30-NH2人胰島素，GlnB13，ThrB30-NH2人胰島素，ArgB27，ArgB30-NH2人胰島素，ArgB27，LysB30-NH2人胰島素，ArgB27，ThrB30-NH2人胰島素，LysB27，ArgB30-NH2人胰島素，LysB27，LysB30-NH2人胰島素，LysB27，ThrB30-NH2人胰島素，LysB29-NH2，des-(B30)人胰島素，ThrB30-NH2人胰島素，LysB30-NH2人胰島素，LysB30(Lau)-NH2人胰島素，LysB30，ArgB31-NH2人胰島素，LysB30，LysB31NH2人胰島素，ArgB30-NH2人胰島素，ArgB30，ArgB31-NH2人胰島素，和ArgB30，LysB31-NH2人胰島素。
美國專利號3,528,960(Eli Lilly)，其在這里引作參考，公開了N-羧基芳酰基胰島素化合物，其中胰島素分子的1、2或3個伯(primary)氨基具有羧基芳?；?。
英國專利號1.492.997(Nat.Res.Dev.Corp.)，其在這里引作參考，公開了在NεB29處具有氨甲?；〈囊葝u素化合物，其具有提高的低血糖作用特征。
日本公開未決專利申請?zhí)?-254699(Kodama Co.，Ltd.)，其在這里引作參考，公開了胰島素化合物，其中烷酰基結合到PheB1的氨基或LysB29的ε-氨基或它們二者上。
日本公開未決專利申請?zhí)?7-067548(Shionogi)，其在這里引作參考，公開了胰島素化合物，其中B30位置具有包含至少5個碳原子的氨基酸，其不是必須由核苷酸的三聯(lián)體編碼。
WO 03/053339(Eli Lilly)，其在這里引作參考，公開了胰島素化合物，其中已經(jīng)用2個氨基酸殘基A-1和A0在N-末端延伸了A-鏈，其中已經(jīng)用2個氨基酸殘基B-1和B0在N-末端延伸了B-鏈，其中可以取代在位置B28，B29和B39處的氨基酸殘基，和其中在位置B28或B29處的Lys的ε-氨基共價地結合到帶正電荷的氨基酸的α-羧基上，形成Lys-Nε-氨基酸衍生物。特別提及的是，所述的類似物，其中A-1和B-1都不存在，和其中A0代表著Arg，B0代表著Arg或不存在。
選自下述的胰島素化合物i.類似物，其中位置B28是Asp，Lys，Leu，Val或Ala，和位置B29是Lys或Pro；和ii.des(B28-B30)，des(B27)或des(B30)人胰島素，也可以適用于本發(fā)明的方法，尤其是其中位置B28是Asp或Lys，和位置B29是Lys或Pro的胰島素化合物。
des(B30)人胰島素也適用于本發(fā)明的方法中。
其它適用的胰島素化合物選自B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)人胰島素，B29-Nε-棕櫚?；?des(B30)人胰島素，B29-Nε-肉豆蔻?；艘葝u素，B29-Nε-棕櫚酰基人胰島素，B28-Nε-肉豆蔻酰基LysB28ProB29人胰島素，B28-Nε-棕櫚?；鵏ysB28ProB29人胰島素，B30-Nε-肉豆蔻酰基-ThrB29LysB30人胰島素，B30-Nε-棕櫚?；?ThrB29LysB30人胰島素，B29-Nε-(N-棕櫚?；?γ-谷氨?；?-des(B30)人胰島素，B29-Nε-(N-石膽?；?lithocholyl)-γ-谷氨?；?-des(B30)人胰島素，B29-Nε-(ω-羧基十七?；?-des(B30)人胰島素，B29-Nε-(ω-羧基十七?；?人胰島素和B29-Nε-肉豆蔻酰基-des(B30)人胰島素。
在本發(fā)明的方法中適用的GLP-1的實例包括人GLP-1和GLP-1化合物。人GLP-1是37個氨基酸殘基的肽，它源自前高血糖素原，后者在回腸遠端、胰腺和腦中的L-細胞中i.a.地合成。GLP-1是重要的消化道激素，在葡萄糖代謝和胃腸分泌和代謝中具有調節(jié)功能。能產生GLP-1(7-36)-酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2的前高血糖素原的加工主要發(fā)生在L-細胞中。片段GLP-1(7-36)-酰胺和GLP-1(7-37)都是葡萄糖依賴性的促胰島素試劑。在過去的數(shù)十年中，從毒蜥(Gila monsterlizard)(鈍尾毒蜥(Heloderma suspectum)和珠毒蜥(Helodermahorridum))的毒液中，分離了GLP-1的許多結構類似物。Exendin-4是從珠毒蜥的毒液分離的39個氨基酸殘基的肽，且該肽與GLP-1具有52％同源性。Exendin-4是有效的GLP-1受體激動劑，當注射進狗中時，已經(jīng)證實它能刺激胰島素釋放和確保降低血糖水平。GLP-1(1-37)和exendin-4(1-39)和其某些片段、類似物和衍生物這一組物質(在本文中稱作GLP-1化合物)是有效的促胰島素試劑，它們都適用于本發(fā)明的方法中。GLP-1(1-37)的促胰島素片段是促胰島素肽，其完整序列可以在GLP-1(1-37)的序列中發(fā)現(xiàn)，且其中已經(jīng)刪除了至少1個末端氨基酸。GLP-1(1-37)的促胰島素片段的實例是GLP-1(7-37)，其中已經(jīng)刪除了在GLP-1(1-37)的位置1-6處的氨基酸殘基，和GLP-1(7-36)，其中已經(jīng)刪除了在GLP-1(1-37)的位置1-6和37處的氨基酸殘基。exendin-4(1-39)的促胰島素片段的實例是exendin-4(1-38)和exendin-4(1-31)。通過本領域眾所周知的體內或體外測定，可以測定化合物的促胰島素性質。例如，可以將化合物施用給動物，并監(jiān)測胰島素濃度隨時間的變化。GLP-1(1-37)和exendin-4(1-39)的促胰島素類似物是指各自的分子，其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被替換成其它的氨基酸殘基，和/或已經(jīng)從中刪除了一個或多個氨基酸殘基，和/或已經(jīng)從中添加了一個或多個氨基酸殘基，條件是，所述的類似物是促胰島素的或是促胰島素的化合物的前藥。GLP-1(1-37)的促胰島素的類似物的實例是例如Met8-GLP-1(7-37)，其中在位置8處的丙氨酸已經(jīng)替換為甲硫氨酸，且已經(jīng)刪除了在位置1-6處的氨基酸殘基，和Arg34-GLP-1(7-37)，其中在位置34處的纈氨酸已經(jīng)被替換為精氨酸，且已經(jīng)刪除了在位置1-6處的氨基酸殘基。exendin-4(1-39)的促胰島素的類似物的實例是Ser2Asp3-exendin-4(1-39)，其中在位置2和3處的氨基酸殘基已經(jīng)分別被替換為絲氨酸和天冬氨酸(在本領域，該特殊的類似物也稱作exendin-3)。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)和其類似物的促胰島素的衍生物是被本領域技術人員視作這些肽的衍生物的那些，即具有至少1個在親本肽分子中不存在的取代基，條件是，所述的衍生物是促胰島素的或是促胰島素的化合物的前藥。取代基的實例是酰胺，碳水化合物，烷基和親脂取代基。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)和其類似物的促胰島素的衍生物的實例是GLP-1(7-36)-酰胺，Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六?；?))-GLP-1(7-37)和Tyr31-exendin-4(1-31)-酰胺。GLP-1(1-37)、exendin-4(1-39)、其促胰島素片段、其促胰島素的類似物和其促胰島素的衍生物的其它實例記載在WO 98/08871，WO 99/43706，US 5424286和WO 00/09666中，它們都在這里引作參考。
通過本發(fā)明提供的方法，也可以修飾GLP-2和GLP-2化合物。在本文中，GLP-2化合物能結合GLP-2受體，優(yōu)選地具有小于1μM、例如小于100nM的親合常數(shù)(KD)或潛能(EC50)。術語“GLP-2化合物”意在表示其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除和/或被另一種天然的或非天然的氨基酸殘基替代的人GLP-2，和/或包含額外的氨基酸殘基的人GLP-2，和/或其中至少1個有機取代基結合到一個或多個氨基酸殘基上的人GLP-2。具體地，考慮這些肽，其氨基酸序列能在33個連續(xù)氨基酸的任意序列處展現(xiàn)出超過60％的人GLP-2的氨基酸序列。還考慮這些肽，當從氨基酸序列刪除了至多4個氨基酸時，其氨基酸序列能在37個連續(xù)氨基酸的任意序列處展現(xiàn)出超過60％的人GLP-2的氨基酸序列。還考慮這些肽，當向它們的氨基酸序列中添加了至多2個氨基酸時，其氨基酸序列能在31個連續(xù)氨基酸的任意序列處展現(xiàn)出超過60％的GLP-2的氨基酸序列。術語“GLP化合物”也包括天然的等位基因變體，它們可以在個體之間存在和發(fā)生。另外，糖基化作用或其它的翻譯后修飾的程度和位置，可以隨選擇的宿主細胞和宿主細胞環(huán)境的性質而異。
可以根據(jù)本發(fā)明使用的候選GLP-2化合物包括WO 96/32414，WO97/39031，WO 98/03547，WO 96/29342，WO 97/31943，WO 98/08872所述的GLP-2化合物，它們都在這里引作參考。
具體地，下面的GLP-2化合物適用于本發(fā)明的方法A2G-GLP-2(1-33)；K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；和D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-2化合物選自GLP-2(1-33)，34R-GLP-2(1-34)，A2G-GLP-2(1-33)，A2G/34R-GLP-2(1-34)，K30R-GLP-2(1-33)；S5K-GLP-2(1-33)；S7K-GLP-2(1-33)；D8K-GLP-2(1-33)；E9K-GLP-2(1-33)；M10K-GLP-2(1-33)；N11K-GLP-2(1-33)；T12K-GLP-2(1-33)；I13K-GLP-2(1-33)；L14K-GLP-2(1-33)；D15K-GLP-2(1-33)；N16K-GLP-2(1-33)；L17K-GLP-2(1-33)；A18K-GLP-2(1-33)；D21K-GLP-2(1-33)；N24K-GLP-2(1-33)；Q28K-GLP-2(1-33)；S5K/K30R-GLP-2(1-33)；S7K/K30R-GLP-2(1-33)；D8K/K30R-GLP-2(1-33)；E9K/K30R-GLP-2(1-33)；M10K/K30R-GLP-2(1-33)；N11K/K30R-GLP-2(1-33)；T12K/K30R-GLP-2(1-33)；I13K/K30R-GLP-2(1-33)；L14K/K30R-GLP-2(1-33)；D15K/K30R-GLP-2(1-33)；N16K/K30R-GLP-2(1-33)；L17K/K30R-GLP-2(1-33)；A18K/K30R-GLP-2(1-33)；D21K/K30R-GLP-2(1-33)；N24K/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K/K30R-GLP-2(1-33)；K30R/D33K-GLP-2(1-33)；D3E/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S5K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/Q28K/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
僅僅具有1個附著到GLP-2肽上的親脂取代基的GLP-2衍生物也適用于本發(fā)明的方法，例如GLP-2衍生物，其中親脂取代基包含4-40個碳原子，例如8-25個碳原子，例如12-20個碳原子。
親脂取代基可以以親脂取代基的羧基與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵的方式，附著到氨基酸殘基上。
作為實例，親脂取代基附著到Lys殘基上。
親脂取代基可以以親脂取代基的氨基與氨基酸殘基的羧基形成酰胺鍵的方式，附著到氨基酸殘基上。
親脂取代基也可以借助于隔離物附著到GLP-2肽上，且所述的隔離物可以選自β-丙氨酸，γ-氨基丁酸(GABA)，γ-谷氨酸，Lys，Asp，Glu，含有Asp的二肽，含有Glu的二肽，或含有Lys的二肽。在本發(fā)明的一個實施方案中，隔離物是β-丙氨酸。親本GLP-2肽的羧基也可以與隔離物的氨基形成酰胺鍵，且氨基酸或二肽隔離物的羧基可以與親脂取代基的氨基形成酰胺鍵。
親本GLP-2肽的氨基也可以與隔離物的羧基形成酰胺鍵，且隔離物的氨基可以與親脂取代基的羧基形成酰胺鍵。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂取代基是直鏈的或分支的烷基。在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂取代基是直鏈的或分支的脂肪酸的酰基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，親脂取代基是直鏈的或分支的烷烴α，ω-二羧酸的?；?。
在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-2衍生物具有1個親脂取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-2衍生物具有2個親脂取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-2衍生物具有3個親脂取代基。在本發(fā)明的一個實施方案中，GLP-2衍生物具有4個親脂取代基。下表含有特別適用于本發(fā)明的方法中的GLP-2衍生物。
S5K(3-(十六?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；S7K(3-(十六酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；D8K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；E9K(3-(十六酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；M10K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；N11K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；T12K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；I13K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L14K(3-(十六酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；D15K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；N16K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(辛?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(壬酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(癸?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十一?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十二?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十三?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十四?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十五?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十六酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十七?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十八?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；
L17K(3-(十九酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K(3-(二十酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(辛?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(壬?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(癸?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十一?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十二?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十三?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十四?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十五?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十六?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十七?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十八?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十九?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(二十?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(辛?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(壬酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(癸?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十一?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十二?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十三?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十四?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十五?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十六?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十七酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十八酰基氨基)丁?；?-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十九?；被?丁酰基)-GLP-2(1-33)；L17K(4-(二十?；被?丁?；?-GLP-2(1-33)；A18K(3-(十六酰基氨基)丙?；?-GLP-2(1-33)；
D21K(3-(十六?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；N24K(3-(十六?；被?丙?；?-GLP-2(1-33)；Q28K(3-(十六?；被?丙酰基)-GLP-2(1-33)；S5K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；S7K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D8K(3-(十六酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；E9K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；M10K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；N11K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；T12K(3-(十六酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；I13K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L14K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D15K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；N16K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(辛酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(壬?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(癸?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十一?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十二?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十三?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十四?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十五?；被?丙酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十六酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十七?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十八酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(十九酰基氨基)丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(3-(二十?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(辛?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(壬?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K((S)-4-羧基-4-(癸酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十一?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十二酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十三?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十四?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十五?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十六?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十七?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十八?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(十九?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K((S)-4-羧基-4-(二十?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(辛?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(壬?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(癸酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十一?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十二酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十三?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十四酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十五?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；
