專利名稱：一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素a對(duì)照品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸藥對(duì)照品試劑制備領(lǐng)域，具體涉及一種黃霉素預(yù)混劑中提取、純化黃霉素A對(duì)照品的方法。
背景技術(shù)：
黃霉素為磷酸化多糖類抗生素，具有抗菌作用機(jī)理，是通過干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)物質(zhì)肽聚糖的生物合成從而抑制細(xì)菌的繁殖，黃霉素的促生長(zhǎng)原理可能在他能提高飼料中能量和蛋白質(zhì)的消化，能使腸壁變薄，從而提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，能有效地持續(xù)腸道菌群的平衡和瘤胃PH值的穩(wěn)定。細(xì)菌對(duì)黃霉素不易產(chǎn)生耐藥性，黃霉素也不容易與其他抗生素產(chǎn)生交叉耐藥性。黃霉素主要包括黃霉素A、Bl、Ba和C等，其中黃霉素A為主要有效成分，占50%以上。黃霉素只用作飼料添加劑，不作為治療用藥，具有抗生素類添加劑的防病和促生長(zhǎng)等作用。黃霉素抗菌譜較窄，主要對(duì)革蘭氏陽性菌有效，且對(duì)其他抗生素耐藥性的革蘭氏陽性菌也有效，但對(duì)革蘭氏陰性菌作用很弱。對(duì)牛，豬、雞、兔都有促生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用。 美國(guó)FDA規(guī)定肉雞每噸飼料添加I 2g，火雞為每噸I 2g，豬為每噸2 4g。日本每噸雞飼料添加O. 5 5g，腐乳豬為5 10g，仔豬為I 10g?，F(xiàn)有黃霉素對(duì)照品為生物發(fā)酵法制備，黃霉素A純度不高，約50% 70%左右，含有黃霉素BI、Ba和C等副產(chǎn)物，不適用于黃霉素A殘留檢測(cè)使用。本發(fā)明從黃霉素預(yù)混劑中提取純化的黃霉素A對(duì)照品，純度高達(dá)93% 99%，雜質(zhì)少，步驟簡(jiǎn)便，成本低廉,主要應(yīng)用于黃霉素殘留檢測(cè)領(lǐng)域。黃霉素A對(duì)照品的用途，即本發(fā)明的推廣應(yīng)用前景持續(xù)使用抗生素所引起的畜產(chǎn)品抗生素殘留以及動(dòng)物和人類出現(xiàn)耐藥性問題已經(jīng)越來越為人們所重視。20世紀(jì)80年代以來，越來越多的國(guó)家立法禁止濫用抗生素。畜禽飼料中慎用抗生素原則和限制抗生素促進(jìn)生長(zhǎng)劑，必定是未來養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)。1997年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)要求停止或禁止抗生素飼料添加劑。1998年12月又提議在10年內(nèi)淘汰抗生素飼料添加劑。目前，聯(lián)合國(guó)FAO，WTO組織及發(fā)達(dá)國(guó)家特別規(guī)定人用抗生素不得用于動(dòng)物，對(duì)使用抗生素有極嚴(yán)格的要?dú)埾拗?，甚至完全不?zhǔn)使用。歐盟已經(jīng)決定從2006年I月起，禁止在飼料中使用莫能霉素 (monensin),鹽霉素(salinomycin),卑霉素(Avilamycin),黃霉素(Flavophospholipol) 等4種生長(zhǎng)促進(jìn)因子類抗生素，這意味著歐盟將會(huì)全面禁止在飼料中投放任何種類的抗生素。在日本肯定表制度中，黃霉素沒有規(guī)定畜禽肌肉及內(nèi)臟殘留限量，按照“一律標(biāo)準(zhǔn)”原則，即沒有規(guī)定殘留限量的化合物一律按10μ g/kg限量來執(zhí)行，黃霉素的殘留限量為10 μ g/kg。動(dòng)物源性食品中抗生素殘留的檢出，已成為世界肉類貿(mào)易中重要的技術(shù)指標(biāo)和技術(shù)壁壘之一。由于黃霉素在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)廣泛使用，歐盟、日本等國(guó)家對(duì)我國(guó)出口動(dòng)物產(chǎn)品的藥物殘留限制提出了更嚴(yán)格的要求，必將對(duì)我國(guó)動(dòng)物源性食品出口帶來了嚴(yán)重影響。為了突破抗生素殘留限制的技術(shù)壁壘，對(duì)畜禽產(chǎn)品中黃霉素殘留進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)控，制備高純度
4的黃霉素A對(duì)照品顯得非常必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從黃霉素預(yù)混劑中提取純化黃霉素A對(duì)照品的方法，利用該方法制備的黃霉素A純度達(dá)到93%以上。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法，包括如下步驟
(I)提取
以每mL甲醇與O. 4g黃霉素預(yù)混劑的比例混合二者并加入離心試管中，將離心試管置于超聲提取器中，超聲提取30min,每IOmin振蕩一次，8000轉(zhuǎn)/min下離心3min,將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；在殘?jiān)屑尤爰状及凑丈鲜霾襟E，重復(fù)提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到提取物。(2) SPE 純化