L17K(4-(十六酰基氨基)丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十七?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十八?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(十九?；被?丁酰基)/K30R-GLP-2(1-33)；L17K(4-(二十?；被?丁?；?/K30R-GLP-2(1-33)；A18K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D21K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；N24K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；Q28K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R-GLP-2(1-33)；D3E/S5K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/S7K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D8K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/E9K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/M10K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N11K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/T12K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/I13K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L14K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D15K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N16K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(辛?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(壬酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(癸酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十一?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十二?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十三?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十四?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十五?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十六酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K(3-(十七?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十八?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(十九?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(3-(二十酰基氨基)丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(辛酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(壬?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(癸酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十一?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十二?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十三酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十四?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十五?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十六?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十七酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十八?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(十九?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；
D3E/L17K((S)-4-羧基-4-(二十?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(辛?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(壬?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(癸?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十一?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十二酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十三酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十四酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十五?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十六酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十七?；被?丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十八酰基氨基)丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(十九?；被?丁?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/L17K(4-(二十酰基氨基)丁酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/A18K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/D21K(3-(十六?；被?丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；D3E/N24K(3-(十六?；被?丙?；?/K30R/D33E-GLP-2(1-33)；和D3E/Q28K(3-(十六酰基氨基)丙酰基)/K30R/D33E-GLP-2(1-33)。
適用于本發(fā)明的方法中的因子VII化合物包括野生型因子VII(即，具有美國專利號4,784,950公開的氨基酸序列的多肽)，以及與野生型因子VII相比能表現(xiàn)出基本上相同的或提高的生物學活性的因子VII的變體，因子VII-有關的多肽，以及因子VII衍生物和因子VII綴合物。術語“因子VII化合物”意在包括處于它們的未剪切(酶原)形式的因子VII多肽，以及已經(jīng)經(jīng)過蛋白水解加工而生成它們各自的生物活性形式的那些，其可以稱作因子VIIa。典型地，在殘基152和153之間剪切因子VII，生成因子VIIa。這樣的因子VII的變體可以表現(xiàn)出與人因子VII不同的性質，包括穩(wěn)定性、磷脂結合、改變的比活等。
如本文使用的，“因子VII-有關的多肽”包括多肽，包括變體，其中與野生型因子VIIa的活性相比，已經(jīng)基本上修飾或減少了因子VIIa生物活性。這些多肽包括但不限于因子VII或因子VIIa，其中已經(jīng)導入了特定的氨基酸序列改變，其能修飾或破壞多肽的生物活性。
如本文使用的，術語“因子VII衍生物”意指野生型因子VII，與野生型因子VII相比能表現(xiàn)出基本上相同的或提高的生物學活性的因子VII的變體，和因子VII-有關的多肽，其中已經(jīng)化學修飾了親本肽的一個或多個氨基酸，例如通過烷基化，PEG化，?；バ纬苫蝓０沸纬傻?。這包括但不限于PEG化的人因子VIIa，半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa和其變體。
術語″PEG化的人因子VIIa″指具有與人因子VIIa多肽綴合的PEG分子的人因子VIIa。應當理解，PEG分子可以附著到因子VIIa多肽的任何部分，包括因子VIIa多肽的任何氨基酸殘基或碳水化合物部分。術語″半胱氨酸-PEG化的人因子VIIa″指具有綴合到導入人因子VIIa的半胱氨酸的巰基上的PEG分子的因子VIIa。
因子VIIa在血液凝固中的生物學活性源自它的下述能力(i)結合組織因子(TF)，和(ii)催化因子IX或因子X的蛋白水解剪切，生成活化的因子IX或X(分別是因子IXa或Xa)。為了本發(fā)明的目的，通過使用因子VII-缺陷型血漿和促凝血酶原激酶，測量制品的促進血液凝固的能力，可以定量因子VIIa生物學活性，如例如美國專利號5,997,864所述。在該測定中，將生物學活性表達為，與對照樣品相比，凝固時間的減少，并通過與合并的含有1單位/m1因子VII活性的人血清標準品的對比，轉化成“因子VII單位”?；蛘?，通過下述方式可以定量因子VIIa生物學活性(i)測量因子VIIa在包含嵌入脂膜的TF和因子X的系統(tǒng)中生成因子Xa的能力(Persson等人，J.Biol.Chem.27219919-19924，1997)；(ii)測量在水性系統(tǒng)中的因子X水解；(iii)使用基于表面等離子體振子共振(surface plasmonresonance)的裝置，測量它與TF的物理結合(Persson，F(xiàn)EBS Letts.413359-363，1997)；和(iv)測量合成的底物的水解。
與野生型因子VIIa相比，具有基本上相同的或提高的生物學活性的因子VII變體包括，當在一個或多個如上所述的凝固測定、蛋白水解測定或TF結合測定中測試時，能表現(xiàn)出已經(jīng)在相同細胞類型中產生的因子VIIa的比活的至少約25％、優(yōu)選地至少約50％、更優(yōu)選地至少約75％和最優(yōu)選地至少約90％的那些。與野生型因子VIIa相比，具有基本上減少的生物學活性的因子VII變體是，當在一個或多個如上所述的凝固測定、蛋白水解測定或TF結合測定中測試時，能表現(xiàn)出已經(jīng)在相同細胞類型中產生的野生型因子VIIa的比活的小于約25％、優(yōu)選地小于約10％、更優(yōu)選地小于約5％和最優(yōu)選地小于約1％的那些。與野生型因子VII相比，具有基本上修飾的生物學活性的因子VII變體包括但不限于，能表現(xiàn)出TF非依賴性因子X蛋白水解活性的因子VII變體，和能結合TF、但是不能剪切因子X的那些。
表現(xiàn)出與野生型因子VII基本上相同的或更好的生物活性，或者表現(xiàn)出與野生型因子VII相比基本上修飾或減少的生物活性的因子VII的變體，包括但不限于，具有通過插入、刪除或取代一個或多個氨基酸而不同于野生型因子VII的序列的氨基酸序列的多肽。
如本文使用的，術語“變體”意指具有野生型因子VII的序列的因子VII，其中親本蛋白的一個或多個氨基酸已經(jīng)被取代為另一種氨基酸，和/或其中已經(jīng)刪除了親本蛋白的一個或多個氨基酸，和/或其中已經(jīng)將一個或多個氨基酸插入蛋白，和/或其中已經(jīng)將一個或多個氨基酸添加到親本蛋白上。這樣的添加可以發(fā)生在親本蛋白的N-末端或C-末端或二者。在該定義范圍內，“變體”仍具有它的活化形式的FVII活性。在一個實施方案中，變體與野生型因子VII的序列具有70％一致性。在一個實施方案中，變體與野生型因子VII的序列具有80％一致性。在另一個實施方案中，變體與野生型因子VII的序列具有90％一致性。在另一個實施方案中，變體與野生型因子VII的序列具有95％一致性。
具有與野生型因子VII基本上相同的生物學活性的因子VII變體的非限制性實例包括S52A-FVIIa，S60A-FVIIa(Lino等人，Arch.Biochem.Biophys.352182-192，1998)；表現(xiàn)出提高的蛋白水解穩(wěn)定性的FVIIa變體，由美國專利號5,580,560所公開；已經(jīng)在殘基290和291之間或殘基315和316之間經(jīng)蛋白水解剪切的因子VIIa(Mollerup等人，Biotechnol.Bioeng.48501-505，1995)；因子VIIa的氧化形式(Kornfelt等人，Arch.Biochem.Biophys.36343-54，1999)；由PCT/DK02/00189公開的FVII變體；和表現(xiàn)出提高的蛋白水解穩(wěn)定性的FVII變體，由WO 02/38162所公開(ScrippsResearch Institute)；具有修飾的Gla-結構域且能表現(xiàn)出增強的膜結合的FVII變體，由WO 99/20767(University of Minnesota)和WO00/66753(University of Minnesota)所公開；和由WO 01/58935(Maxygen ApS)，WO 03/93465(Maxygen ApS)和WO 04/029091(MaxygenApS)所公開的FVII變體，它們都在這里引作參考。
特別提及的是，與野生型FVIIa相比，具有提高的生物學活性的FVII變體包括由WO 01/83725，WO 02/22776，WO 02/077218，PCT/DK02/00635，WO 2004/029090，WO 2003/037932；WO 02/38162(Scripps Research Institute)所公開的FVII變體；和由JP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)所公開的具有增強的活性的FVIIa變體，它們都在這里引作參考。
與野生型因子VII相比，具有基本上減少的或修飾的生物學活性的因子VII變體的實例包括R152E-FVIIa(Wildgoose等人，Biochem293413-3420，1990)，S344A-FVIIa(Kazama等人，J.Biol.Chem.27066-72，1995)，F(xiàn)FR-FVIIa(Holst等人，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.15515-520，1998)，和缺少Gla結構域的因子VIIa(Nicolaisen等人，F(xiàn)EBS Letts.317245-249，1993)，它們都在這里引作參考。
因子VII的變體、因子VII或因子VII-有關的多肽的實例包括野生型因子VII，L305V-FVII，L305V/M306D/D309S-FVII，L305I-FVII，L305T-FVII，F(xiàn)374P-FVII，V158T/M298Q-FVII，V158D/E296V/M298Q-FVII，K337A-FVII，M298Q-FVII，V158D/M298Q-FVII，L305V/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII，V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII，K157A-FVII，E296V-FVII，E296V/M298Q-FVII，V158D/E296V-FVII，V158D/M298K-FVII，和S336G-FVII，L305V/K337A-FVII，L305V/V158D-FVII，L305V/E296V-FVII，L305V/M298Q-FVII，L305V/V158T-FVII，L305V/K337A/V158T-FVII，L305V/K337A/M298Q-FVII，L305V/K337A/E296V-FVII，L305V/K337A/V158D-FVII，L305V/V158D/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V-FVII，L305V/V158T/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V-FVII，L305V/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/K316H-FVII，S314E/K316Q-FVII，S314E/L305V-FVII，S314E/K337A-FVII，S314E/V158D-FVII，S314E/E296V-FVII，S314E/M298Q-FVII，S314E/V158T-FVII，K316H/L305V-FVII，K316H/K337A-FVII，K316H/V158D-FVII，K316H/E296V-FVII，K316H/M298Q-FVII，K316H/V158T-FVII，K316Q/L305V-FVII，K316Q/K337A-FVII，K316Q/V158D-FVII，K316Q/E296V-FVII，K316Q/M298Q-FVII，K316Q/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D-FVII，S314E/L305V/E296V-FVII，S314E/L305V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/V158T-FVII，S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/K337A/E296V-FVII，S314E/L305V/K337A/V158D-FVII，S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V-FVII，S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V-FVII，S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D-FVII，K316H/L305V/E296V-FVII，K316H/L305V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/V158T-FVII，K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/K337A/E296V-FVII，K316H/L305V/K337A/V158D-FVII，K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V-FVII，K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V-FVII，K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V58D/K337A/M298Q-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D-FVII，K316Q/L305V/E296V-FVII，K316Q/L305V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII，K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII，K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII，K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII，K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V-FVI I，K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q-FVIIF374Y/L305V/K337A/V158D-FVI I，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/S314E/V58D-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/V158T/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/K337A/E296V/V158D-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/S314E/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/S314E/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVIIF374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305VN158D/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVIIF374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVIIF374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII，F(xiàn)374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII，S52A-因子VII，S60A-因子VII；R152E-因子VII，S344A-因子VII，缺少Gla結構域的因子VIIa；和P11Q/K33E-FVII，T106N-FVII，K143N/N145T-FVII，V253N-FVII，R290N/A292T-FVII，G291N-FVII，R315N/V317T-FVII，K143N/N145T/R315N/V 317T-FVII；和在233Thr至240Asn的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII，在304Arg至329Cys的氨基酸序列中具有取代、添加或缺失的FVII。
適用于本發(fā)明的方法中的生長激素包括其序列和特征記載在例如Hormone Drugs，Gueriguian，U.S.P.Covention，Rockvill，1982中的人生長激素(hGH)和生長激素化合物。術語“生長激素化合物”意在表示其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被刪除，和/或被其它天然的或非天然的氨基酸殘基替代的人生長激素(hGH)，和/或包含額外的天然的或非天然的氨基酸殘基的hGH，和/或其中至少1個有機取代基結合到一個或多個有機取代基上的hGH。特別提及的是，191個天然的氨基酸的序列(生長激素)和192個氨基酸的N-末端甲硫氨酸的種類(人蛋氨生長素)。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，其中氨基酸NO.172，174，176和178作為一組被一個下面的氨基酸組取代(R，S，F(xiàn)，R)；(R，A，Y，R)，(K，T，Y，K)；(R，S，Y，R)；(K，A，Y，R)；(R，F(xiàn)，F(xiàn)，R)；(K，Q，Y，R)；(R，T，Y，H)；(Q，R，Y，R)；(K，K，Y，K)；(R，S，F(xiàn)，S)或(K，S，N，R)，如WO 92/09690(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述取代的hGHG120R，G120K，G120Y，G120F和G120E，如US 6,004,931(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代的hGHR167N，D171S，E174S，F(xiàn)176Y和I179T；R176E，D171S，E174S和F176Y；F10A，M14W，H18D和H21N；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171S，E174S，F(xiàn)176Y，I179T；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171A，E174S，F(xiàn)176Y，I179T；F10H，M14G，H18N和H21N；F10A，M14W，H18D，H21N，R167N，D171A，T175T和I179T；和F10I，M14Q，H18E，R167N，D171S和I179T，如US 6,143,523(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代的hGHH18A，Q22A，F(xiàn)25A，D26A，Q29A，E65A，K168A，E174A和G120K，如US 6,136,536(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代H18D，H21N，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，I179T，和其中G120還被R，K，W，Y，F(xiàn)或E取代的hGH，如US6,057,292(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代的hGHH18D，H21N，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S和I179T，如US 5,849,535(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代的hGHH18D，H21D，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S和I179T；和H18A，Q22A，F(xiàn)25A，D26A，Q29A，E65A，K168A和E174A，如WO 97/11178(Genentech)所述，其在這里引作參考。
適用于本發(fā)明的生長激素化合物的其它實例包括，具有下述的一套取代的hGHK168A和E174A；R178N和I179M；K172A和F176A；和H54F，S56E，L58I，E62S，D63N和Q66E如WO 90/04788(Genentech)所述，其在這里引作參考。
使用本發(fā)明的方法可以修飾的細胞因子的實例包括促紅細胞生成素(EPO)，血小板生成素，INF-α，IFN-β，IFN-γ，TNF-α，白介素-1β(IL-1-β)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-10，IL-12，IL-15，IL-18，IL-19，IL-20，IL-21 IL-24，粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，GM-CSF，和趨化因子例如巨噬細胞(machrophage)炎性蛋白-1(MIP-1)γ干擾素誘導型蛋白和IFNγ誘導的單核因子(MIG)。
適用于本發(fā)明的方法中的IL-19的具體實例包括WO 98/08870(Human Genome Science)公開的那些，其在這里引作參考。特別提及的是，由WO 98/08870的SEQ ID NO2公開的肽。
適用的IL-20的具體實例包括WO 99/27103(Zymogenetics)公開的那些，其在這里引作參考。在本文中，IL-20意在表示IL-20自身和其片段，以及與IL-20或其片段具有至少90％一致性的多肽。在本發(fā)明的方法中特別適用的蛋白包括，在WO 99/27103中公開為SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ IDNO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO31，SEQ ID NO32，SEQ ID NO33，SEQ IDNO34和SEQ ID NO35的那些。
適用于本發(fā)明的方法中的I L-21的實例包括，在WO 00/53761(Zymogenetics)中公開的那些，其在這里引作參考。特別提及的是，在WO 00/53761的SEQ ID NO2中公開的肽。
TTF適用于本發(fā)明的方法中。TTF肽是主要與胃腸道相關地發(fā)現(xiàn)的肽家族。特別提及的是，從人、小鼠和大鼠獲知的乳腺癌相關的pS2肽(TFF-1)，從人、豬、大鼠和小鼠獲知的解痙的多肽(TFF-2)，和從人、大鼠和小鼠獲知的腸三葉因子(TFF-3)。
適用于本發(fā)明的方法中的來自TFF家族的其它肽包括，在WO02/46226(Novo Nordisk)中公開的那些，其在這里引作參考。特別提及的是TFF-2肽，其中TFF2肽具有如WO 02/46226的SEQ ID NO1所述的氨基酸，其包含在Cys6-Cys104，Cys8-Cys35，Cys19-Cys34，Cys29-Cys46，Cys58-Cys84，Cys68-Cys83，和Cys78-Cys95之間的二硫鍵，且其中獨立地選自糖殘基和寡糖的部分X共價地附著到Asn15上。
TFF家族的其它肽包括TFF-1和TFF-3二聚體，如在WO 96/06861(Novo Nordisk)中公開的那些，其在這里引作參考。
已知了幾種黑皮質素受體，特別提及的適用于本發(fā)明的方法的肽是肽黑皮質素-4受體激動劑，已知其具有抑制食欲的作用。特別提及的是，在下面的專利文件中公開的肽或蛋白，它們都在這里引作參考US 6,054,556(Hruby)，WO 00/05263(William Harvey Research)，WO 00/35952(Melacure)，WO 00/35952(Melacure)，WO 00/58361(Procter & Gamble)，WO 01/52880(Merck)，WO 02/26774(Procter& Gamble)，WO 03/06620(Palatin)，WO 98/27113(Rudolf MagnusInstiute)和WO 99/21571(Trega)。
適用于本發(fā)明的方法中的其它類型的肽或蛋白包括酶。許多酶用于各種不同的工業(yè)目的，特別提及的是，水解酶(蛋白酶，脂肪酶，纖維素酶，酯酶)，氧化還原酶(漆酶，過氧化物酶，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶，脂肪氧化酶)，轉移酶和異構酶。
適用于本發(fā)明的方法中的其它的肽或蛋白包括，ACTH，促腎上腺皮質激素釋放因子，血管緊張素，降鈣素，胰島素及其片段和類似物，胰高血糖素，IGF-1，IGF-2，腸胃泌素，胃泌素，四肽胃泌素，五肽胃泌素，尿胃泌素，表皮生長因子，胰泌素，神經(jīng)生長因子，促甲狀腺素釋放激素，促生長素抑制素，生長激素釋放激素，促生長因子，甲狀旁腺激素，血小板生成素，促紅細胞生成素，下丘腦釋放因子，催乳素，促甲狀腺激素，內啡肽，腦啡肽，加壓素，催產素，opiods和其類似物，天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶和核糖核酸酶。
可以從天然來源(例如植物、動物或微生物，例如酵母、細菌、真菌或病毒)分離要根據(jù)本發(fā)明的方法進行修飾的肽，或者可以合成它們。來自天然來源的肽也包括來自轉基因來源(例如已經(jīng)經(jīng)遺傳修飾而表達肽或增強肽的表達的來源)的肽，其中所述肽可以是“天然的”，其含義是它天然存在，或者是“非天然的”，其含義是它僅僅由于人類干涉而存在。在本發(fā)明的綴合之前，也可以對從天然來源分離的肽進行合成修飾，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及可以根據(jù)本發(fā)明的方法得到的綴合的肽。如果通過本發(fā)明的方法得到的綴合的肽是治療性肽，則本發(fā)明也提供了這樣的化合物在治療中的用途，和包含這樣的化合物的藥物組合物。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了下式的綴合的肽 其中P’，R，A，E和Z定義如上，且其中基團
通過肽鍵結合到P’的C-末端。
這樣的化合物的具體實例包括Lysε(4-((2-(1-(mPEG羰基)哌啶-4-基)乙氧基)亞氨基)戊?；?192)hGH(1-192)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；(Lysε(4-((3-(棕櫚?；被?丙氧基)亞氨基)戊?；?192)hGH(1-192)酰胺；(Lysε(4-((3-((2S)-2，6-mPEG羰基氨基)己?；被?丙氧基)亞氨基)戊酰基)34)GLP-2(1-34)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；(Lysε(4-(1-(2-(3-(mPEG)丙?；被?肼基)乙基)苯甲?；?192)hGH(1-92)酰胺，其中mPEG具有10kDa的分子量；(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺；(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺；3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲?；?3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲?；?丙酸；11-(4-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸；11-(5-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸11-(4-(4-((S)-2-氨甲?；?2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸；11-(5-(4-((S)-2-氨甲?；?2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸；2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺；和2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
胰島素可以用于治療或預防糖尿病，在一個實施方案中，本發(fā)明從而提供了治療1型或2型糖尿病的方法，該方法包含給需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的胰島素或胰島素化合物綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的胰島素或胰島素化合物綴合物在生產用于治療1型或2型糖尿病的藥物中的用途。
GLP-1可以用于治療高血糖癥，2型糖尿病，葡萄糖耐受不良，1型糖尿病，肥胖，高血壓，綜合征X，異常脂血癥(dyslipidemia)，β-細胞凋亡，β-細胞缺乏癥，炎性腸綜合征，消化不良，認知障礙例如認知增強，神經(jīng)保護，動脈粥樣硬化，冠心病和其它的心血管障礙。在一個實施方案中，本發(fā)明從而提供了治療所述疾病的方法，該方法包含給需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的GLP-1或GLP-1化合物綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的GLP-1或GLP-1化合物綴合物在生產用于治療上述疾病的藥物中的用途。
GLP-2可以用于治療會導致營養(yǎng)物在腸中的吸收障礙的腸故障，具體地，GLP-2可以用于治療小腸綜合征，炎性腸綜合征，克羅恩病，結腸炎包括膠原性結腸炎、放射性結腸炎，輻射后的萎縮，非熱帶性(谷蛋白耐受不良)和熱帶性口炎性腹瀉、血管阻塞或創(chuàng)傷后受損的組織，旅行者腹瀉，脫水，菌血癥，敗血癥，神經(jīng)性厭食癥，化療后受損的組織，早產兒，schleroderma，胃炎包括萎縮性胃炎、竇切除術后的萎縮性胃炎和幽門螺桿菌胃炎，潰瘍，腸炎，陷凹(cul-de-sac)，淋巴管阻塞，脈管病和移植物抗宿主病，手術過程后的愈合，輻射后的萎縮和化療，和骨質疏松癥。因此，本發(fā)明的一個目的是，提供治療上述疾病的方法，該方法包含給需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的GLP-2或GLP-2化合物綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的GLP-2或GLP-2化合物綴合物在生產用于治療上述疾病的藥物中的用途。
生長激素已經(jīng)涉入治療能從生長激素的血漿水平的提高獲益的疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療下述疾病的方法生長激素缺乏(GHD)；特納綜合征；普-韋綜合征(PWS)；努南綜合征；唐氏綜合征；慢性腎臟疾病，青少年類風濕關節(jié)炎；囊性纖維化，接受HAART治療的兒童(HIV/HALS兒童)的HIV-感染；短孕齡(SGA)出生的矮小兒童；出生時體重非常低(VLBW)但是SGA的兒童的身材矮小癥；骨骼發(fā)肩異常；軟骨發(fā)育不良；軟骨發(fā)育不全；特發(fā)性身材矮小癥(ISS)；成年人的GHD；長骨的骨折，例如脛骨，腓骨，股骨，肱骨，橈骨，尺骨，鎖骨，matacarpea，matatarsea，和趾(指)；松質骨的骨折，例如顱骨(scull)，手基底，和腳基底；腱或韌帶手術(例如，在手、膝或肩中)后的患者；接受或經(jīng)歷分散骨發(fā)生(distractionoteogenesis)的患者；髖關節(jié)或板(discus)置換、半月板修復、脊柱融合或假肢固定(例如，在膝、髖、肩、肘、腕或顎中)后的患者；其中已經(jīng)固定了骨接合材料(例如釘子，螺絲釘和板材)的患者；骨折未連接或連接不正的患者；osteatomia(例如，從脛骨或趾)后的患者；移植物植入后的患者；外傷或關節(jié)炎造成的膝蓋中的關節(jié)軟骨變性；特納綜合征患者中的骨質疏松癥；男性骨質疏松癥；長期透析的成年患者(APCD)；APCD中的營養(yǎng)不良有關的心血管疾??；APCD中的惡病質的逆轉；APCD中的癌癥；APCD中的慢性abstractive肺??；APCD中的HIV；為APCD的老年人；APCD中的慢性肝病，APCD中的疲勞綜合征；克羅恩?。桓喂δ懿涣迹籋IV感染的男性；短腸綜合征；向心性肥胖；HIV-有關的脂肪營養(yǎng)不良綜合征(HALS)；男性不育；大選擇性外科手術、醇/藥物解毒或神經(jīng)創(chuàng)傷后的患者；老化；虛弱的老年人；骨關節(jié)炎；外傷損傷的軟骨；勃起功能障礙；纖維肌痛(fibromyalgia)；記憶障礙；抑郁；外傷性腦損傷；蛛網(wǎng)膜下出血；出生時體重非常低；代謝綜合征；糖皮質激素肌病；或由于兒童中的糖皮質激素治療而引起的身材矮小癥，該方法包含給需要的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的生長激素化合物綴合物。
在一方面，本發(fā)明提供了加速肌肉組織、神經(jīng)組織或傷口的愈合的方法；加速或提高向受損組織的血流的方法；或降低受損組織的感染速度的方法，該方法包含給需要的患者施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的生長激素化合物綴合物。
在一方面，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的生長激素化合物綴合物在生產用于治療上述疾病的藥物中的用途。
細胞因子涉入與免疫系統(tǒng)有關的大量疾病的病因學。具體地，提及IL-20可能涉及銀屑病和它的治療，且認為I-21涉及癌癥，和可以用于治療該疾病。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療銀屑病的方法，包含施用根據(jù)本發(fā)明的IL-20綴合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的IL-20綴合物在生產用于治療銀屑病的藥物中的用途。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療癌癥的方法，該方法包含施用本發(fā)明的IL-21綴合物給需要的受試者。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的IL-21綴合物在生產用于治療癌癥的藥物中的用途。
TTF肽可以用于增加受試者的粘膜層的粘度；減少唾液的分泌，例如當唾液分泌增加是由輻照治療、用抗膽堿能藥治療或斯耶格倫綜合征造成的時候；治療過敏性鼻炎，創(chuàng)傷、休克、大手術、腎或肝病、使用NSAID(例如阿司匹林、類固醇或醇)的治療后的應力誘發(fā)的胃潰瘍。TTF肽也可以用于治療克羅恩病，潰瘍性結腸炎，角膜結膜炎，慢性膀胱感染，腸膀胱炎，乳頭狀瘤和膀胱癌。在一個實施方案中，本發(fā)明因而涉及治療上述疾病或狀態(tài)的方法，該方法包含向需要的受試患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的TTF綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的TTF綴合物在生產用于治療上述疾病或狀態(tài)的藥物中的用途。
黑皮質素受體修飾劑(具體地，黑皮質素4受體激動劑)已經(jīng)涉入肥胖和有關疾病的治療和預防。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了預防或延遲葡萄糖耐受不良(IGT)向非胰島素需要性2型糖尿病的進展，預防或延遲非胰島素需要性2型糖尿病向胰島素需要性糖尿病的進展，治療肥胖和調節(jié)食欲。黑皮質素4受體激動劑還已經(jīng)涉入治療選自下述的疾病動脈粥樣硬化，高血壓，糖尿病，2型糖尿病，葡萄糖耐受不良(IGT)，脂血癥，冠心病，膽囊病，膽石，骨關節(jié)炎，癌癥，性功能障礙和早產兒死亡的危險。在一個實施方案中，本發(fā)明因而提供了治療上述疾病或狀態(tài)的方法，該方法包含給需要的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的黑皮質素4受體激動劑綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的黑皮質素4受體激動劑綴合物在生產用于治療上述疾病或狀態(tài)的藥物中的用途。
因子VII化合物已經(jīng)涉入治療與凝結有關的疾病，具體地，生物活性的因子VII化合物已經(jīng)涉入治療血友病(hemophi1iacs)，具有因子VIII和IX的抑制劑的血友病(hemophiliacs)，血小板減少癥的患者，血小板病(例如格蘭茲曼血小板機能不全、血小板釋放缺陷和儲存庫缺陷(storage pool defect)的患者，維勒布蘭德病的患者，肝病的患者，和與創(chuàng)傷或手術有關的出血問題。生物上無活性的因子VII化合物已經(jīng)涉入治療處于凝固性過高狀態(tài)的患者，例如敗血病、深靜脈血栓形成的患者，處于心肌感染或血栓形成性中風、肺栓塞的危險中的患者，急性冠狀綜合征的患者，接受冠狀強心劑(coronarycardiac)的患者，接受血管成形術的患者的心臟事件和再狹窄的預防，外周血管疾病的患者，和急性呼吸窘迫綜合征。在一個實施方案中，本發(fā)明因而提供了治療上述疾病或狀態(tài)的方法，該方法包含給需要的受試者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明的因子VII化合物綴合物。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的因子VII化合物綴合物在生產用于治療上述疾病或狀態(tài)的藥物中的用途。
在治療中使用超過一種藥物(伴隨地施用或依次地施用)可以治療許多疾病。因此，在治療一種上述疾病的方法中，與一種或多種常用于治療所述疾病的其它治療活性的化合物相組合來使用本發(fā)明的肽綴合物，在本發(fā)明的范圍內。類似地，在生產用于所述疾病的藥物中，與常用于治療一種上述疾病的其它治療活性的化合物相組合來使用本發(fā)明的肽綴合物，也在本發(fā)明的范圍內。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的綴合的肽在診斷中的用途。
如前所述，α-氨基酸酰胺特別適合用作在本發(fā)明的方法中的親核體。在一個實施方案中，本發(fā)明因而提供了根據(jù)式(I)的化合物 其中A和E獨立地代表C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；B和D代表著-C(O)-或-NH-，條件是，當B代表著-C(O)-時，則D必然代表著-NH-，且當B代表著-NH-時，則D必然代表著-C(O)-；且G代表著氫或C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基或芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基。
在一個實施方案中，A和E獨立地代表C1-6亞烷基，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞己基，或亞芳基，例如亞苯基。
在一個實施方案中，G代表著氫或甲基，乙基，丙基或丁基。
式I化合物的具體實例包括(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸酰胺，4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁?；被?己酸酰胺，3-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，和2-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式II的化合物