依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速為I 2mL/ min ;將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷與二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯與甲醇的混合溶液淋洗除雜；最后用6mL甲醇將黃霉素從固相萃取小柱中解析，將解析液于 40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到黃霉素純化產(chǎn)物；將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至稱量皿中，_75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產(chǎn)品。(3) HPLC 純化
稱取黃霉素A粗產(chǎn)品,用流動(dòng)相溶解并稀釋成2 10mg/mL,過O. 45mm濾膜,按下列條件分離純化，收集洗脫液。分離純化條件
色譜柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;
柱溫30°C ;
流動(dòng)相0. 2%甲酸銨乙腈，體積比為55:45 ；
流速1. OmL/min ；
進(jìn)樣量50 mL ；
檢驗(yàn)波長(zhǎng)258nm。(4)濃縮、干燥
將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈，得到濃縮液；控制流速I 2 mL/min，將濃縮液全部過C18固相萃取小柱；用IOmL超純水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，轉(zhuǎn)移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對(duì)照品。(5)純度鑒定
稱取一定量的黃霉素A對(duì)照品，用水溶解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定258nm下的吸光度， 計(jì)算黃霉素A的純度。本發(fā)明通過溶劑提取、固相萃取柱凈化、高效液相色譜純化、冷凍干燥的方式，代替了舊的生物發(fā)酵方法，使純化效果提高，可靠、穩(wěn)定。用本發(fā)明的方法制備的黃霉素A純度可達(dá)到93% 99%。本發(fā)明生產(chǎn)的黃霉素A對(duì)照品純度高，步驟簡(jiǎn)便，成本低廉，適用于黃霉素A殘留檢測(cè)領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。(I)提取
本實(shí)施例采用的是武漢同興生物科技有限公司生產(chǎn)的黃霉素預(yù)混劑，產(chǎn)品含量8%，規(guī)格為25千克/袋。稱取10 g黃霉素預(yù)混劑于50mL離心試管中，加入25mL甲醇,置于超聲提取器中，超聲提取30分鐘，每10分鐘振蕩一次；8000轉(zhuǎn)/min下離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至 250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，殘?jiān)性偌尤?5mL甲醇重復(fù)提取2次；合并提取液(即上清液)，40°C 水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。(2) SPE 純化
C18固相萃取小柱(500mg, 3mL)依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化,控制流速為I 2mL/min，將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL 5%甲醇溶液、4mL正己烷二氯甲烷(體積比I: l)、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯甲醇(體積比3:1)淋洗除雜，最后用3X2mL甲醇將黃霉素從固相萃取柱解析。將黃霉素解析液于40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到黃霉素純化產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物小心轉(zhuǎn)移至稱量皿中，-75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產(chǎn)品。其中所用試劑甲醇，乙酸乙酯，正己烷和二氯甲烷都選用色譜純級(jí)別的試劑。(3) HPLC 純化
稱取適量黃霉素A粗產(chǎn)品，用流動(dòng)相溶解并稀釋成約含量2 10mg/mL，過O. 45mm濾膜。按下列條件分離純化。為保證純度，從黃霉素A色譜峰達(dá)到檢測(cè)器20秒后開始收集洗脫液，完全通過檢測(cè)器后10秒結(jié)束收集。液相色譜分離條件
a)色譜柱AgelaTechnologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm,或相當(dāng)者；
b)柱溫30°C ；
c)流動(dòng)相0.2%甲酸銨(pH4. 9):乙腈(55 :45);乙腈試劑選用色譜純級(jí)別的；
d)流速1.O mL/min ；
e)進(jìn)樣量50mL ；
f)檢測(cè)波長(zhǎng)258nm。(4)濃縮、干燥
將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈；控制流速在I 2 mL/min下，將濃縮液全部過C18 固相萃取柱；用IOmL超純水淋洗C18柱；用IOmL甲醇解析黃霉素A，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，小心轉(zhuǎn)移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對(duì)照品。(5)純度鑒定