其中J和L獨立地代表C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；且M代表著氫或C1-6烷基。
在一個實施方案中，J和L獨立地代表C1-6亞烷基，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞己基，或亞芳基，例如亞苯基。
在一個實施方案中，M代表著氫或甲基，乙基，丙基或丁基。
在一個實施方案中，式II的化合物選自(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，和(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式III的化合物 其中Q代表著C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；且T代表著氫或C1-6烷基。
在一個實施方案中，Q代表著C1-6亞烷基，例如亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞己基，或亞芳基，例如亞苯基。
在一個實施方案中，T代表著氫或甲基，乙基，丙基或丁基。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)式IV的化合物
其中J”和L”獨立地代表著C1-6亞烷基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基。
在一個實施方案中，J和L獨立地代表亞甲基或亞乙基。
在一個實施方案中，式IV的化合物選自(S)-2-氨基-3-(4-(炔丙基氧基)苯基)丙酰基酰胺。
藥物組合物本發(fā)明的另一個目的是提供藥物組合物，其包含式[a]的化合物，后者以10-12mg/ml至200mg/ml，例如10-10mg/ml至5mg/ml的濃度存在，且其中所述的組合物具有2.0至10.0的pH。組合物還可以包含緩沖系統(tǒng)，防腐劑，張力劑(tonicity agent)，螯合劑，穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物組合物是水性組合物，即包含水的組合物。這樣的組合物典型地是溶液或懸浮液。在本發(fā)明的另一個實施方案中，藥物組合物是水溶液。術語“水性組合物”被定義為包含至少50％w/w水的組合物。類似地，術語“水溶液”被定義為包含至少50％w/w水的溶液，和術語“水性懸浮液”被定義為包含至少50％w/w水的懸浮液。
在另一個實施方案中，藥物組合物是冷凍干燥的組合物，在使用之前，醫(yī)生或患者向其中加入溶劑和/或稀釋劑。
在另一個實施方案中，藥物組合物是無需任何事先溶解即可使用的干燥的組合物(例如冷凍干燥的或噴霧干燥的)。
在另一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含式[a]的化合物的水溶液以及緩沖劑，其中所述的式[a]化合物以0.1-100mg/ml或更大的濃度存在，且其中所述的組合物具有約2.0至約10.0的pH。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物的pH選自下表2.0，2.1，2.2，2.3，2.4，2.5，2.6，2.7，2.8，2.9，3.0，3.1，3.2，3.3，3.4，3.5，3.6，3.7，3.8，3.9，4.0，4.1，4.2，4.3，4.4，4.5，4.6，4.7，4.8，4.9，5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3，8.4，8.5，8.6，8.7，8.8，8.9，9.0，9.1，9.2，9.3，9.4，9.5，9.6，9.7，9.8，9.9，和10.0。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，緩沖劑選自醋酸鈉，碳酸鈉，檸檬酸鹽，甘氨酰甘氨酸，組氨酸，甘氨酸，賴氨酸，精氨酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，磷酸鈉，和三(羥甲基)-氨基甲烷，N-二(羥乙基)甘氨酸，N-(羥甲基)甲基甘氨酸，蘋果酸，琥珀酸鹽，馬來酸，延胡索酸，酒石酸，天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑中的每一種構成了本發(fā)明的可替換的實施方案。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物還包含藥學上可接受的防腐劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑選自苯酚，鄰甲酚，間甲酚，對甲酚，對羥基苯甲酸甲酯，對羥基苯甲酸丙酯，2-苯氧基乙醇，對羥基苯甲酸丁酯，2-苯基乙醇，芐醇，氯代丁醇，和硫柳汞，溴硝丙二醇，苯甲酸，咪脲，Chlorohexidine，脫氫醋酸鈉，氯甲酚，對羥基苯甲酸乙酯，芐索氯銨，氯苯甘醚(3對氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以0.1mg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以0.1mg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些具體防腐劑中的每一種構成本發(fā)明的可替代的實施方案。防腐劑在藥物組合物中的應用，是技術人員眾所周知的。為了方便可參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物還包含等滲試劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲試劑選自鹽(例如氯化鈉)，糖或糖醇，氨基酸(例如L-甘氨酸，L-組氨酸，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸)，糖醇(例如甘油(丙三醇)，1，2-丙二醇，1，3-丙二醇，1，3-丁二醇)聚乙二醇(例如PEG400)，或其混合物?？梢允褂盟刑牵鐔翁?，二糖，或多糖，或水溶性的葡聚糖，包括例如果糖，葡萄糖，甘露糖，山梨糖，木糖，麥芽糖，乳糖，蔗糖，海藻糖，葡聚糖，支鏈淀粉，糊精，環(huán)糊精，可溶淀粉，羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。在一個實施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇被定義為具有至少1個-OH基團的C4-C8烴，包括例如甘露醇，山梨糖醇，肌醇，半乳糖醇，衛(wèi)矛醇，木糖醇，和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中，糖醇添加劑是甘露醇?？梢詥为毜鼗蚪M合地使用上面提及的糖或糖醇。對使用的量沒有固定的限制，只要糖或糖醇可溶于液體制劑中，且不能不利地影響使用本發(fā)明的方法得到的穩(wěn)定作用。在一個實施方案中，糖或糖醇濃度是在約1mg/ml至約150mg/ml之間。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲試劑以1mg/ml至50mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲試劑以1mg/ml至7mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲試劑以8mg/ml至24mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，等滲試劑以25mg/ml至50mg/ml的濃度存在。這些具體等滲試劑中的每一種構成本發(fā)明的可替代的實施方案。等滲試劑在藥物組合物中的應用，是技術人員眾所周知的。為了方便可參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物另外包含螯合劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽，和其混合物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以0.1mg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以0.1mg/ml至2mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的另一個實施方案中，螯合劑以2mg/ml至5mg/ml的濃度存在。這些具體螯合劑中的每一種構成本發(fā)明的可替代的實施方案。螯合劑在藥物組合物中的應用，是技術人員眾所周知的。為了方便可參見RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，第20版，2000。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物另外包含穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑在藥物組合物中的應用，是技術人員眾所周知的。為了方便可參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000。
更具體地，本發(fā)明的組合物是穩(wěn)定化的液體藥物組合物，其治療活性組分包括蛋白，后者可能在液體藥物組合物儲存過程中表現(xiàn)出聚集體形成?！寰奂w形成″意指能導致寡聚體(其可以保持可溶的)或大的可見聚集體(其可以從溶液中沉淀)形成的蛋白分子之間的物理相互作用?！鍍Υ孢^程中″意指一旦制備出、并不立即施用給受試者的液體藥物組合物或組合物。而是，在制備后，將其以液體形式、冷凍狀態(tài)或干燥形式包裝儲存，用于以后重配成適于施用給受試者的液體形式或其它形式?！甯稍镄问健逡庵敢后w藥物組合物或組合物，通過冷凍干燥(即，凍干；見，例如，Williams和Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)，噴霧干燥(見Masters(1991)，Spray-Drying Handbook(第5版；Longman Scientific andTechnical，Essez，U.K.)，第491-676頁；Broadhead等人(1992)Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；和Mumenthaler等人(1994)Pharm.Res.1112-20)，或空氣干燥(Carpenter和Crowe(1988)Cryobiology 25459-470；和Roser(1991)Biopharm.447-53)進行干燥。在液體藥物組合物儲存過程中，蛋白的聚集體形成可以負面地影響蛋白的生物學活性，導致藥物組合物的治療效能的減少。另外，聚集體形成可能造成其它的問題，例如當施用輸注系統(tǒng)施用含有蛋白的藥物組合物時，管道、膜或泵的堵塞。
本發(fā)明的藥物組合物另外可以包含足以減少組合物儲存過程中蛋白的聚集體形成的量的氨基酸堿?！灏被釅A″意指氨基酸或氨基酸的組合，其中任何給定的氨基酸都以它的游離堿形式或它的鹽形式存在。當使用氨基酸的組合時，所有的氨基酸都可以以它們的游離堿形式存在，都可以以它們的鹽形式存在，或者一些以它們的游離堿形式存在，而另一些以它們的鹽形式存在。在一個實施方案中，在本發(fā)明的組合物的制備中，使用的氨基酸是具有帶電荷的側鏈的那些，例如精氨酸，賴氨酸，天冬氨酸，和谷氨酸。特定氨基酸(甲硫氨酸，組氨酸，精氨酸，賴氨酸，異亮氨酸，天冬氨酸，色氨酸，蘇氨酸和其混合物)的任何立體異構體(即，L或D異構體，或其混合物)或這些立體異構體的組合或甘氨酸或有機堿(例如但不限于咪唑)可以存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要特定氨基酸或有機堿以它的游離堿形式或它的鹽形式存在。在一個實施方案中，使用了氨基酸的L-立體異構體。在一個實施方案中，使用了D-立體異構體。本發(fā)明的組合物也可以與這些氨基酸的類似物一起配制?！灏被犷愃莆铩逡庵柑烊划a生的氨基酸的衍生物，其能實現(xiàn)所需的減少本發(fā)明的液體藥物組合物儲存過程中蛋白的聚集體形成的作用。合適的精氨酸類似物包括，例如，氨基胍，鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和buthionine，和合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L半胱氨酸。如同其它的氨基酸一樣，將氨基酸類似物以它們的游離堿形式或它們的鹽形式整合入組合物中。在本發(fā)明的另一個實施方案中，以足以預防或延遲蛋白的聚集的濃度，使用氨基酸或氨基酸類似物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，當起治療劑作用的蛋白是包含至少1個易于氧化的甲硫氨酸殘基時，可以加入甲硫氨酸(或其它含硫的氨基酸或氨基酸類似物)，以抑制甲硫氨酸殘基向甲硫氨酸亞砜的氧化?！耙种啤币庵讣琢虬彼嵫趸奈镔|種類隨時間的最小積累。抑制甲硫氨酸氧化導致適當?shù)姆肿有问降牡鞍椎母蟊Ａ?。可以使用甲硫氨酸的任何立體異構體(L或D異構體)或其任意組合。要加入的量應當是，足以抑制甲硫氨酸殘基的氧化的量，使甲硫氨酸亞砜的量能被管理當局接受。典型地，這意味著，組合物含有不超過約10％至約30％甲硫氨酸亞砜。通常，這可以通過添加甲硫氨酸，從而使添加的甲硫氨酸與甲硫氨酸殘基的比例是約1∶1-約1000∶1，例如10∶1-約100∶1，而得到。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物另外還包含選自高分子量聚合物或低分子化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)，聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，羧基/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC，HPC-SL，HPC-L和HPMC)，環(huán)糊精，含硫的物質例如一硫代甘油、巰基乙酸和2-甲基硫代乙醇，和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩(wěn)定劑中的每一種構成本發(fā)明的可替代的實施方案。
藥物組合物也可以包含附加的穩(wěn)定劑，其進一步增強其中的治療活性蛋白的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別感興趣的穩(wěn)定劑包括但不限于甲硫氨酸和EDTA，其能保護蛋白抗甲硫氨酸氧化；和非離子性表面活性劑，其能保護蛋白抗與冷凍-融化或機械剪切有關的聚集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，組合物另外還包含表面活性劑。在本發(fā)明的另一個實施方案中，表面活性劑選自去污劑，乙氧基化的蓖麻油，聚乙二醇化的(polyglycolyzed)甘油酯，乙酰基化的甘油單酯，山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，例如PluronicF68，泊洛沙姆188和407，Triton X-100)，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷基化的和烷氧基化的衍生物(吐溫，例如吐溫-20，吐溫-40，吐溫-80和Brij-35)，甘油單酯或其乙氧基化的衍生物，甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物，醇，甘油，凝集素和磷脂(例如磷脂酰絲氨酸，磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，二磷脂酰甘油和鞘磷脂)，磷脂的衍生物(例如二棕櫚酰基磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕櫚?；苎字?L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的1-?；?sn-甘油基-3-磷酸酯)和溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)-衍生物，例如溶血磷脂酰膽堿的月桂?；腿舛罐Ⅴ；苌?，二棕櫚酰基磷脂酰膽堿，和極性頭基團的修飾，其是膽堿，乙醇胺，磷脂酸，絲氨酸，蘇氨酸，甘油，肌醇，和帶正電荷的DODAC，DOTMA，DCP，BISHOP，溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸，和甘油基磷脂(例如腦磷脂)，甘油基糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)，鞘糖脂(例如神經(jīng)酰胺，神經(jīng)節(jié)苷脂)，十二烷基磷酸膽堿，雞蛋溶血卵磷脂，梭鏈孢酸衍生物-(例如tauro-二氫梭鏈孢酸鈉等)，長鏈脂肪酸和其鹽C6-C12(例如油酸和辛酸)，?；鈮A和衍生物，賴氨酸、精氨酸或組氨酸的Nα-?；难苌铮蛸嚢彼峄蚓彼岬膫孺滜；难苌?，包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸的任意組合的二肽的Nα-?；难苌?，包含中性氨基酸和2個帶電荷的氨基酸的任意組合的三肽的Nα-?；难苌?，DSS(多庫酯鈉，CAS登記號[577-11-7])，多庫酯鈣(CAS登記號[128-49-4])，多庫酯鉀(CAS登記號[7491-09-0])，SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)，辛酸鈉，膽酸或其衍生物，膽汁酸和其鹽和甘氨酸或?；撬峋Y合物，熊去氧膽酸，膽酸鈉，脫氧膽酸鈉，?；悄懰徕c，甘氨膽酸鈉，N-十六烷基-N，N-二甲基-3-ammonio-1-丙烷磺酸鹽，陰離子的(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑，兩性離子的表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基ammonio-1-丙烷磺酸鹽，3-cholamido-1-丙基二甲基ammonio-1-丙烷磺酸鹽，陽離子的表面活性劑(季銨堿)(例如溴化鯨蠟基-三甲基銨，氯化鯨蠟基吡啶)，非離子的表面活性劑(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)，poloxamines(例如Tetronic’s)，它們是由向1，2-乙二胺依次添加環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷而衍生的四官能的嵌段共聚物，或者表面活性劑可以選自咪唑啉衍生物，或其混合物。這些具體表面活性劑中的每一種，構成本發(fā)明的可替代的實施方案。
表面活性劑在藥物組合物中的應用，是技術人員眾所周知的。為了方便可參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，2000。
在本發(fā)明的藥物組合物中，可以存在其它的成分。這樣的附加成分可以包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調節(jié)劑、螯合劑、金屬離子、油質載體，蛋白(例如，人血清白蛋白，明膠或蛋白)和兩性離子(例如，氨基酸例如甜菜堿，牛磺酸，精氨酸，甘氨酸，賴氨酸和組氨酸)。這樣的附加成分，當然不應當負面地影響本發(fā)明的藥物組合物的總體穩(wěn)定性。
可以將含有根據(jù)本發(fā)明的式[a]化合物的藥物組合物在幾個位點施用給需要這樣的治療的患者，例如在局部位點，例如，皮膚和粘膜位點，在能繞過吸收的位點，例如在動脈、靜脈、心臟中施用，和在包含吸收的位點，例如在皮膚中、皮膚下、肌肉中或腹部中施用。
根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用，可以通過幾種施用途徑，例如舌的，舌下，口腔的，嘴中，經(jīng)口的，胃和腸內，鼻的，肺的(例如，通過細支氣管和槽或其組合)，表皮的，皮膚的，透皮的，陰道的，直腸的，眼睛的(例如通過結膜)，輸尿管的和腸胃外的，施用給需要這樣的治療的患者。
本發(fā)明的組合物可以以幾種劑型施用，例如，作為溶液，懸浮液，乳狀液，微乳劑，復合型乳劑，泡沫，藥膏，糊劑，硬膏劑，軟膏，片劑，包衣片劑，沖洗劑，膠囊(例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊)，栓劑，直腸膠囊，滴劑，凝膠，噴霧劑，粉末，氣霧劑，吸入劑，滴眼劑，眼用軟膏，眼用沖洗劑，陰道栓劑，陰道環(huán)，陰道軟膏，注射溶液，原位轉化(例如原位凝膠化，原位定位(setting)，原位沉淀，原位結晶)溶液，輸注溶液，和植入物。
還可以例如通過共價的、疏水的和靜電的相互作用，將本發(fā)明的組合物復合入或附著至藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級的藥物遞送系統(tǒng)，以進一步增強式[a]化合物的穩(wěn)定性，提高生物利用度，提高溶解度，降低不利作用，實現(xiàn)本領域的技術人員眾所周知的長期治療，并提高患者順從性，或其任意組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和高級藥物遞送系統(tǒng)的實例包括但不限于聚合物，例如纖維素和衍生物，多糖，例如葡聚糖和衍生物，淀粉和衍生物，聚乙烯醇，丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物，聚乳酸和聚乙醇酸和其嵌段共聚物，聚乙二醇，載體蛋白，例如白蛋白，凝膠，例如熱膠凝系統(tǒng)，例如本領域的技術人員眾所周知的嵌段共聚物系統(tǒng)，膠束，脂質體，微球，納米顆粒，液晶和其分散體，L2相和其分散體，這是脂-水系統(tǒng)中的相行為領域的技術人員眾所周知的，聚合的膠束，復合型乳劑，自乳化劑，自微乳化劑，環(huán)糊精和其衍生物，和樹枝狀聚合物(dendrimer)。
使用例如計量劑量的吸入器，干粉吸入器和噴霧器(它們都是本領域的技術人員眾所周知的裝置)可以將本發(fā)明的組合物用于對于肺部施用式[a]化合物的固體、半固體、粉末和溶液的組合物中。
本發(fā)明的組合物特別可用于受控的、持續(xù)的、延長的、延遲的和緩慢的釋放藥物遞送系統(tǒng)。更具體地，但不限于，組合物可以用于本領域的技術人員眾所周知的腸胃外的受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)(兩種系統(tǒng)都會導致施用次數(shù)的許多倍減少)的組合物中。更優(yōu)選地，受控釋放和持續(xù)釋放系統(tǒng)經(jīng)皮下施用。不限制本發(fā)明的范圍，有用的受控釋放系統(tǒng)和組合物的實例是水凝膠，油質凝膠，液晶，聚合的膠束，微球，納米顆粒。
生產用于本發(fā)明的組合物的受控釋放系統(tǒng)的方法，包括但不限于結晶、冷凝，共結晶，沉淀，共沉淀，乳化，分散，高壓均化，包膠，噴霧干燥，微膠囊化，凝聚，相分離，溶劑蒸發(fā)以產生微球，擠出，和超臨界流體過程。一般參考見Handbook of PharmaceuticalControlled Release(Wise，D.L.，編，Marcel Dekker，New York，2000)和Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.99ProteinComposition and Delivery(MacNally，E.J.，編，Marcel Dekker，New York，2000)。
借助于注射器，任選地鋼筆狀注射器，可以通過皮下的、肌肉內的、腹膜內的或靜脈內的注射進行腸胃外的施用。或者，借助于輸注泵，可以進行腸胃外的施用。另一個選擇是組合物，它可以是用于以鼻的或肺的噴霧形式施用式[a]化合物的溶液或懸浮液。作為另一個選擇，本發(fā)明的含有式[a]化合物的藥物組合物也可以適用于透皮的施用，例如通過無針頭的注射或從貼劑(任選地離子導入貼劑(iontophoretic patch)，或者透粘膜的(例如口腔的)施用。
本文引用的所有文獻，包括出版物、專利申請和專利，都整體引作參考，其程度為似乎單獨地和具體地指出將每一篇引作參考，且在本文中整體提及(至法律允許的最大程度)。
在本文中使用的所有標題和小標題都僅僅為了方便，不論如何不應當理解為限制本發(fā)明。
本文提供的任何和所有實施例或示例性的語言(例如，“例如”)的使用，僅僅意在更好地解釋本發(fā)明，不會限制本發(fā)明的范圍，除非另有聲明。在說明書中的語言，不應當理解為表示任何未聲明的元素是實現(xiàn)本發(fā)明所必需的。
本文的專利文件的引用和整合，僅僅為了方便，而不反映這樣的專利文件的任何有效性、可專利性和/或可實施性的觀點。
本發(fā)明包括適用法律允許的所附權利要求中所陳述的主題的所有改進和等同方案。
實施例為化學基團使用了下面的縮寫
使用了下面的其它縮寫DMSO二甲亞砜CHCA4-羥基-α-氰基肉桂酸
CPY羧肽酶Y。
HPLC-方法方法02-B4-4使用裝配了Waters 2487雙段檢測器的Alliance Waters 2695系統(tǒng)，進行了RP-分析。使用Symmetry300 C18，5um，3.9mm×150mm柱(42℃)收集了在214nm和254nm的UV檢測物。在用0.05％三氟乙酸緩沖的水中的5-95％乙腈的線性梯度，以1.0分鐘/分鐘的流速，經(jīng)15分鐘，洗脫了化合物。
方法03-B1-1使用裝配了Waters 996二極管陣列探測器的Waters 2690系統(tǒng)，進行了RP-分析。在218TP54 4.6mm×250mm 5μC-18二氧化硅柱(The Seperations Group，Hesperia)(其在42℃、1ml/分鐘洗脫)上，在214，254，276，和301nm收集了UV檢測物。使用用0.1％三氟乙酸緩沖的5％乙腈(在三氟乙酸的0.1％水溶液中)平衡柱。注射后，經(jīng)50分鐘，通過0.1％三氟乙酸緩沖的0％至90％乙腈(在三氟乙酸的0.1％水溶液中)的梯度洗脫樣品。
在500-1800Da范圍的Agilent 1100 Series上，或在500-2000Da范圍的Perkin Elmer PE API 100上，得到了肽的質譜。典型地，發(fā)現(xiàn)的m/z信號與一系列的z＝1，2，3，4，5，或6中的任一個相對應。
在Bruker Daltonix autoflex上，得到了MALDI-TOF圖譜。
轉?；衔?，例如下式的化合物 和綴合部分Y-E-Z，可以商購獲得或者根據(jù)下面的一般方法的指導進行合成。
一般方法(A)可以從在α-氨基處被保護的合適的氨基酸甲基酯 制備下述通式的化合物 其中R’和R”獨立地代表著C1-15亞烷基，C2-15亞烯基，C2-15亞炔基，C1-15雜亞烷基，C2-15雜亞烯基，C2-15雜亞炔基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基，所述的合適的保護基團PG記載在文獻中(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版.，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York)，其制備方法為在有或沒有合適的堿例如三乙胺或乙基二異丙基胺存在下，通過酰基化方法，例如使用合適的酸，其中X可受到或未受到如文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organicsynthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York)所述的合適的保護基團PG的保護， 和偶聯(lián)試劑，例如1-羥基苯并三唑、3，4-二氫-3-羥基苯并三嗪-4-酮或7-氮雜苯并三唑，與例如碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物相組合，形成下述類型的酯 通過在合適的溶劑或溶劑的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，與例如氨反應，可以將該酯轉化成相應的酰胺，
通過文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的方法，可以在一個或幾個步驟中，進行所有保護基團的去除， 如在一般方法(A)中所定義， 一般可商購得到氨基酸甲基酯，或者可以通過眾所周知的方法合成它們。
一般方法(B)可以從在α-氨基處被如文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York)所述的合適的保護基團PG保護的合適的氨基酸甲基酯
使用合適的醇，其中X被或未被如文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York)所述的合適的保護基團保護， 在如文獻所述的能實現(xiàn)烷基化的條件下，例如Mitsunobu條件，例如三苯膦和偶氮二羧酸乙酯，通過芳族羥基的烷基化，形成下述類型的酯 從而制備出下述通式的化合物 其中R’和R”如上所定義。
通過在合適的溶劑或溶劑的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，與例如氨反應，可以將該酯轉化成相應的酰胺，
通過文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的方法，可以在一個或幾個步驟中，進行所有保護基團的去除， 如一般方法(B)中定義的， 一般方法(C)可以從在α-氨基處被如文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York)所述的合適的保護基團PG保護的合適的氨基酸甲基酯
使用合適的烷基化試劑 其中LG’的陰離子是合適的離去基團例如鹵化物或磺酸酯，且X可被或未被如文獻(例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groupsin organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.NewYork)所述的合適的保護基團保護，通過芳族羥基的烷基化，制備下述通式的化合物 其中R’和R”如上所定義。
反應可以在堿性條件下進行，使用堿例如碳酸鉀，二氮雜雙環(huán)[5，4，0]十一碳-5-烯，或叔丁基四甲基胍，并在合適的溫度，通常為-78℃至200℃下， 通過在合適的溶劑或溶劑的混合物例如水或N，N-二甲基甲酰胺中，與例如氨反應，可以將該酯轉化成相應的酰胺，
通過如文獻，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述的方法，可以在一個或幾個步驟中進行所有保護基團的去除， 如一般方法(C)中定義的， 一般方法(D)可以從在α-氨基處被如文獻例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York所述的合適的保護基團PG保護的合適的酸 通過使用本領域技術人員已知的?；瘲l件，例如偶聯(lián)試劑例如1-羥基苯并三唑、3，4-二氫-3-羥基苯并三嗪-4-酮或7-氮雜苯并三唑，與例如碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物相組合，在有或沒有合適的堿(例如三乙胺或乙二異丙基胺)存在下，與其中X可被或未被合適的保護基團保護的合適的伯胺或仲胺反應，形成酰胺 ，從而制備下述通式的化合物 其中R’和R”如上所定義。
如文獻，T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups inorganic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述，可以在一個或幾個步驟中進行所有保護基團的去除， 如一般方法(D)所定義的， 一般方法(E)從半胱氨酸合成含有酮基的氨基酸酰胺在合適的反應條件下，用含有羰基的烷基化試劑(R50CO(CH2)nLG”處理方便地N-保護的半胱氨酸衍生物(例如酯，N-(2，4-二甲氧基芐基)酰胺或N-二(環(huán)丙基)甲基酰胺)或方便地N-保護的半胱氨酸酰胺，
其中LG”＝選自下述的用于親核置換的離去基團鹵素、磺酸酯(-O-SO2-R51)、二烷基锍、苯基碘或羥基，其中R51代表著C1-6烷基、部分地或完全地氟化的C1-6烷基或芳基，其任選地被下述基團取代烷基、鹵素、硝基、氰基或乙酰氨基，且R50代表著氫、烷基、芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基任選地被下述基團取代一次或多次C1-6烷氧基、羥基、鹵素、氰基、?；?、烷基或硝基，產生S-烷基化的半胱氨酸衍生物。通過將該酸衍生物轉化成酰胺和α-氨基的去保護，將該衍生物轉化成氨基酸酰胺。合適的N-保護基團是例如三苯甲基，鄰苯二甲?；?，或烷氧基羰基，例如叔丁氧基羰基， 其中n代表著1-10的整數(shù)。
一般方法(F)從天冬氨酸或谷氨酸合成含有酮基的氨基酸酰胺通過用甲醛處理N-烷氧基羰基衍生物而生成如下所示的環(huán)狀酯，可以選擇性地保護天冬氨酸或谷氨酸 通過激活羧酸(LvG代表著鹵素，芳氧基，或雜芳氧基)和與碳親核體R80-M1的反應，其中R80代表著烷基、芳基或雜芳基，所述的芳基或雜芳基任選地被下述基團取代一次或幾次C1-6烷氧基、羥基、鹵素、氰基、?；⑼榛蛳趸?，且其中M1代表著堿金屬，Mg、Zn、Ti、Zr、Mn、Cu、Ce或Ca，任選地在合適的催化劑存在下，這些衍生物，其中R60代表著叔丁基、芐基、2-氯芐基、烯丙基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基、2，2，2-三氯乙基或二苯甲基，可以轉化成受保護的、含酮的氨基酸衍生物。產物與氨的反應和去保護，會生成需要的氨基酸酰胺， 同樣地，N-烷氧基羰基焦谷氨酸酯，其中R70代表著叔丁基，芐基，2-氯芐基，烯丙基，2-(三甲基甲硅烷基)乙基，2，2，2-三氯乙基，或二苯甲基，和R80代表著低級烷基，與親核碳試劑的反應，可以生成受保護的、含有酮基團的氨基酸衍生物。產物與氨的反應和去保護，會生成需要的氨基酸酰胺 同樣地，可以在碳上選擇性地?；缦滤镜暮线m地N-保護的谷氨酸二酯，其中R90代表著低級烷基，以在水解和脫羧基后，生成含有酮基的氨基酸的受保護的衍生物，其可以通過標準方法轉化成氨基酸酰胺， 一般方法(G)從合適的受保護的伯胺或仲胺
其中PG可以是合適的保護基團，如文獻，例如T.W. Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 JohnWiley & Sons，Inc.New York中所述，且其中LG的陰離子是離去基團，例如鹵化物或磺酸酯，可以制備出下述通式的化合物 其中R代表著C1-15亞烷基，C2-15亞烯基，C2-15亞炔基，C2-15雜亞烷基，C2-15雜亞烯基，C2-15雜亞炔基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基。
該胺與合適的受保護的羥基胺反應， 其中PG’是以下述方式選擇的保護基團，即可以從胺去除PG，而不從羥基胺去除PG’。可以在文獻中找到它的實例，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991John Wiley & Sons，Inc.New York。
在堿性條件下，例如氫化鈉，在合適的溫度例如-78℃至200℃，使2種組分反應， 利用文獻所述的方法，可以選擇性地去除胺的保護基團， 在有或沒有合適的堿例如三乙胺或乙基二異丙基胺存在下，用合適的酸和偶聯(lián)試劑例如1-羥基苯并三唑、3，4-二氫-3-羥基苯并三嗪-4-酮或7-氮雜苯并三唑，與例如碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺或1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物相組合，可以?；摪罚甚０?，
最后，通過文獻，例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中所述的方法，可以去除羥基胺的保護基團， 一般方法(H)下述通式的化合物 可以通過加入水合肼，在合適的溶劑(例如乙醇)中，從合適的酯，其中RIV是C1-10烷基，而制備得到， 一般方法(J)轉?；磻诤线m的溫度，例如5-50℃或室溫，將所討論的肽(終濃度1-10mM)和所討論的親核試劑(終濃度10mM-2M)的溶液溶解或懸浮在含有低濃度的EDTA的水中。
可以加入有機溶劑，以提高反應物的溶解度。利用合適的緩沖劑例如磷酸鹽緩沖劑或HEPES，可以將混合物緩沖至合適的pH-值，例如pH1至pH14，例如pH3.5至pH9，pH6至pH8.5，或者可以通過加入堿或酸來維持pH。將合適的酶例如羧肽酶Y加入肽和親核試劑的所述混合物中。經(jīng)過合適的時間后，例如5分鐘至10天，可以通過改變溫度或pH-值，通過加入有機溶劑，和通過滲析和凝膠過濾，終止反應。
例如通過要綴合的肽的溶解度和要使用的酶的活性，可以確定pH的選擇。肽的溶解度很大程度上由肽的pKa決定。一般地，當pH等于肽的pKa時，給定的肽的溶解度是在它的最小值。仔細考慮了上述因素而選擇進行反應的pH，在技術人員的能力范圍之內。
一般方法(K)肟形成通過將所討論的轉?；碾?，其中RV可以是取代的或未取代的芳族環(huán)、取代的或未取代的雜芳族環(huán)、氫或C1-10烷基，溶解到水中，可以形成肟部分?？梢约尤胗袡C溶劑，以提高溶解度。將溶液緩沖至合適的pH-值，例如pH0至pH14，pH3至pH6，或pH5，并保持在合適的溫度例如0-60℃。加入所討論的羥基胺，根據(jù)下面的反應流程，形成肟部分。
例如通過要綴合的肽的溶解度，可以確定pH的選擇。肽的溶解度很大程度上由肽的pKa決定。一般地，當pH等于肽的pKa時，給定的肽的溶解度是在它的最小值。仔細考慮了上述因素而選擇進行反應的pH，在技術人員的能力范圍之內。
一般方法(L)腙形成腙形成(I)通過將所討論的轉酰化的肽，其中RVI可以是取代的或未取代的芳族環(huán)、取代的或未取代的雜芳族環(huán)、氫或C1-10烷基，溶解在水中，可以形成腙部分。將溶液緩沖至合適的pH-值，例如pH2至pH14或pH0至pH4，并保持在合適的溫度，例如0-60℃。加入所討論的酰肼，從而形成腙， 腙形成(II)通過將所討論的轉?；碾?，其中RVII可以是取代的或未取代的芳族環(huán)、取代的或未取代的雜芳族環(huán)、氫或C1-10烷基，溶解在水中，可以形成腙。將溶液緩沖至合適的pH-值，例如pH 2至pH 14或pH 0至pH 4，并保持在合適的溫度，例如0-60℃。加入所討論的肼，從而形成腙，
一般方法(M)異唑形成通過腈-氧化物和炔烴之間的反應，可以形成異唑。通過向過量的合適的肟中加入合適的氧化劑(例如漂白劑)，可以形成腈-氧化物。可以將過量的新形成的腈-氧化物的溶液加入所討論的肽中。
一般方法(N)三唑形成當在合適的溶劑例如水或水和有機溶劑(例如乙腈)的混合物中有Cu(I)-離子存在的情況下，通過附著在基團Z上的疊氮化物和附著在所討論的肽上的炔烴之間的反應，可以形成三唑。可以以2種可能的區(qū)域異構體(regioisomer)形成三唑。
一般方法(O)三唑形成當在合適的溶劑例如水或水和有機溶劑(例如乙腈)的混合物中有Cu(I)-離子存在的情況下，通過附著在基團Z上的炔烴和附著在所討論的肽上的疊氮化物之間的反應，可以形成三唑?？梢砸?種可能的區(qū)域異構體形成三唑。
一般方法(P)酰胺形成通過共價地附著到肽上的疊氮化物和含有三苯膦-部分的酯之間的反應，可以區(qū)域選擇性地形成酰胺，如例如Tetrahedron Lett.2003，44，4515-4518所述。
一般方法(Q)酰胺形成通過共價地附著到肽上的疊氮化物和含有二苯膦-部分的硫代酸酯之間的反應，可以區(qū)域選擇性地形成酰胺，如例如J.Org.Chem.2002，67，4993-4996所述。
一般方法(R)芳基炔烴形成在有水可溶性的鈀催化劑存在下，通過共價地附著到肽上的炔烴和鹵代芳基化合物之間的反應，可以形成芳基炔烴，如例如Bioconjugate Chemistry，2004，15，231-234所述。鹵代芳基化合物可以與對應的芳基三氟磺酸酯互換。
一般方法(S)芳基炔烴形成在有水可溶性的鈀催化劑存在下，通過共價地附著到肽上的鹵代芳基-部分和炔烴之間的反應，可以形成芳基炔烴，如例如Bioconjugate Chemistry，2004，15，231-234所述。也可以使用綴合到肽上的三氟磺酰氧基芳基-部分替代鹵代芳基-部分。
一般方法(T)從在α-氨基處被酸-不穩(wěn)定的保護基團PG1(例如BOC或三苯甲基)保護、且在ω-氨基處被堿-不穩(wěn)定的保護基團PG2(例如Fmoc)保護的合適的氨基酸，可以制備出下述通式的化合物 其中R’和R”定義如上。使用本領域技術人員已知的標準偶聯(lián)條件，例如使用碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺，在有或沒有試劑例如1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-氮雜苯并三唑或3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，和在有或沒有堿例如三乙胺或乙基二異丙基胺存在下，可以將酸附著到Rink-酰胺樹脂上。于在文獻例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley & Sons，Inc.New York中對于特定保護基團所述的堿性條件下，可以去除ω-胺處的保護基團PG2。
使用標準偶聯(lián)條件，例如使用碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺，在有或沒有試劑例如1-羥基苯并三唑，1-羥基-7-氮雜苯并三唑或3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，和在有或沒有堿例如三乙胺或乙基二異丙基胺存在下，可以將酸連接到ω-氨基部分上。在酸性條件下，例如三氟乙酸或三氟乙酸在二氯甲烷中的20-70％溶液，可以從固體支持物上裂解下中間體，生成需要的aminamide。
一般方法(U)下述通式的化合物
其中R’和R”如上所定義，可以從被酸不穩(wěn)定的保護基團PG1(例如Boc或三苯甲基)保護的合適的氨基酸制備，其在有偶聯(lián)劑例如碳二亞胺例如二異丙基碳二亞胺存在下，在有或沒有試劑例如1-羥基苯并三唑、1-羥基-7-氮雜苯并三唑或3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪存在下，與過量的氨反應， 用合適的鹵化物或磺酸酯，其中Ra是任何合適的取代的烷基或芳基，在有合適的堿例如碳酸鉀或四甲基胍存在下，可以烷基化酚羥基。在酸性條件下，如在文獻例如T.W.Greene，P.G.M.Wuts，Protective groups in organic synthesis，第2版，1991 John Wiley& Sons，Inc.New York中對于選擇的特定保護基團所述，可以從α氨基酸去除保護基團PG1，生成需要的氨基酰胺。
一般方法(V)PEG-試劑從合適的酸，其可以在合適的溶劑例如N，N-二甲基甲酰胺存在下，通過與合適的試劑或試劑組合例如2-琥珀酰亞胺基-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸鹽(TSTU)的反應而被活化，可以制備出下述通式的試劑 其中 是E，如上所定義。
活化的酸(例如得到的所述酸的2，5-二氧代pyrrodin-1基酯)可以與商購可得的用伯胺官能化的PEG-試劑反應，任選地在合適的堿例如乙基二異丙基胺或三乙胺存在下。
實施例1(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺 Step A(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸甲酯 將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(3.23g，16.8mmol)加入苯甲?；?3.00g，16.8mmol)和3，4-二氫-3-羥基苯并三嗪-4-酮(2.75g，16.8mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和二氯甲烷(20ml)的混合物中的溶液中。在室溫攪拌反應混合物20分鐘。相繼加入BOC-Lys-OMe的鹽酸鹽(5.00g，16.8mmol)和乙基二異丙基胺(8.65ml，50.5mmol)。將反應混合物攪拌16小時。用乙酸乙酯(300ml)稀釋，并用半濃縮的碳酸氫鈉溶液洗滌(2×300ml)。經(jīng)硫酸鎂干燥有機層。真空去除溶劑。通過使用乙酸乙酯/庚烷2∶1作為洗脫劑的二氧化硅(90g)上的快速色譜法純化粗產物，生成2.41g(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸甲酯。
1H-NMR(CDCl3)δ1.30-1.90(m，6H)；1.44(s，9H)；2.61(t，2H)；3.20(q，2H)；3.37(t，2H)；4.25(m，1H)；5.20(br，1H)；5.90(br，1H)；7.46(m，2H)；7.50(m，1H)；8.00(d，2H)。
步驟B[(1S)-1-氨甲?；?5-(4-氧代-4-苯基丁?；被?戊基]氨基甲酸叔丁酯 將氨在水中的25％溶液(25ml)加入(2S)-2-叔-(丁氧基羰基氨基)-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸甲酯(0.70g，1.67mmol)中。在室溫攪拌反應混合物2天。真空去除溶劑，生成0.56g[(1S)-1-氨甲?；?5-(4-氧代-4-苯基丁?；被?戊基]氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)δ0.90(m，6H)；2.75(t，2H)；3.20-3.50(m，4H)；4.15(m，1H)；7.35-7.60(m，3H)；8.00(d，2H)。
步驟C將三氟乙酸(25ml)加入[(1S)-1-氨甲?；?5-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)戊基]氨基甲酸叔丁酯(0.56g，1.38mmol)在二氯甲烷(25ml)中的溶液中。在室溫攪拌反應混合物1小時。去除溶劑。通過在RP-18柱上的HPLC(使用20-45％乙腈在水中的梯度，其含有0.1％三氟乙酸作為緩沖劑)，純化粗產物，生成92mg純度為約85％的標題化合物，將其用于進一步的實驗。
1H-NMR(CDCl3)δ1.40(m，4H)；1.70(m，2H)；2.46(t，2H)；3.00(q，2H)；3.23(t，2H)；3.70(m，1H)；7.53(m，3H)；7.65(t，1H)；7.83(br，1H)；7.90(t，1H)；8.00(d，2H)；8.05(br，3H)。MSm/z＝306[M+1]+4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺 步驟A使用4-乙?；郊姿岽姹郊柞；?，如關于(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁酰基氨基)己酸酰胺所述，制備了1.65g標題化合物。
1H-NMR(CDCl3)1.40(m，2H)；1.60(m，2H)；1.80(m，2H)；2.62(s，3H)；3.30(q，2H)；3.75(q，1H)；7.55(br，1H)；7.85(br，1H)；7.97(d，2H)；8.05(d，2H)；8.10(br，3H)；8.65(t，1H)。
S-苯甲酰甲基半胱氨酸酰胺氫氯化物步驟AS-苯甲酰甲基-N-Boc-半胱氨酸甲酯 在0℃，向N-Boc半胱氨酸甲酯(2.05ml，9.93mmol)在MeCN(20ml)中的溶液中，加入DIPEA(3.55ml，20.1mmol)、NaI(0.48g，3.20mmol)，然后加入苯甲酰甲基溴(2.41g，12.1mmol)在MeCN(4ml)中的溶液。在室溫攪拌混合物19小時。加入水(100ml)和1N含水HCl(30ml)，然后萃取產物(3×AcOEt)。用鹽水洗滌合并的萃取物，干燥(MgSO4)，并在減壓下濃縮，生成4.37g油。在-20℃，從AcOEt(約10ml)和庚烷(約40ml)中結晶過夜，生成3.49g(99％)標題甲基酯，呈棕色固體。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.37(s，9H)，2.74(dd，J＝9Hz，13Hz，1H)，2.89(dd，J＝5.5Hz，13Hz，1H)，3.62(s，3H)，4.03(d，J＝15Hz，1H)，4.14(d，J＝15Hz，1H)，4.22(m，1H)，7.33(brd，J＝8Hz，1H)，7.52(m，2H)，7.64(m，1H)，7.99(m，2H)。