稱取一定量的黃霉素A對(duì)照品，用水溶解并定容至10mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定258nm下的吸光度，依據(jù)A258=21，357 Μ—1 cm—1計(jì)算溶液中黃霉素的物質(zhì)的量濃度，按式(I)計(jì)算黃霉素A對(duì)照品的純度。
Ax JW xFX =-二…；ζ—■ .................—.^ IQ V··································· (I)
X 21357 xL X1000
式中
X——黃霉素A的純度，單位為％ ；
A——258 nm處的吸光度；
M——黃霉素A的物質(zhì)的量1582，單位為克每摩爾(g/mol);
V-樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)；
m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)；
L——比色皿的長(zhǎng)度。本發(fā)明獲得的黃霉素A對(duì)照品性狀為淡黃色粉末，純度93%以上。
權(quán)利要求
1.一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法，包括如下步驟(1)提取以每mL甲醇與O. 4g黃霉素預(yù)混劑的比例混合二者并加入離心試管中，將離心試管置于超聲提取器中，超聲提取30min,每IOmin振蕩一次，8000轉(zhuǎn)/min下離心3min,將上清液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中；在殘?jiān)屑尤爰状及凑丈鲜霾襟E，重復(fù)提取2次；合并每次提取的上清液，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到提取物；(2)SPE純化依次用4mL乙酸乙酯、4mL甲醇和4mL水活化C18固相萃取小柱，控制流速為I 2mL/ min ;將提取物用IOmL超純水溶解，并全部加于固相萃取小柱上，并擠干柱床上的水分，依次用4mL5%甲醇溶液、4mL正己烷與二氯甲烷的混合溶液、4mL乙酸乙酯和6mL乙酸乙酯與甲醇的混合溶液淋洗除雜；最后用6mL甲醇將黃霉素從固相萃取小柱中解析，將解析液于 40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，得到黃霉素純化產(chǎn)物；將純化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至稱量皿中，_75°C真空冷凍干燥5h，即得黃褐色黃霉素A粗產(chǎn)品；(3)HPLC 純化稱取黃霉素A粗產(chǎn)品,用流動(dòng)相溶解并稀釋成2 10mg/mL,過O. 45mm濾膜,按下列條件分離純化，收集洗脫液；分離純化條件色譜柱Agela Technologies Venusil MP C18, 250 mm X 4· 6 mm, 5 mm;柱溫30°C ;流動(dòng)相0. 2%甲酸銨乙腈，體積比為55:45 ；流速1. OmL/min ；進(jìn)樣量50 mL ；檢驗(yàn)波長(zhǎng)258nm ；(4)濃縮、干燥將收集的洗脫液減壓濃縮去除乙腈，得到濃縮液；控制流速I 2 mL/min，將濃縮液全部過C18固相萃取小柱；用IOmL超純水淋洗C18固相萃取小柱；用IOmL甲醇解析C18固相萃取小柱，直至解析液中沒有黃霉素A ;將收集解析液在40°C水浴下氮吹儀濃縮至干，轉(zhuǎn)移至稱量皿后真空冷凍干燥，即得淡黃色的黃霉素A對(duì)照品；(5)純度鑒定稱取一定量的黃霉素A對(duì)照品，用水溶解，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定258nm下的吸光度， 計(jì)算黃霉素A的純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法， 其特征是步驟(2)中所述正己烷與二氯甲烷的混合溶液中二者的體積比為1:1 ;所述乙酸乙酯與甲醇的混合溶液中二者的體積比為3:1。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法， 其特征是步驟(3)中收集洗脫液應(yīng)在黃霉素A色譜峰達(dá)到檢測(cè)器20秒后開始，完全通過檢測(cè)器后10秒結(jié)束。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法，其特征是步驟(5)中黃霉素A的純度達(dá)到93% 99%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從黃霉素預(yù)混劑中提取、純化制備黃霉素A對(duì)照品的方法。該方法包括黃霉素的提取、濃縮、純化、干燥和純度鑒定方法。根據(jù)本發(fā)明制備的黃霉素A純度達(dá)到93%以上。本發(fā)明提供的黃霉素A對(duì)照品制備方法具有步驟簡(jiǎn)便，成本低廉和純度高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07H1/06GK102603817SQ20121002945
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者唐柏彬, 張雷, 李應(yīng)國(guó), 李賢良, 王國(guó)民, 郗存顯 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心