步驟BS-苯甲酰甲基-N-Boc半胱氨酸酰胺 向S-苯甲酰甲基-N-Boc-半胱氨酸甲酯(1.77g，5.01mmol)在MeCN(30ml)中的溶液中，加入氨水(50ml，25％；12.5g NH3)。在室溫攪拌71小時后，通過TLC不能再檢測到起始材料。在減壓下濃縮混合物，將殘余物重新懸浮到甲苯和乙醇中，再次濃縮。用PhMe+EtOH反萃取。從冷的甲醇中結晶，生成0.86g(50％)標題酰胺。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.37(s，9H)，2.66(dd，J＝9Hz，13Hz，1H)，2.83(dd，J＝5.5Hz，13Hz，1H)，4.07(d，J＝15Hz，1H)，4.10(m，1H)，4.12(d，J＝15Hz，1H)，6.88(br d，J＝8Hz，7.12(br s，1H)，7.35(br s，1H)，7.52(t，J＝8Hz，2H)，7.64(m，1H)，7.96(m，2H)。
步驟CS-苯甲酰甲基半胱氨酸酰胺氫氯化物 將S-苯甲酰甲基-N-Boc半胱氨酸酰胺(0.70g，2.07mmol)與DCM(10ml)和TFA(20ml)混合。30分鐘后，濃縮混合物，將殘余物與甲苯和MeCN混合，并再次濃縮。將殘余物與1N HCl(1.5ml)、乙醇、MeCN和甲苯混合，并再次濃縮。將殘余物懸浮在沸騰的EtOH(約5ml)中。過濾并干燥，生成0.18g(32％)標題氫氯化物，呈淺棕色固體。LCMS只有一種產物(HPLC，210nm)，MH+＝221(產物-水)。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.93(dd，J＝7Hz，13Hz，1H)，3.06(dd，J＝6Hz，13Hz，1H)，3.97(m，1H)，4.33(br s，2H)，7.58(m，2H)，7.68(m，1H)，8.02(m，2H)，8.32(br s，3H)。
實施例44-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺
用二氯甲烷(50ml)溶漲Rink-酰胺-樹脂(裝載0.43mmol/g，6.66g，2.86mmol)。去除溶劑。加入哌啶在N-甲基吡咯烷酮中的20％溶液(50ml)。將反應器搖動20分鐘。去除液體。用N-甲基吡咯烷酮(3×50ml)和二氯甲烷(5×50ml)洗滌樹脂。相繼加入BOC-Lys(FMOC)-OH(5.37g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(50ml)中的溶液和1-羥基苯并三唑(1.75g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(20ml)中的溶液。加入二異丙基碳二亞胺(1.79ml，11.5mmol)和乙基二異丙基胺(1.96ml，11.5mmol)。將反應器在室溫搖動16小時。去除液體。用N-甲基吡咯烷酮(3×50ml)和二氯甲烷(3×50ml)洗滌樹脂。相繼加入4-乙?；郊姿?2.82g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(50ml)中的溶液和1-羥基苯并三唑(1.75g，11.5mmol)在N-甲基吡咯烷酮(20ml)中的溶液。加入二異丙基碳二亞胺(1.79ml，11.5mmol)和乙基二異丙基胺(1.96ml，11.5mmol)。將反應器在室溫搖動16小時。用N-甲基吡咯烷酮(3×50ml)和二氯甲烷(3×50ml)洗滌樹脂。將50％三氟乙酸和10％三異丙基硅烷在二氯甲烷(50ml)中的溶液加入樹脂。將反應容器在室溫搖動1小時。收集液體。真空去除溶劑。將殘余物重新溶解到甲苯(50ml)中。真空去除溶劑。
合并6輪上述過程的粗產物。通過在C18-反相柱上的HPLC-色譜法(使用3-23％乙腈在水中的梯度，在0.1％三氟乙酸緩沖液中)純化它們，得到1.07g 4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺的三氟乙酸鹽。
實施例51-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮 步驟14-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯 將甲苯磺酰氯(4.16g，21.8mmol)加入商購可得的4-(2-羥乙基)哌啶-1-碳環(huán)酯叔丁基酯(例如Aldrich 54，724-7，5.0g，21.8mmol)和三乙胺(4.25ml，30.5mmol)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌16小時。用乙酸乙酯(300ml)稀釋，并用硫酸氫鈉的10％水溶液(200ml)洗滌。用乙酸乙酯(150ml)萃取水相。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(250ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(80g)上的快速色譜法(使用乙酸乙酯/庚烷，首先1∶2然后1∶1，作為洗脫劑)，純化粗產物，生成6.04g 4-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)δ1.05(m，2H)；1.45(s，9H)；1.55(m，5H)；2.50(s，3H)；2.65(t，2H)；4.05(m，4H)；7.35(d，2H)；7.80(d，2H)。
步驟24-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯 在0℃，將氫化鈉(0.69g，17.2mmol)在礦物油中的60％懸浮液加入N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(2.80g，17.2mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。在0℃，攪拌反應混合物45分鐘。相繼加入4-[2-(甲苯-4-磺酰氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(5.99g，15.6mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(15ml)中的溶液和四丁基銨碘化物(0.17g，0.47mmol)。將反應混合物加熱至60℃ 2天，并冷卻至室溫。小心地加入水(5ml)。用乙酸乙酯(250ml)稀釋反應混合物，并用硫酸氫鈉的10％水溶液(200ml)洗滌。用乙酸乙酯(200ml)萃取水相。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(150ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(80g)上的快速色譜法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作為洗脫劑)，純化粗產物，生成4.36g 4-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)δ1.15(m，2H)；1.50(s，9H)；1.75(m，5H)；2.75(m，2H)；4.10(m，2H)；4.30(t，2H)；7.80(m，4H)。
步驟32-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)異吲哚-1，3-二酮
將三氟乙酸(20ml)加入4-[2-(1，3-二氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基氧基)乙基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(4.26g，11.4mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中。在室溫攪拌反應混合物50分鐘。真空去除溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(50ml)，真空去除溶劑。將后一步驟重復2次，生成6.46g粗制的2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)異吲哚-1，3-二酮的三氟乙酸鹽。
MSm/z＝275[M+1+]1H-NMR(DMSO-d6)δ1.30(m，2H)；1.65(m，2H)；1.90(m，3H)；2.90(q，2H)；3.30(d，2H)；4.20(t，2H)；7.90(s，4H)；8.30(br，1H)；8.65(br，1H)。
步驟42-[2-(1-(十六?；?哌啶-4-基)乙氧基]異吲哚-1，3-二酮 在0℃，將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(1.04g，5.44mmol)加入棕櫚酸(1.40g，5.44mmol)和3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三唑(0.89g，5.44mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)和二氯甲烷(20ml)中的溶液中。在0℃，攪拌反應混合物20分鐘。相繼加入2-(2-(哌啶-4-基)乙氧基)異吲哚-1，3-二酮的三氟乙酸鹽(2.11g，5.44mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液和乙基二異丙基胺(6.19ml，38.1mmol)。將反應混合物攪拌16小時，同時升溫至室溫。用乙酸乙酯(150ml)稀釋，并用硫酸氫鈉的10％水溶液(150ml)洗滌。用乙酸乙酯萃取水相。用水(50ml)和碳酸氫鈉的飽和水溶液(50ml)的混合物洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。通過在二氧化硅(40g)上的快速色譜法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作為洗脫劑)，純化粗產物，生成1.52g 2-[2-(1-(十六?；?哌啶-4-基)乙氧基]異吲哚-1，3-二酮。
MSm/z＝513[M+1+]1H-NMR(DMSO-d6)δ0.90(t，3H)；1.10(m，2H)；1.25(m，26H)；1.45(m，2H)；1.65(m，1H)；1.80(m，2H)；2.30(t，2H)；2.95(t，1H)；3.85(m，3H)；4.20(t，2H)；4.40(d，1H)；7.90(s，4H)。
步驟5將水合肼(0.14ml，2.96mmol)加入2-[2-(1-(十六酰基)哌啶-4-基)乙氧基]異吲哚-1，3-二酮(1.52g，2.96mmol)在乙醇(30ml)中的溶液中。將反應混合物加熱回流75分鐘，并冷卻至室溫。通過過濾去除形成的沉淀。真空去除濾液的溶劑。通過在二氧化硅(30g)上的快速色譜法(使用二氯甲烷/甲醇/25％氨水(100∶10∶1)的混合物作為洗脫劑)，純化粗產物，生成800mg 1-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮。
MSm/z＝383[M+1+]1H-NMR(CDCl3)δ0.80(t，3H)；1.25(m，2H)；1.60(m，26H)；1.70(m，4H)；1.65(m，3H)；2.708t，2H)；2.60(t，1H)；3.05(t，1H)；3.80(m，3H)；4.60(d，1H)。
實施例6
(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺 步驟1((S)-1-氨甲?；?3-炔基)氨基甲酸叔丁酯在0℃，將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(563mg，2.94mmol)加入商購可得的(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基戊-4-炔酸(例如Acros，626mg，2.94mmol)和1-羥基苯并三唑(397mg，2.94mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(20ml)中的溶液中。在0℃，將反應混合物攪拌20分鐘。加入25％的氨水(2.38ml)。將反應混合物攪拌16小時，同時升溫至室溫。用乙酸乙酯(150ml)稀釋，并用硫酸氫鈉的10％水溶液(150ml)洗滌。用乙酸乙酯萃取水相(2×100ml)。用鹽水(250ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。將殘余物溶于乙酸乙酯(100ml)，并用鹽水(75ml)和水(75ml)的混合物洗滌。用乙酸乙酯萃取水相(2×50ml)。合并的有機層經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(50g)上的快速色譜法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)作為洗脫劑)，純化粗產物，生成138mg((S)-1-氨甲?；?3-炔基)氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(CDCl3)δ1.40(s，9H)；2.15(t，1H)；2.70(m，1H)；2.90(m，1H)；4.40(m，1H)；5.70(d，1H)；6.50(br，1H)；6.90(br，1H)。
步驟2將三氟乙酸(3ml)加入((S)-1-氨甲?；?3-炔基)氨基甲酸叔丁酯(138mg，0.65mmol)在二氯甲烷(3ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌1.25小時。真空去除溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(40ml)，并真空去除溶劑。將后一步驟重復2次，生成粗制的(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺的三氟乙酸鹽，其用于下面的實驗。
MSm/z＝113[M+1+]1H-NMR(DMSO-d6)δ2.70(m，2H)；3.15(t，1H)；3.85(m，1H)；7.65(s，1H)；7.85(s，1H)；8.20(br，3H)。
實施例7(S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔酸酰胺 制備了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(0.348mg，100nmol)、(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺(2.26mg，10000nmol)的三氟乙酸鹽和羥丙基-β-環(huán)糊精(4mg)在250mM HEPES和5mM EDTA的緩沖液(0.085ml)(該緩沖液在使用前已經(jīng)調節(jié)至pH 7.5)、25％氨水和1N鹽酸(共0.011ml)中的溶液，其具有pH 7.96。加入CPY(1.0U)在水(0.005ml)中的溶液。將反應混合物置于室溫。40分鐘后，除了與[Leu37]GLP-1-(7-37)基丙氨酸、[Leu37]GLP-1-(7-37)肽和(S)-2-((S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔?；被鶀戊-4-炔酰基酰胺相對應的質量之外，可以在MALDI-TOF中發(fā)現(xiàn)與(S)-2-(([Leu37]GLP-1-(7-37)基)氨基)戊-4-炔酸酰胺相對應的質量。
MALDI-TOF(CHCA)m/z＝3508，3485，3604，3413。
實施例8(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺
步驟1[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯 將二碳酸二叔丁酯(15g，69mmol)加入酪氨酸酰胺的鹽酸鹽(15g，69mmol)在二烷(140ml)中的溶液和1N氫氧化鈉水溶液(140ml)中。將反應混合物在室溫攪拌16小時。用10％硫酸氫鈉水溶液(200ml)稀釋，并用乙酸乙酯(3×200ml)萃取。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(100ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(400g)上的快速色譜法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)的混合物)，純化粗產物，生成8.17g[(S)-1-氨甲?；?2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯。
MSm/z＝303(M+Na)+。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.31(s 9H)；2.80(dd，1H)；2.83(dd，1H)；4.00(m，1H)；6.62(d，2H)；6.70(d，1H)；6.97(br，1H)；7.03(d，2H)；7.31(br，1H)；9.14(s，1H)。
步驟2[(S)-1-氨甲?；?2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯 將[(S)-1-氨甲酰基-2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯(1.0g，3.57mmol)、四丁基銨碘化物(65mg，0.17mmol)、碳酸鉀(3.94g，29mmol)、炔丙基溴(0.38ml，4.28mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(15ml)的混合物加熱至60℃16小時。冷卻至室溫，用水(30ml)稀釋，并用10％硫酸氫鈉水溶液酸化。用乙酸乙酯(2×100ml)萃取混合物。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(200ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(100g)上的快速色譜法(使用二氯甲烷/甲醇(10∶1)的混合物作為洗脫劑)，純化粗產物，生成998mg[(S)-1-氨甲?；?2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯。
MSm/z＝341(M+Na)+。
1H-NMR (DMSO-d6)δ1.31(s，9H)；2.50(s，1H)；2.67(dd，1H)；2.91(dd，1H)；4.03(m，1H)；4.74(s，2H)；6.77(d，1H)；6.86(d，2H)；6.99(s，1H)，7.17(d，2H)；7.35(s，1H)。
將三氟乙酸(10ml)加入[(S)-1-氨甲?；?2-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)乙基]氨基甲酸叔丁酯(998mg，3.13mmol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌1.5小時。去除溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(30ml)。去除溶劑。將后一步驟重復2次，生成1.53g(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸鹽。
HPLC(方法02-B4-4)Rf＝5.62分鐘。
MSm/z＝219(M+1)+。
1H-NMR(CDCl3)δ2.51(s，1H)；3.02(m，2H)；3.90(m，1H)；4.78(s，2H)；6.95(d，2H)；7.20(d，2H)；7.56(s，1H)；7.87(s，1H)；8.10(br，3H)。
實施例9(S)-2-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)3-(4-(丙-2-炔基)苯基)丙酰胺 步驟1[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸通過標準的Fmoc-策略，從商購可得的Fmoc-Ala-Wang樹脂開始，在Applied Biosystems 433A肽合成儀上，制備了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸。使用了下面的氨基酸衍生物
偶聯(lián)編號 氨基酸衍生物1Fmoc-Leu-OH2Fmoc-Arg(Pmc)-OH3Fmoc-Gly-OH4Fmoc-Lys(Boc)-OH5Fmoc-Val-OH6Fmoc-Leu-OH7Fmoc-Trp(Boc)-OH8Fmoc-Ala-OH9Fmoc-Ile-OH10 Fmoc-Phe-OH11 Fmoc-Glu(OtBu)-OH12 Fmoc-Lys(Boc)-OH13 Fmoc-Ala-OH14 Fmoc-Ala-OH15 Fmoc-Gln(Trt)-OH16 Fmoc-Gly-OH17 Fmoc-Glu(OtBu)-OH18 Fmoc-Leu-OH19 Fmoc-Tyr(tBu)-OH20 Fmoc-Ser(tBu)-OH21 Fmoc-Ser(tBu)-OH22 Fmoc-Val-OH23 Fmoc-Asp(OtBu)-OH24 Fmoc-Ser(tBu)-OH25 Fmoc-Thr(tBu)-OH26 Fmoc-Phe-OH27 Fmoc-Thr(tBu)-OH28 Fmoc-Gly-OH29 Fmoc-Glu(OtBu)-OH30 Fmoc-Ala-OH31 Fmoc-His(Trt)-OH將三氟乙酸(10ml)、水(0.265ml)和三異丙基硅烷(0.265ml)的混合物加入樹脂。搖動1.5小時。收集液體。用三氟乙酸(1ml)洗滌樹脂。合并液體。在氮氣流下濃縮溶液。加入醚(40ml)。離心分離沉淀。使用在0.1％三氟乙酸緩沖液中的37-65％乙腈在水中的梯度作為洗脫劑，在反相C18-柱上通過HPLC，純化粗產物。
步驟2(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺與[Leu37]GLP-1(7-37)丙氨酸的CPY-反應使用1N氫氧化鈉水溶液，將[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(1mM終濃度)和(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸鹽(100mM終濃度)和羥丙基-β-環(huán)糊精(4mg)在由250mMHEPES和5mM EDTA組成的緩沖液中的混合物(0.100ml終體積)調節(jié)至pH 8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，200U/ml，0.005ml，1U)，得到需要的終體積和濃度。將混合物在室溫放置3小時。
MALDI-TOF(基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜)m/z＝3612((S)-2-([Leu 37]GLP-1(7-37)基氨基)3-(4-(丙-2-炔基)苯基)丙酰胺)，連同3412([Leu37]GLP-1肽)。
MS(電霧化)1205(M)3+。
實施例10(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺 步驟1[Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基(leucinyl)丙氨酸通過標準的Fmoc-策略，從商購可得的Fmoc-Ala-Wang樹脂開始，在Applied Biosystems 433A肽合成儀上，制備了[Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；彼?。使用了下面的氨基酸衍生物
偶聯(lián)編號 氨基酸衍生物1 Fmoc-Leu-OH2 Fmoc-Asp(OtBu)-OH3 Fmoc-Thr(tBu)-OH4 Fmoc-Ile-OH5 Fmoc-Lys(Boc)-OH6 Fmoc-Thr(tBu)-OH7 Fmoc-Gln(Trt)-OH8 Fmoc-Ile-OH9 Fmoc-Leu-OH10Fmoc-Trp(Boc)-OH11Fmoc-Asn(Trt)-OH12Fmoc-Ile-OH13Fmoc-Phe-OH14Fmoc-Asp(OtBu)-OH15Fmoc-Arg(Pmc)-OH16Fmoc-Ala-OH17Fmoc-Ala-OH18Fmoc-Leu-OH19Fmoc-Asn(Trt)-OH20Fmoc-Asp(OtBu)-OH21Fmoc-Leu-OH22Fmoc-Ile-OH23Fmoc-Thr(tBu)-OH24Fmoc-Asn(Trt)-OH25Fmoc-Leu-OH26Fmoc-Glu(OtBu)-OH27Fmoc-Asp(OtBu)-OH28Fmoc-Ser(tBu)-OH29Fmoc-Phe-OH30Fmoc-Ser(tBu)-OH31Fmoc-Gly-OH32Fmoc-Glu(OtBu)-OH33Fmoc-Ala-OH34Fmoc-His(Trt)-OH將三氟乙酸(10ml)、水(0.265ml)和三異丙基硅烷(0.265ml)的混合物加入樹脂。搖動1.5小時。收集液體。用三氟乙酸(1ml)洗滌樹脂。合并液體。在氮氣流下濃縮溶液。加入醚(40ml)。離心分離沉淀。使用在0.1％三氟乙酸緩沖液中的37-65％乙腈在水中的梯度作為洗脫劑，在反相C18-柱上通過HPLC，純化粗產物。
HPLC8.81分鐘(方法02-B4-4)。
MALDI-TOFm/z＝3946MSm/z＝1317.988，790。
步驟2(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺與(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨?；?丙氨酸的CPY-反應使用1N氫氧化鈉水溶液，將(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸(1mM終濃度)和(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸鹽(6mg，150mM終濃度)和羥丙基-β-環(huán)糊精(61mg)在由250mM HEPES和5mM EDTA組成的緩沖液中的混合物(1.5ml終體積)調節(jié)至pH8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，800U/ml，0.019ml，15U)，得到需要的終體積和濃度。將混合物在室溫放置3.5小時。用水將混合物稀釋至10ml的體積。使用C18-柱和39-67％乙腈在用0.1％三氟乙酸酸化的水中的梯度，通過HPLC-純化，分離產物，生成(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺。在214nm使用1500000的吸收系數(shù)，檢測到2.5mg的產量。
MALDI-TOF4073。
HPLC(系統(tǒng)02-b4-4)9.14分鐘。
MS(電霧化)m/z＝815，1120，1359。
實施例11(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺
步驟13-氯苯甲醛肟 將羥基胺氫氯化物(3.68g，53mmol)在水(5ml)中的溶液加入3-氯苯甲醛(5.00ml，44mmol)在乙醇(20ml)中的溶液中。加入氫氧化鈉(2.64g，66mmol)在水(5ml)中的溶液。將反應混合物在室溫攪拌48小時。將反應混合物置于水/冰(150ml)上。過濾分離出形成的沉淀，并溶于二氯甲烷(200ml)。該溶液經(jīng)硫酸鎂干燥。去除溶劑，生成3.88g 3-氯苯甲醛肟，其不經(jīng)進一步純化地使用。
步驟2將10％次氯酸鈉溶液(0.008ml)加入3-氯苯甲醛肟(4.2mg，0.027mmol)在水(0.5ml)中的懸浮液中。將溶液在室溫放置10分鐘。加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(1.1mg，0.00027mmol)和三乙胺(0.003ml)在水(0.5ml)中的溶液。將反應混合物在室溫放置16小時。在反相C18-HPLC上，使用在0.1％TFA緩沖液中的43-75％乙腈在水中的梯度，純化粗產物。
HPLC(方法02-b4-4)9.56分鐘。
MS(EI)m/z＝1410(M3+)，1054(M4+)和844(M5+)
實施例12(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺 步驟1[(S)-1-氨甲?；?2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯 將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(6.82g，35.5mmol)加入BOC-保護的酪氨酸(10.0g，35，5mmol)和1-羥基苯并三唑(5.44g，35.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)和二氯甲烷(10ml)的混合物中的溶液中。將反應混合物攪拌20分鐘。加入25％氨水。將反應混合物在室溫攪拌16小時。用乙酸乙酯(100ml)稀釋，并用水洗滌(3×100ml)，隨后用碳酸氫鈉的飽和水溶液(100ml)洗滌。經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成4.24g[(S)-1-氨甲?；?2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯。
1H-NMR(DMSO-d6)δ1.31(s 9H)；2.80(dd，1H)；2.83(dd，1H)；4.00(m，1H)；6.62(d，2H)；6.70(d，1H)；6.97(br，1H)；7.03(d，2H)；7.31(br，1H)；9.14(s，1H)。
步驟2{(S)-1-氨甲酰基-2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯 隨后向[(S)-1-氨甲?；?2-(4-羥基苯基)乙基]-氨基甲酸叔丁酯(3.00g，10.7mmol)和碳酸鉀(7.40g，53.5mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(50ml)的混合物中，加入氯丙酮(1.02ml，12.8mmol)和四丁基銨碘化物(197mg，0.54mmol)。將反應混合物加熱至90℃16小時，并冷卻至室溫。用水(100ml)稀釋，并用10％硫酸氫鈉溶液酸化至pH 2。加入乙酸乙酯(300ml)。分離相。用水(3×150ml)洗滌有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成2.65g{(S)-1-氨甲酰基-2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。
MSm/z＝359(M+Na+)1H-NMR(DMSO-d6)δ1.30(s，9H)；2.10(s，3H)；2.70(dd，1H)；2.90(dd，1H)；3.95(br，1H)；4.00(m，1H)；4.75(s，2H)；6.80(d，2H)；7.00(br，1H)；7.20(d，2H)；7.35(br，1H)。
步驟3將三氟乙酸(50ml)加入{(S)-1-氨甲?；?2-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(2.65g，7.88mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。在室溫攪拌反應混合物1小時。真空去除溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(50ml)，并真空去除溶劑。重復后一步驟一次。通過在HPLC上的C-18反相色譜法(使用在三氟乙酸緩沖液(0.1％)中的13-33％乙腈在水中的梯度)，純化粗產物，生成460mg(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺。
MSm/z＝237(M+)1H-NMR(DMSO-d6，TFA-鹽)δ2.20(s，3H)；2.80-3.10(m，2H)；3.90(m，1H)；4.80(s，2H)；6.90(d，2H)；7.20(d，2H)；7.55(br，1H)；7.90(br，1H)；8.10+(br，3H)。
實施例13(S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(2-氧代丙氧基)苯基)丙酰胺 將(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸(0.50mg，127pmol)在水(0.040ml)和1N氫氧化鈉水溶液(0.003ml)中的溶液，加入(S)-2-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺的三氟乙酸鹽(13.3mg，0.038mmol)在含有250mM HEPES和5mM EDTA的水性緩沖液中的溶液中，該緩沖液已經(jīng)用氫氧化鈉調節(jié)至pH8。用1N氫氧化鈉水溶液，將溶液調節(jié)至pH8。用含有250mM HEPES和5mM EDTA的水性緩沖液將溶液稀釋至0.127ml的終體積，該緩沖液已經(jīng)用氫氧化鈉調節(jié)至pH8。加入CPY在水中的溶液(0.005ml，1U)。將反應混合物在室溫放置16小時。MS分析表明，生成了具有所需質量的產物。
MALDI-TOFm/z＝4090.321MSm/z＝1365，1024HPLC(方法03-b6-1)30.69分鐘。
實施例14(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺 步驟1(([Glu3]GLP-2基)亮氨?；?丙氨酸從商購可得的Fmoc-Ala-Wang 樹脂開始，如關于(([Glu3，Leu10]GLP-2基)亮氨?；?丙氨酸所述，制備了(([Glu3]GLP-2基)亮氨?；?丙氨酸。使用了下面的氨基酸衍生物
偶聯(lián)編號 氨基酸衍生物1Fmoc-Leu-OH2Fmoc-Asp(OtBu)-OH3Fmoc-Thr(tBu)-OH4Fmoc-Ile-OH5Fmoc-Lys(Boc)-OH6Fmoc-Thr(tBu)-OH7Fmoc-Gln(Trt)-OH8Fmoc-Ile-OH9Fmoc-Leu-OH10 Fmoc-Trp(Boc)-OH11 Fmoc-Asn(Trt)-OH12 Fmoc-Ile-OH13 Fmoc-Phe-OH14 Fmoc-Asp(OtBu)-OH15 Fmoc-Arg(Pmc)-OH16 Fmoc-Ala-OH17 Fmoc-Ala-OH18 Fmoc-Leu-OH19 Fmoc-Asn(Trt)-OH20 Fmoc-Asp(OtBu)-OH21 Fmoc-Leu-OH22 Fmoc-Ile-OH23 Fmoc-Thr(tBu)-OH24 Fmoc-Asn(Trt)-OH25 Fmoc-Met-OH26 Fmoc-Glu(OtBu)-OH27 Fmoc-Asp(OtBu)-OH28 Fmoc-Ser(tBu)-OH29 Fmoc-Phe-OH30 Fmoc-Ser(tBu)-OH31 Fmoc-Gly-OH32 Fmoc-Glu(OtBu)-OH33 Fmoc-Ala-OH34 Fmoc-His(Trt)-OHHPLC8.60分鐘(方法02-B4-4)。
MALDI-TOFm/z＝3964.17。
步驟2(2s)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺與(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸的CPY-反應如本領域技術人員已知的，使用FMOC-策略，在ABI-433A 肽合成儀上，通過標準的固相肽合成，制備了(([Glu3]GLP-2基)亮氨酰基)丙氨酸。使用1N氫氧化鈉水溶液，將(([Glu3]GLP-2基)亮氨?；?丙氨酸(1mM終濃度)和(2s)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺的三氟乙酸鹽(28mg，150mM終濃度)和羥丙基-β-環(huán)糊精(284mg)在由250mM HEPES和5mM EDTA組成的緩沖液中的混合物(7ml終體積)調節(jié)至pH 8。加入羧肽酶Y的溶液(CPY，800U/ml，0.088ml，70U)，得到需要的終體積和濃度。將混合物在室溫放置100分鐘。用水將混合物稀釋至10ml的體積。通過HPLC-純化(使用C18-柱和36-75％乙腈在用0.1％三氟乙酸酸化的水中的梯度)，分離產物，生成(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺。在214nm使用1500000的吸收系數(shù)，檢測到了9.9mg的產量。
MALDI-TOF4096(M+)HPLC(系統(tǒng)02-b4-4)8.97分鐘MS(電霧化)m/z＝1366(M3+)，1024(M4+)，和819(M5+)。
實施例15(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺 將10％次氯酸鈉溶液(0.062ml)加入3-氯苯甲醛肟(32mg，0.205mmol)在水(4.2ml)中的懸浮液中。將混合物在室溫放置10分鐘，并加入(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺(8.4mg，0.0021mmol)和三乙胺(0.025ml)在水(4.7ml)中的溶液之中。將反應混合物在室溫放置16小時。在反相C18-HPLC上，使用在0.1％TFA緩沖液中的40-80％乙腈在水中的梯度，純化粗產物。在214nm使用1500000的吸收系數(shù)，檢測到了0.132mg的產量。
MALDI-TOF4244(M+)和4228(M-0+)HPLC(方法02-b4-4)9.41分鐘。
MS(EI)m/z＝1417(M3+)和1062(M4+)。
實施例163-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲?；?3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲?；?丙酸 步驟1(3-羥甲基芐基)氨基甲酸叔丁酯 在0℃，將氯甲酸乙酯(1.93ml，20mmol)加入3-(叔丁氧基羰基氨基甲基)苯甲酸(5.0g，20mmol)和三乙胺(3.33ml，24mmol)在四氫呋喃(30ml)中的溶液中。將反應混合物在0℃攪拌40分鐘，并濾出形成的沉淀。將濾液冷卻至0℃。加入2.0M硼氫化鋰在THF(25ml，50mmol)中的溶液。將反應混合物攪拌16小時，同時升溫至室溫。小心地加入水，直到?jīng)]有氣體形成。加入10％硫酸氫鈉溶液(10ml)。加入飽和的碳酸氫鈉溶液(200ml)。用乙酸乙酯(200和100ml)萃取混合物。合并的有機層經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(80g)上的快速色譜法(使用乙酸乙酯/庚烷1∶1作為洗脫劑)，純化粗產物，生成3.73g(3-羥甲基芐基)氨基甲酸叔丁酯。
MSm/z＝260(M+23+)1H-NMR(CDCl3)δ1.48(s，9H)；4.30(br，2H)；4.70(s，2H)；4.85(br，1H)；7.15-7.35(m，5H)。
步驟2(3-(氨基甲基)苯基)甲醇 將三氟乙酸(5ml)加入(3-羥甲基芐基)氨基甲酸叔丁酯(1.70g，7.17mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中。將反應混合物攪拌40分鐘。真空去除溶劑。將殘余物溶于二氯甲烷(40ml)。真空去除溶劑。將后一步驟重復2次。將殘余物溶于水(50ml)和1N氫氧化鈉水溶液(100ml)。用叔丁基甲基醚洗滌(3×100ml)。用氯化鈉飽和，并用二氯甲烷萃取(3×75ml)。合并的二氯甲烷-相經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成328mg粗制的(3-(氨基甲基)苯基)甲醇，其不經(jīng)純化地用于進一步的步驟。
1H-NMR(DMSO-d6)δ3.30(br，2H)；3.70(s，2H)；4.45(s，2H)；5.15(br，1H)；7.10-7.30(m，4H)。
步驟3N-(3-(羥甲基)芐基)琥珀酰胺酸叔丁酯 在0℃，將1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物(451mg，2.35mmol)加入琥珀酸一丁酯(410mg，2.35mmol)和3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(384mg，2.35mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)和二氯甲烷(5ml)的混合物中的溶液中。將反應混合物在0℃攪拌25分鐘。相繼加入粗制的(3-(氨基甲基)苯基)甲醇(340mg，2.48mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(5ml)中的溶液和乙基二異丙基胺(0.40ml，2.48mmol)。將反應混合物攪拌16小時，同時緩慢地升溫至室溫。用乙酸乙酯(150ml)稀釋，并用10％硫酸氫鈉水溶液(100ml)洗滌。用乙酸乙酯(50ml)萃取水相。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(150ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑。通過在二氧化硅(60g)上的快速色譜法(使用乙酸乙酯和庚烷(2∶1)的混合物作為洗脫劑)，純化粗產物，生成372mg N-(3-(羥甲基)芐基)琥珀酰胺酸叔丁酯。
MSm/z＝316(M+23+)1H-NMR(CDCl3)δ1.45(s，9H)；2.45(t，2H)；2.60(t，2H)；4.45(d，2H)；4.70(s，2H)；6.15(br，1H)；7.15-7.35(m，5H)。
步驟4N-(3-甲?；S基)琥珀酰胺酸叔丁酯
在-78℃，將草酰氯(0.142ml，1.63mmol)逐滴加入二甲亞砜(0.232ml。3.26mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中。將反應混合物在-78℃攪拌10分鐘。加入N-(3-(羥甲基)芐基)琥珀酰胺酸叔丁酯(372mg，1.55mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。將反應混合物在-78℃攪拌10分鐘。加入三乙胺(1.08ml，7.77mmol)。將反應混合物在-78℃攪拌5分鐘，然后加熱至室溫。在室溫攪拌40分鐘，并用乙酸乙酯(100ml)稀釋。用10％硫酸氫鈉水溶液(100ml)洗滌。用乙酸乙酯(2×50ml)萃取水相。用碳酸氫鈉的飽和水溶液(150ml)洗滌合并的有機層，并經(jīng)硫酸鎂干燥。去除溶劑，生成312mg粗制的N-(3-甲?；S基)琥珀酰胺酸叔丁酯，其不經(jīng)進一步純化地用于下一步驟。
MSm/z＝314(M+23+)1H-NMR(CDCl3)δ1.35(s，9H)；2.45(t，2H)；2.55(t，2H)；4.45(d，2H)；6.20(br，1H)；7.44(t，1H)；7.50(d，1H)；7.75(m，2H)；9.95(s，1H)。
步驟5N-[3-((羥基亞氨基)甲基)芐基]琥珀酰胺酸叔丁酯
將3.2M氫氧化鈉水溶液(0.5ml，1.60mmol)加入N-(3-甲?；S基)琥珀酰胺酸叔丁酯(312mg，1.07mmol)和羥基胺氫氯化物(89mg，1.29mmol)在乙醇(2.5ml)和水(0.5ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌3天。加入10％硫酸氫鈉水溶液(20ml)和水(50ml)。用乙酸乙酯(3×50ml)萃取混合物。合并的有機層經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成249mg粗制的N-[3-((羥基亞氨基)甲基)芐基]琥珀酰胺酸叔丁酯，其不經(jīng)進一步純化地用于下一步驟。
MSm/z＝329(M+23+)，307(M+1+)1H-NMR(DMSO-d6)δ1.35(s，9H)；2.40(m，4H)；4.30(d，2H)；7.25(d，1H)；7.35(t，1H)；7.50(m，2H)；8.10(s，1H)；8.40(t，1H)；11.20(s，1H)。
步驟6N-[3-(羥基亞氨基甲基)芐基]琥珀酰胺酸 將三氟乙酸(7ml)加入粗制的N-[3-((羥基亞氨基)甲基)芐基]琥珀酰胺酸叔丁酯(249mg，0.81mmol)在二氯甲烷(7ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌55分鐘。真空去除溶劑。將殘余物重新溶于二氯甲烷(50ml)。真空去除溶劑。將后一步驟重復2次，生成294mg粗制的N-[3-(羥基亞氨基甲基)芐基]琥珀酰胺酸，其不經(jīng)進一步純化地用于下一步驟。
MSm/z＝273(M+23+)，251(M+1+)1H-NMR(DMSO-d6)δ2.45(A2B2，4H)；4.30(d，2H)；7.20-7.50(m，4H)；8.10(s，1H)；8.40(t，1H)；11.20(br，1H)。
步驟7將10％次氯酸鈉水溶液(0.0015ml，2600pmol)加入粗制的N-[3-(羥基亞氨基甲基)芐基]琥珀酰胺酸(1.29mg，5150pmol)在水(0.11ml)和碳酸氫鈉的飽和水溶液(0.01ml)的混合物中的溶液中。將反應混合物在室溫放置10分鐘。加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(0.210mg，51pmol)和三乙胺(0.0006ml)在水(0.11ml)中的溶液。在室溫搖動反應混合物。1小時后，MALDI-TOF表現(xiàn)出少量的m/z＝4323，這與3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲?；?3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲酰基)丙酸的質量相對應，以及大量的m/z＝4076，這與(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨酰基氨基)-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的質量相對應。2小時后，LC-MS電霧化表現(xiàn)出m/z＝1442，1082，和866的質量，它們分別與3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲?；?3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲?；?丙酸的(M3+)，(M4+)和(M5+)相對應，以及m/z＝1359，1020，和816的質量，它們分別與(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的(M3+)，(M4+)和(M5+)相對應。8小時后，LC-MS電霧化表現(xiàn)出少量的m/z＝1442和1082的質量，它們分別與3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲?；?3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲?；?丙酸的(M3+)和(M4+)相對應，以及大量的m/z＝1360和1020的質量，它們分別與(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺的(M3+)和(M4+)相對應。
實施例1711-(4-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸和11-(5-(4-((2S)-2-氨甲酰基-2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸 步驟111-疊氮基十一酸甲酯 將疊氮化鈉(4.66g，72mmol)和四丁基銨碘化物(66mg，0.18mmol)相繼加入11-溴十一酸甲酯(在Aldrich商購可得，5.00g，17.9mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(50ml)中的溶液中。將反應混合物加熱至60℃16小時，并冷卻至室溫。用水(200ml)稀釋，并用乙酸乙酯(200ml)萃取。用水(2×200ml)洗滌水相。有機相經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成4.28g 11-疊氮基十一酸甲酯。
MSm/z＝264(M+23+)，214(M-N2+)步驟211-疊氮基十一酸 將壓碎的氫氧化鈉(709mg，17.7mmol)加入11-疊氮基十一酸甲酯(4.03g，17.7mmol)在甲醇(75ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌16小時。加入水(50ml)。通過加入10％硫酸氫鈉水溶液，將混合物酸化至pH 2，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥。真空去除溶劑。將殘余物溶于甲醇(50ml)。加入壓碎的氫氧化鈉(1.42g，35.4mmol)。將反應混合物在室溫攪拌16小時。加入水(50ml)。通過加入10％硫酸氫鈉水溶液，將混合物酸化至pH2，并用乙酸乙酯(3×50ml)萃取。合并的有機層經(jīng)硫酸鈉干燥。真空去除溶劑，生成3.13g 11-疊氮基十一酸。
MSm/z＝250(M+23+)，200(M-N2+)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.30(m，12H)；1.65(m，4H)；2.40(t，2H)；3.20(t，2H)；9.00-10.80(br，1H)。
步驟3
將11-疊氮基十一酸(0.116mg，510nmol)在乙腈(0.055ml)中的溶液，加入(2S)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2炔基氧基)苯基)丙酰胺(0.210mg，51nmol)和2，6-二甲基吡啶(0.0012ml，10200nmol)在水(0.105ml)中的溶液中。加入碘化銅(I)(0.001mg，5nmol)在乙腈(0.050ml)中的溶液。將反應混合物保持在室溫。4小時后，加入碘化銅(I)(0.098mg，500nmol)在乙腈中的溶液。將反應混合物在室溫保持16小時。加入2.5％氨水(0.200ml)。將反應混合物在室溫和室氣壓保持4小時。通過MS和MALDI-TOF發(fā)現(xiàn)的質量與關于就11-(4-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸和11-(5-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸發(fā)現(xiàn)的質量所作的預期一致。
HPLC9.43分鐘(方法02-B4-4)。
MSm/z＝1435，1077。
MALDI-TOF4303。
實施例1811-(4-(4-((S)-2-氨甲?；?2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸和11-(5-(4-((S)-2-氨甲?；?2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基氨基))苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸
將2，6-二甲基吡啶加入(2S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺(1.0mg，244pmol)在水(0.5ml)中的混合物中，生成澄清的溶液。相繼加入11-疊氮基十一酸(0.554mg，0.0025mmol)在乙腈(0.25ml)中的溶液和碘化銅(I)(0.467mg，0.0025mmol)在乙腈(0.25ml)中的溶液。將反應混合物在室溫放置16小時。在反相C18柱上，通過HPLC(使用在0.1％三氟乙酸緩沖液中的35-75％乙腈在水中的梯度)進行分級，生成約0.3mg11-(4-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸或11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸或其混合物。
HPLC9.27分鐘(方法02-B4-4)。
MSm/z＝1441.8，1081.3，865.2，721.2，618.9。
MALDI-TOFm/z＝4317實施例192-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲酰基)癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺和2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺 步驟111-疊氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯
將N，N，N’，N’-四甲基-O(N-琥珀酰亞氨基)鈾四氟硼酸鹽(1.32g，4.40mmol)加入11-疊氮基十一酸(1.00g，4.40mmol)和三乙胺(0.61ml，4.40mmol)在N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌2小時。用乙酸乙酯(50ml)稀釋，并用水(3×50ml)洗滌。有機相經(jīng)硫酸鎂干燥。真空去除溶劑，生成1.40g粗制的11-疊氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯，其不經(jīng)進一步純化地用于接下來的步驟。
MSm/z＝347[M+Na+]1H-NMR(CDCl3)δ1.35(m，12H)；1.60(quintett，2H)；1.75(quintett，2H)；2.60(t，2H)；1.85(m，4H)；3.25(t，2H)。
步驟211-疊氮基十一?；被鵰PEG20kDa 將11-疊氮基十一酸2，5-二氧代pyrroldin-1-基酯(227mg，0.7mmol)的溶液加入商購可得的 mPEG20000DA-胺 (Nektar 2M2U0P01，5.00g，0.25mmol)和三乙胺(0.174ml，1.25mmol)在二氯甲烷(50ml)中的溶液中。將反應混合物在室溫攪拌16小時。加入醚(800ml)。過濾分離形成的沉淀，并用醚(2×100ml)洗滌。真空干燥，生成4.58g11-疊氮基十一?；被鵰PEG20kDa。
步驟3將抗壞血酸(1.72mg，9766nmol)和2，6-二甲基吡啶(0.0024ml)在水(0.10ml)中的溶液，加入硫酸銅(II)五水合物(0.49mg，1954nmol)在水(0.1ml)中的溶液中。將該溶液在室溫保持5分鐘。將一部分得到的混合物(0.025ml)加入(S)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-炔丙基氧基苯基)丙酰胺(0.1mg，24nmol)、2，6-二甲基吡啶(0.0012ml)和11-疊氮基十一?；被鵰PEG20kDa(0.049mg，240nmo l)在水(0.075ml)中的溶液中。將反應混合物保持在室溫。24小時后，使用NuPAGE(Invitrogen)的10％Bis-Tirs凝膠的SDS-凝膠電泳和SilverXpress銀染色方法，證實了高分子肽的形成，這與關于2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺和2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺所作的預期一致。
實施例20N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲?；旎?-4-乙?；郊柞０?步驟1如實施例9所述，制備了[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸。
步驟2
CPY-催化的4-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺與[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸的轉肽作用向在含有5mM EDTA的HEPES緩沖液250mM pH8的溶液中的4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺(終濃度100mM)和羥丙基-β-環(huán)糊精(4％w/v終濃度)的混合物中，加入在含有5mMEDTA的HEPES緩沖液250mM pH8的溶液中的[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(1mM終濃度)。通過加入二異丙基乙基胺，將pH調節(jié)至8.1。通過加入在水溶液中的酶(10U/ml終濃度)，開始反應。
通過HPLC監(jiān)測反應。
HPLC方法柱Vydac C 18(218TP53)250×4.6A(NH4)2SO450mM，0.5％CH3CN，pH2.5BCH3CN/TFA 0.1％1.5ml/分鐘5-45％B，經(jīng)20分鐘在214nm檢測40C在30℃6小時30分鐘后，反應混合物的成分是約22％的剩余的起始化合物[Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸(保留時間18.1分鐘)、70％的轉肽作用產物(保留時間18.3分鐘)和8％的水解產物[Leu37]GLP-1(7-37)(保留時間18.4分鐘)。
MALDI-TOFm/z＝3684((S)-5-[Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲?；旎?4-乙?；郊柞０?，3482([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)，3411([Leu37]GLP-1(7-37))，和1162和1742([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)。
MS(電霧化)m/z＝1844和1229((S)-5-[Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲酰基戊基)4-乙?；郊柞０?，1139和1702([Leu37]GLP-1(7-37))，和1162和1742([Leu37]GLP-1(7-37)基丙氨酸)。
實施例21N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲?；旎?-4-[1-[2-(1-(十六?；?哌啶-4-基))乙氧基亞氨基]乙基]苯甲酰胺 向N-((S)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)-5-氨甲?；旎?-4-乙?；郊柞０吩诖姿猁}緩沖液50mM pH4中的溶液(終濃度0.3mM)中，加入在乙腈溶液中的1-[4-(2-(氨基氧基)乙基)哌啶-1-基]十六烷-1-酮(終濃度3mM)(最終乙腈濃度18％v/v)。在30℃進行反應，隨后HPLC。
HPLC方法柱Vydac C18(218TP 53)250×4.6AH2O/TFA 0.1％
BCH3CN/TFA 0.1％10％B進行5分鐘，然后10-91％B進行27分鐘1ml/分鐘40C在214和280nm檢測N-((S0)-5-([Leu37]GLP-1(7-37)基氨基)5-氨甲?；旎?-4-乙酰基苯甲酰胺的保留時間18.4分鐘，產物的保留時間26.5和27.1分鐘。
4小時反應時間后，得到了超過90％的收率。
MS(電霧化)m/z＝1351.4(calc1350.9)MALDI-TOFm/z＝4048(ca1c4049.8)。
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本發(fā)明包括適用法律允許的所附權利要求中所陳述的主題的所有改進和等同方案。
權利要求
1.制備綴合的肽的方法，所述的方法包含下述步驟i)在一個或多個步驟中，使肽與攜帶一個或多個在任何構成所述肽的氨基酸殘基中不可接近的官能團的第一種化合物反應，該反應在有能催化將所述的第一種化合物整合進所述肽的C-末端、形成轉?；碾牡拿复嬖诘那闆r下進行，和ii)在一個或多個步驟中，使所述的轉?；碾呐c包含一個或多個官能團的第二種化合物反應，其中所述的官能團不能與在構成所述肽的氨基酸殘基中的可接近的官能團反應，且其中所述的第二種化合物中的所述官能團能與所述的第一種化合物中的所述官能團反應，從而形成所述的轉酰化的肽和所述的第二種化合物之間的一個或多個共價鍵。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中在一個或多個步驟中，在有羧肽酶存在的情況下，使肽P與第一種化合物反應，后者是下式代表的α-氨基酸酰胺 ，形成下式的轉?；碾?所述的轉酰化的肽在一個或多個步驟中進一步與下式的第二種化合物反應Y-E-Z形成下式的綴合的肽 其中R代表著連接物或鍵；P’代表著從肽P去除C-末端氨基酸后得到的肽；X代表著包含一個或多個在構成肽P’的氨基酸殘基中不可接近的官能團的基團；Y代表著包含一個或多個官能團的基團，該官能團不與在構成肽P’的氨基酸殘基中可接近的官能團反應，且該基團能與存在于X中的所述官能團反應；E代表著連接物或鍵；其中A代表著由包含在X和Y中的官能團之間的反應形成的部分；且Z包含要綴合到肽上的部分，其中與P的清除相比，所述的部分能減少式[a]化合物的清除。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中A代表著肟，腙，苯腙，縮氨基脲或三唑部分。
4.根據(jù)權利要求2-3中的任一項的方法，其中存在于X中的官能團選自酮-，醛-，-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2，炔烴，腈-氧化物和疊氮化物。
5.根據(jù)權利要求2-4中的任一項的方法，其中存在于Y中的官能團選自酮-，醛-，-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2，炔烴、腈-氧化物和疊氮化物。
6.根據(jù)權利要求2-5中的任一項的方法，其中X選自酮-和醛-衍生物，且Y選自-NH-NH2，-O-C(O)-NH-NH2，-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-C(S)-NH-NH2，-NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(O)-NH-NH2，-NH-NH-C(S)-NH-NH2，-NH-C(O)-C6H4-NH-NH2，-C(O)-NH-NH2，-O-NH2，-C(O)-O-NH2，-NH-C(O)-O-NH2，-NH-C(S)-O-NH2。
7.根據(jù)權利要求2-5中的任一項的方法，其中X代表著炔烴，且Y代表著疊氮化物或腈-氧化物。
8.根據(jù)權利要求2-5中的任一項的方法，其中X代表著疊氮化物或腈-氧化物，且Y代表著疊氮化物。
9.根據(jù)權利要求2-8中的任一項的方法，其中R和E獨立地代表著直鏈的、分支的和/或環(huán)狀的C1-10烷烴、C2-10烯烴、C2-10炔烴、C1-10雜烷烴、C2-10雜烯烴、C2-10雜炔烴的雙基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基。
10.根據(jù)權利要求2-9中的任一項的方法，其中所述的α-氨基酸酰胺代表著選自下述的化合物2-氨基-3-氧代-丁酰胺，2-氨基-6-(4-氧代-戊?；被?-己酸酰胺，2-氨基-3-(2-氧代-2-苯基-乙基硫烷基)-丙酰胺，2-氨基-5-氧代-己酸酰胺，2-氨基-3-氧代-丙酰胺，2-氨基-6-(4-乙?；郊柞；被?己酸酰胺，2-氨基-3-氧代丙酸酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸酰胺，4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁?；被?己酸酰胺，3-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，2-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-3-(4-(丙-2-炔基氧基)苯基)丙酰胺，(S)-2-氨基戊-4-炔酸酰胺和S-苯基?；腚装彼狨０?。
11.根據(jù)權利要求2-10中的任一項的方法，其中Z包含一個或多個聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇基團和其氨基衍生物；直鏈的、分支的和/或環(huán)狀的C1-22烷基，C2-22烯基，C2-22炔基，C1-22雜烷基，C2-22雜烯基，C2-22雜炔基，其中可以插入一個或多個同素環(huán)芳族化合物雙基或雜環(huán)化合物雙基，且其中所述的C1-C22或C2-C22基團可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代羥基，鹵素，羧基和芳基，其中所述的芳基可以任選地被一個或多個選自下述的取代基進一步取代羥基，鹵素，和羧基；甾族化合物基團；脂類基團；多糖基團；葡聚糖基團；聚酰胺基團；聚氨基酸基團；PVP基團；PVA基團；聚(1-3-dioxalane)基團；聚(1，3，6-三烷)基團；乙烯/馬來酸酐聚合物基團；汽巴克隆染料基團；和汽巴克隆藍3GA基團。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中Z包含一個或多個分子量約10，20，30或40kDa的聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇基團。
13.根據(jù)權利要求11的方法，其中Z包含一個或多個C10-20烷基，其任選地被羧基取代。
14.根據(jù)權利要求11的方法，其中Z代表著十一酸基團。
15.根據(jù)權利要求11的方法，其中Z包含一個或多個C15烷基，C17烷基，汽巴克隆藍3GA或下式的基團
16.根據(jù)權利要求11的方法，其中Z包含一個或多個能結合白蛋白的部分。
17.根據(jù)權利要求1-16中的任一項的方法，其中酶是羧肽酶Y。
18.根據(jù)權利要求2-17中的任一項的方法，其中P代表著選自下述的肽胰島素化合物，GLP-1化合物，GLP-2化合物，生長激素化合物，細胞因子，TFF，黑皮質素受體修飾劑和因子VII化合物。
19.根據(jù)權利要求2-18中的任一項的方法，該方法另外包含將所述的綴合的肽配制進藥物組合物的步驟。
20.根據(jù)下式的綴合的肽 其中P’，R，A，E和Z如權利要求2-18所定義，且其中 通過肽鍵在P’的C-末端附著到P’。
21.根據(jù)權利要求20的肽，其選自Lysε(4-((2-(1-(mPEG羰基)哌啶-4-基)乙氧基)亞氨基)戊?；?192)hGH(1-192)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；(Lysε(4-((3-(棕櫚?；被?丙氧基)亞氨基)戊酰基)192)hGH(1-192)酰胺；(Lysε(4-((3-((2S)-2，6-mPEG羰基氨基)己?；被?丙氧基)亞氨基)戊?；?34)GLP-2(1-34)酰胺，其中mPEG具有20kDa的分子量；(Lysε(4-(1-(2-(3-(mPEG)丙?；被?肼基)乙基)苯甲酰基)192)hGH(1-92)酰胺，其中mPEG具有10kDa的分子量；(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺；(S)-3-(4-((3-(3-氯苯基)異唑-5-基)甲氧基)苯基)-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?丙酰胺；3-(3-(3-((4-((S)-2-氨甲酰基-3-([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基)甲基)異唑-3-基)芐基氨甲?；?丙酸；11-(4-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸；11-(5-(4-((2S)-2-氨甲?；?2-(([Glu3，Leu10]GLP-2基亮氨?；被?乙基)苯氧基甲基)-1，2，3-三唑基)十一酸11-(4-(4-((S)-2-氨甲?；?2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸；11-(5-(4-((S)-2-氨甲酰基-2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；被?)苯氧基甲基)-1H-1，2，3-三唑-1-基)十一酸；2-([Glu3]GLP-2基亮氨酰基)-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-4-基)甲氧基)苯基)丙酰胺；和2-([Glu3]GLP-2基亮氨?；?-3-(4-((1-((N-(mPeg20kDa基)氨甲?；?癸烷基)-1H-1，2，3-四唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
22.用于治療的根據(jù)權利要求20或21的化合物。
23.藥物組合物，其包含一種或多種根據(jù)權利要求20或21的肽。
24.根據(jù)式I的化合物 其中A和E獨立地代表C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；B和D代表著-C(O)-或-NH-，條件是，當B代表著-C(O)-時，則D必然代表著-NH-，且當B代表著-NH-時，則D必然代表著-C(O)-；且F代表著氫或C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基。
25.根據(jù)權利要求24的化合物，其選自(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-苯基丁?；被?己酸酰胺，4-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲酰基戊基)苯甲酰胺，(2S)-2-氨基-6-(4-氧代-4-(4-氯苯基丁?；被?己酸酰胺，3-乙酰基-N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺，和2-乙?；?N-((5S)-5-氨基-5-氨甲?；旎?苯甲酰胺。
26.根據(jù)式II的化合物 其中J和L獨立地代表C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；且M代表著氫或C1-6烷基。
27.根據(jù)式26的化合物，其選自(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丙氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代丁氧基)苯基]丙酰胺，(2S)-氨基-3-[4-(2-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺，和(2S)-氨基-3-[4-(4-氧代戊氧基)苯基]丙酰胺。
28.根據(jù)式III的化合物 其中Q代表著C1-6亞烷基，C2-6亞烯基，C2-6亞炔基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素，氨基，氰基和硝基；且T代表著氫或C1-6烷基。
29.根據(jù)式IV的化合物 其中J”和L”獨立地代表著C1-6亞烷基或亞芳基，它們都可以任選地被一個或多個選自下述的取代基取代鹵素氨基，氰基和硝基。
30.根據(jù)權利要求29的化合物，其選自(S)-2-氨基-3-(4-(炔丙基氧基)苯基)丙?；０?。
31.根據(jù)權利要求2-18中的任一項的方法可以得到的綴合的肽。
32.用于綴合第一種肽的方法，其中所述肽包含炔烴基團，該方法包含使所述的第一種肽與第二種化合物反應以形成綴合的肽，其中所述的第二種化合物包含腈-氧化物，其中所述的第一種肽通過異唑啉部分結合到所述的第二種化合物上。
33.用于綴合第一種肽的方法，其中所述肽包含腈-氧化物基團，該方法包含使所述的第一種肽與第二種化合物反應以形成綴合的肽，其中所述的第二種化合物包含炔烴，其中所述的第一種肽通過異唑啉部分結合到所述的第二種化合物上。
全文摘要
用于肽的選擇性綴合的方法，其包含在肽的C－末端酶促地整合官能團，然后與包含要綴合到肽上的基團的第二種化合物反應，其中所述的第二種化合物包含能與整合的官能團選擇性地反應的官能團。
文檔編號A61K38/00GK1863920SQ200480029592
公開日2006年11月15日 申請日期2004年10月8日 優(yōu)先權日2003年10月10日
發(fā)明者M·A·尊戴爾, B·派施克, F·Z·多瓦爾德, N·P·菲爾, N·L·約翰森, H·R·斯泰尼克 申請人:諾沃挪第克公司